close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13282

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.06.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 13282
(13) C1
(19)
A 61K 31/13
A 61K 31/56
A 61P 31/00
СПОСОБ ПОДАВЛЕНИЯ РЕПРОДУКЦИИ ВИРУСА ГРИППА
В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК
(21) Номер заявки: a 20081012
(22) 2008.07.30
(43) 2010.04.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии
и микробиологии" (BY)
(72) Авторы: Бореко Евгений Иванович
(BY); Савинова Ольга Владимировна (BY); Павлова Наталья Ильинична (BY); Казакова Оксана Борисовна (RU)
(73) Патентообладатель: Государственное учреждение "Республиканский
научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии" (BY)
(56) BY 7601 С1, 2005.
BY 7809 C1, 2006.
SU 677298, 1981.
БОРЕКО Е.И. и др. Медицинские новости. - 1999. - № 3. - С.20-25.
БОРЕКО Е.И. и др. Вопросы вирусологии. - 1999. - Т. 44. - № 3. - С. 115119.
БОРЕКО Е.И. и др. Теория и практика
медицины. Вып. 2. - Минск, 2000. С. 28-29.
ЕРОПКИН М.Ю. и др. Экспериментальная и клиническая фармакология. 2007. - Т. 70. - № 5. - С. 33-37.
BY 13282 C1 2010.06.30
(57)
Способ подавления репродукции вируса гриппа в культуре клеток, отличающийся
тем, что на монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в среде 199
ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3-оксим бетулоновой кислоты в концентрации до 100 мкг/мл.
Изобретение относится к области медицины, в частности вирусологии, и может быть
использовано для подавления размножения вирусов гриппа и редукции вызываемых ими
заболеваний.
Известен способ подавления репродукции вируса гриппа с использованием 3-оксима
бетулоновой кислоты [1]. Недостатком способа является относительно невысокая противовирусная активность.
Более интенсивное снижение репродукции вируса гриппа может быть достигнуто с
использованием ремантадина [2-4]. Недостатком такого способа ингибирования вируса в
отдельных случаях также является сниженная активность [4].
Задачей изобретения является расширение ассортимента средств, обладающих противовирусным действием.
Поставленная задача достигается в способе подавления репродукции вируса гриппа в
культуре клеток. На монослой инфицированных вирусом клеток наносят разведенные в
среде 199 ремантадин в концентрации до 12,5 мкг/мл и 3-оксим бетулоновой кислоты в
концентрации до 100 мкг/мл.
BY 13282 C1 2010.06.30
Авторами обнаружено неочевидное свойство, позволяющее применить 3-оксим бетулоновой кислоты и ремантадин для увеличения противовирусного действия.
Сущность изобретения иллюстрируется примерами.
Пример 1.
Токсическое действие 3-оксима бетулоновой кислоты для культуры клеток.
Токсические свойства определяют по способности вызывать цитодеструктивные изменения клеток спустя 72 ч инкубации. Монослойные культуры клеток первичнотрипсинизированных фибробластов эмбрионов кур (ФЭК) отмывают от ростовой среды и
наносят разведения 3-оксима бетулоновой кислоты на среде поддержки (среда 199) с концентрацией 800 мкг/мл и менее. 3-Оксим бетулоновой кислоты предварительно растворяют в 10 % этаноле (маточный раствор). По истечении указанного срока неокрашенные
культуры просматривают при малом увеличении микроскопа (объектив ×10). Максимальной переносимой концентрацией (МПК) принимают наивысшую концентрацию вещества,
не вызывающую указанных изменений. Устанавливают, что в диапазоне концентраций от
400 мкг/мл и более низких 3-оксим бетулоновой кислоты не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток.
Пример 2.
Токсическое действие ремантадина для культуры клеток.
Исследование, описанное в примере 1, выполняют с ремантадином. Устанавливают,
что в диапазоне концентраций от 12,5 мкг/мл и более низких ремантадин не обладает способностью вызывать цитодеструкцию клеток.
Пример 3.
Противовирусное действие 3-оксим бетулоновой кислоты. Исследование проводят методом редукции количества бляшек под агаровым покрытием. Монослойную культуру
ФЭК, выращенную во флаконах, отмывают от ростовой среды, инфицируют различными
разведениями вируса гриппа A/Rostock/34 (H7N1) в пределах 0,01-0,00001 БОЕ/клетка путем нанесения вируссодержащей суспензии в объеме 0,1 мл на 1 ч при 37 °С. Затем жидкость удаляют и клетки покрывают расплавом питательного покрытия на основе
концентрата среды 199 с добавлением 1 % бактагара и 0,005 % нейтрального красного (все
реактивы Sigma) и различных концентраций исследуемого соединения. 3-Оксим бетулоновой кислоты предварительно растворяют в 10 % этаноле (маточный раствор). После застывания покрытия флаконы помещают в термостат на 36 ч и затем подсчитывают
количество бляшек, видимых благодаря присутствию в покрытии витального красителя.
На основе количества бляшек вычисляют титр вируса. Критерием противовирусного действия считают наличие различий в сравнении с контролем вируса. Вычисляют также концентрацию 50 % подавления размножения вируса (среднеэффективная концентрация,
ЕС50) и отношение МПК к EC50.
Полученные результаты приведены в таблице. EC50 3-оксим бетулоновой кислоты составляет 4,9 (6,5÷3,6) мкг/мл, отношение МПК/EC50 - 82.
Пример 4.
Противовирусное действие ремантадина. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с ремантадином. Полученные результаты приведены в таблице. EC50 ремантадина составляет 0,003 (0,01÷0,0009) мкг/мл, отношение МПК/EC50 – 4 167.
Пример 5.
Противовирусное действие 3-оксим бетулоновой кислоты и ремантадина при совместном использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными
концентрациями 3-оксим бетулоновой кислоты и 0,1 мкг/мл ремантадина. Полученные
результаты приведены в таблице. ЕС50 3-оксим бетулоновой кислоты в присутствии ремантадина составляет 1,1 (1,5÷0,9) мкг/мл, отношение МПК/EC50 - 364.
2
BY 13282 C1 2010.06.30
Пример 6.
Противовирусное действие ремантадина и 3-оксим бетулоновой кислоты при совместном использовании. Исследование, описанное в примере 3, выполняют с различными
концентрациями ремантадина и 3,0 мкг/мл 3-оксим бетулоновой кислоты. Полученные
результаты приведены в таблице. EC50 ремантадина в присутствии 3-оксим бетулоновой
кислоты составляет 0,0015 (0,003÷0,0008) мкг/мл, отношение МПК/EC50 - 8 333.
Подавление репродукции вируса гриппа в культуре клеток ФЭК в присутствии
3-оксим бетулоновой кислоты (I), ремантадина (Re) и их сочетаний
Титр
Разность с конШифр Концентрация,
EC50(I95),
вируса ± Sx, lg
тролем, lg
МПК/EC50
вещества
мкг/мл
мкг/мл
БОЕ/мл
БОЕ/мл
100
<4,0
>2,35
50
<4,0
>2,35
25
5,06±0,05
1,29
4,9
I
82
12,5
5,43±0,02
0,92
(6,5÷3,6)
6,25
5,77±0,12
0,58
3,0
6,23±0,11
0,12
0
6,35±0,04
12,5
6,45±0,03
0,25
6,25
5,99±0,12
0,71
3,12
5,9±0,12
0,8
1,5
5,48±0,1
1,22
0,003
0,78
5,42±0,02
1,28
Re
4 167
0,39
5,42±0,16
1,28
(0,01÷0,0009)
0,19
5,44±0,03
1,26
0,1
5,23±0,07
1,47
0,01
6,16±0,09
0,54
0
6,7±0,02
100
<4,0
>2,34
50
<4,0
>2,34
25
<4,0
>2,34
12,5
<4,0
>2,34
1,1
I + Re 0,1
364
6,25
<4,0
>2,34
(1,5÷0,9)
3,0
5,33±0,03
1,01
1,5
5,87±0,08
0,47
0,78
6,20±0,05
0,14
0
6,34±0,04
12,5
<4,0
>2,7
6,25
<4,0
>2,7
3,12
<4,0
>2,7
1,5
<4,0
>2,7
0,0015
0,78
4,98±0,17
1,72
Re + I 3,0
8 333
0,39
5,15±0,06
1,55
(0,003÷0,0008)
0,19
5,38±0,1
1,32
0,1
5,72±0,06
0,98
0,01
6,11±0,09
0,59
0
6,7±0,02
-
3
BY 13282 C1 2010.06.30
Таким образом, заявляемое решение позволяет решить поставленную задачу. При совместном использовании 3-оксим бетулоновой кислоты и ремантадина удается получить
увеличение ингибирования репродукции вируса гриппа в культуре клеток в сравнении с
индивидуальным применением веществ. При оценке по среднеэффективной концентрации
или по отношению МПК/EC50 активность 3-оксим бетулоновой кислоты увеличивается в
4,4 раза, ремантадина - в 2 раза. Значение фракционального индекса ингибирования
(ФИИ), рассчитанное по формуле: ФИИ = EC50 в-ва "А" в комбинации/EC50 в-ва "А" в отдельности + EC50 в-ва "Б" в комбинации/EC50 в-ва "Б" в отдельности [5], составляет 0,72.
Оно свидетельствует о синергизме комбинированного использования препаратов.
Заявляемое решение может быть непосредственно в настоящий момент использовано
в исследовательской лабораторной практике для подавления репродукции вируса гриппа и
редукции вызываемых им заболеваний.
Информационные источники:
1. Патент РБ 7811, С 07J 53/00, 63/00, А 61Р 31/16, 2003.
2. Патент США 3,352,912, МПК C 07D 295/00; C 07D 295/03; C 07C 49/00; C 07C
49/323.
3. Патент США 3,592,934, МПК C 07D 295/03; C 07D 295/00.
4. Бореко Е.И., Павлова Н.И. Амантадин и ремантадин в профилактике и лечении
гриппа // Медицинские новости. - 1999. - № 3(47). - С. 20-25.
5. Janz С., Wigand R. Combined interaction of antiherpes substances and interferon beta on
the multiplication of herpes simplex virus // Arch. Virol.- 1982. - Vol. 73. - P. 135-143.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
89 Кб
Теги
by13282, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа