close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13343

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 13343
(13) C1
(19)
(46) 2010.06.30
(12)
(51) МПК (2009)
C 12N 1/21
C 12N 9/00
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI БИМ В-458 ПРОДУЦЕНТ ЛИЗИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗЫ
(54)
(21) Номер заявки: a 20081119
(22) 2008.08.27
(43) 2010.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Бурко Дина Васильевна;
Квач Сергей Вячеславович; Зинченко Анатолий Иванович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) БУРКО Д.В. и др. Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты. Сборник научных
трудов. Т. 1.- Минск, 2007.- С. 109-117.
КВАЧ С.В. и др. Известия Национальной академии наук Беларуси. Серия биологических наук, 2006.- № 5.- С. 82-84.
NAKAMURA Y. et al. Biochimie.1992.- V. 74.- No. 6.- P. 581-584.
WRIGHT M. et al. FEBS J., 2006.- V. 273.No. 15.- P. 3534-3544.
BY 13343 C1 2010.06.30
(57)
Штамм бактерий Escherichia coli БИМ В-458 - продуцент лизил-тРНК-синтетазы.
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой новый штамм Escherichia coli БИМ В-458Д - продуцент лизил-тРНК-синтетазы, которая способна трансформировать аденозин-5'-трифосфат (ATP) в диаденозинтетрафосфат (Ap4A)
формулы
NH2
NH2
N
N
N
N
O
N
O
O P O P
O
O
P
N
O
O
P
N
N
O
O
HO
OH
O
O
O
O
O
OH
OH
Указанное соединение является биологически активным и может быть использовано в
медицине для профилактики и лечения тромбозов, контролируемой гипотензии, ускорения заживления ран [1-3].
BY 13343 C1 2010.06.30
Известны штаммы бактерий Escherichia coli K-12 и Bacillus stearothermophilus UK788
[4], Escherichia coli XA103 [5], Bacillus stearothermophilus NCA-1503 [6], продуцирующие
аминоацил-тРНК-синтетазы и применяемые для ферментативного получения Ap4A.
Общим недостатком перечисленных штаммов является низкая активность в отношении аминоацил-тРНК-синтетаз, так как они получены стандартными методами микробиологической селекции и их клетки содержат одну копию гена, кодирующего ту или иную
аминоацил-тРНК-синтетазу.
Известен рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli TG2(pXLys5), продуцирующий лизил-тРНК-синтетазу и использующийся для получения Ap4A [7]. Данные по
активности штамма в отношении рекомбинантной лизил-тРНК-синтетазы (в ед. активности/мл культуральной жидкости, мг белка или биомассы клеток) в работе не приведены.
Продуцирующая способность штамма (количество Ap4A, которое можно получить, затратив 1 г клеточной биомассы или 1 л культуральной жидкости) при использовании для
получения Ap4A составляет 0,376 г продукта/г клеток или 3,4 г продукта/л культуральной
жидкости.
Недостаток указанного штамма состоит в его относительно низкой продуцирующей
способности при использовании для получения Ap4A.
Из известных штаммов-продуцентов лизил-тРНК-синтетазы, применяемых для биокаталитического получения Ap4A, наиболее близким по эффективности к предлагаемому
штамму является штамм Escherichia coli lysU2 [8] (прототип). Активность лизил-тРНКсинтетазы в ультразвуковом лизате клеток штамма-прототипа составляет 42,4 ед./г бактериальных клеток или 159,4 ед./л культуральной жидкости.
При использовании штамма-прототипа для получения Ap4A в ультразвуковой лизат
клеток вносят сульфат аммония (50 % насыщения), образовавшийся осадок лизил-тРНКсинтетазы подвергают сорбционной хроматографии на колонке с кальций-тартратным гелем и гельфильтрации на колонке с гелем Toyopearl HW-55.
Продуктивность штамма-прототипа в реакции синтеза Ap4A из ATP составляет 0,64 г
Ар4А/г клеток или 2,4 г Ар4А/л культуральной жидкости.
Штамм-прототип получен трансформацией Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной
плазмидой pET24b+, в которую встроен ген lysU, кодирующий аминокислотную последовательность стресс-индуцибельного изофермента лизил-тРНК-синтетазы Escherichia coli.
Недостатком штамма-прототипа является сравнительно невысокая активность лизилтРНК-синтетазы и продуцирующая способность в отношении синтеза Ap4A.
Задачей предлагаемого изобретения является получение нового штамма бактерий Escherichia coli LysU-12 - более продуктивного штамма-продуцента лизил-тРНК-синтетазы с
повышенной продуцирующей способностью его клеток в отношении синтеза Ap4A из ATP.
Источником структурного гена lysU, кодирующего аминокислотную последовательность лизил-тРНК-синтетазы, служила хромосомная ДНК штамма бактерий Escherichia
coli DH5α. ДНК выделили с помощью фенол-хлороформного метода с дополнительной
очисткой при помощи цетавлона. Ген lysU синтезировали с помощью ПЦР, используя GoTaq-полимеразу (Promega, США) и синтетические олигонуклеотидные праймеры:
CGGGATCCGTCTGAACAAGAAACACGGGGAGCCAATG и GACTAGAAGCTTTTATTTCTGTGGGCGCATCGCCG. Продукты амплификации разделили путем электрофореза в 1 %-ном агарозном геле. Продукт, соответствующий гену lysU, выделяли и
лигировали в вектор pRsetB (Novagen, США), рестрицированный по BamHI- и HindIIIсайтам и обработанный щелочной фосфатазой.
Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Escherichia
coli DH5α, полученные стандартным кальциевым методом [9], с последующим высевом
на плотную питательную среду LB (1 % триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 1 % NaCl),
содержащую ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Из пяти выросших одиночных колоний выделили плазмиды, которые анализировали на наличие вставки гена lysU методом
2
BY 13343 C1 2010.06.30
ПЦР, используя праймер к Т7-промотору TAATACGACTCACTATAGGG, входящему в
состав плазмиды pRsetB, и праймер к гену lysU - GACTAGAAGCTTTTATTTCTGTGGGCGCATCGCCG. Колонии, содержащие плазмиду pRsetB со вставкой гена lysU,
перенесли в колбы, содержащие 25 мл среды LB с ампициллином, и культивировали 12 ч.
Из полученных биомасс выделили плазмиды стандартным щелочным методом [9]. В результате была получена плазмида (названная pRsetBLysUHis), несущая ген lysU в правильной ориентации. Путем последующей трансформации плазмидой pRsetBLysUHis
клеток Escherichia coli BL21(DE3) был получен рекомбинантный штамм Escherichia coli
LysU-12 с повышенной дозой гена lysU.
От штамма-прототипа штамм Escherichia coli LysU-12 отличается тем, что в составе
вектора pRsetBLysUHis структурная часть гена лизил-тРНК-синтетазы удлинена на 6 гистидиновых кодонов. Такая структура вектора позволяет существенно упростить процедуру очистки фермента с помощью металло-аффинной хроматографии (на никельсодержащих сорбентах).
Штамм Escherichia coli LysU-12 депонирован в Белорусской коллекции непатогенных
микроорганизмов ГНУ "Институт микробиологии HAH Беларуси" под коллекционным
номером БИМ В-458Д и характеризуется следующими свойствами.
Генотип.
F--, dcm, ompT, hsdS(rB-mB-), gal, (LambdaDE3) [9]. Клетки содержат плазмиду pRsetB
со встроенным геном lysU, кодирующим лизил-тРНК-синтетазу, в рамке считывания которого расположены дополнительные нуклеотиды, и геном bla, детерминирующим устойчивость клеток к ампициллину.
Морфологические признаки.
Клетки - прямые палочки размером (1,1-1,5)×(2,0-6,0) мкм; подвижные, перитрихальное жгутикование; грамотрицательные.
На МПА и агаризованной среде Адамса (30 °С, 3 сут) колонии гладкие, слабо выпуклые, легко сливающиеся. Цвет колоний желтый. Поверхность блестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые.
Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства.
Растет на простых питательных средах, содержащих ампициллин в количестве 25100 мкг/мл.
Диапазон температуры роста бактерий 8-40 °С с оптимумом 37 °С. рН-оптимум роста
находится в зоне 7,2-7,4. Факультативный анаэроб.
Клетки Escherichia coli LysU-12 могут в качестве единственного источника углерода
использовать ацетат, но не цитрат. Глюкоза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата, который затем превращается в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Индолположительны, не образуют H2S на железо-сахарной среде, не сбраживают
лактозу и малонат, не гидролизуют желатин.
На бульоне Хоттингера к 24 ч (30 °С) рост бактерий выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается
при встряхивании (S-форма).
Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 200 мкг/мл).
Содержание Г+Ц в составе ДНК 55,4±0,4 мол. % (определено оптическим методом).
Клетки Escherichia coli LysU-12 сохраняют жизнеспособность не менее полугода при
хранении в холодильнике (4-6 °С) на полноценной агаризованной среде (мясо-пептонный
бульон, среда Хоттингера), содержащей ампициллин (100 мкг/мл), под слоем вазелинового масла, а также в лиофилизированном (криопротектор - 10 %-ное обезжиренное молоко)
состоянии.
Клетки Escherichia coli LysU-12 продуцируют рекомбинантную лизил-тРНК-синтетазу
и благодаря этому обладают способностью катализировать синтез Ap4A из ATP. Фермен-
3
BY 13343 C1 2010.06.30
тативная активность ультразвукового лизата клеток, измеренная в реакции синтеза Ap4A,
составляет 106,6 ед./г или 458,3 ед./л культуральной жидкости.
Продуцирующая способность штамма в реакции синтеза Ap4A из ATP составляет 1,5 г
Ар4А/г клеток или 6,1 г Ар4А/л культуральной жидкости.
Для культивирования Escherichia coli LysU-12 применяют питательную среду LB (рН
7,0), приготовленную на дистиллированной воде, следующего состава (%):
триптон ("Sigma" США) - 1,0;
дрожжевой экстракт ("Sigma" США) - 0,5;
NaCl - 1,0.
Ампициллин - 100 мкг/мл.
Культивирование проводят до оптической плотности 0,6 (λ = 600 нм), затем индуцируют синтез белка путем внесения изопропил-β-D-тиогалактопиранозида до концентрации 1 мМ и продолжают культивирование в течение последующих 5 ч.
Изменение биомассы бактерий контролируют турбодиметрически (λ = 600 нм), используя соответствующую калибровочную кривую. По окончании культивирования клетки осаждают центрифугированием при 8 000 g в течение 10 мин и дважды отмывают от
питательной среды с помощью 0,15 M NaCl.
Для определения активности штамма в отношении лизил-тРНК-синтетазы 30 %-ную
суспензию клеток, содержащую 0,15 M NaCl, обрабатывают ультразвуком при мощности
0,5 кВт в течение 3-5 мин при температуре 2-4 °С. Остатки разрушенных клеток отделяют
центрифугированием в течение 10 мин при 8000 g.
Реакционную смесь (1 мл), содержащую (мМ): хлорид магния - 10, хлорид цинка 0,16, буфер MOPS-KOH (рН 7,5) [10] - 20, ATP - 4,3, L-лизин - 2,4, 0,5 ед. пирофосфатазы
(Serva, Германия) и 1 мкл лизата клеток, инкубируют при 37 °С при перемешивании на
магнитной мешалке. Ход реакции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии в системе: диоксан-вода-25 %-ный аммиак (6:4:1). За единицу активности фермента
принимают такое его количество, которое обеспечивает образование Ap4A в количестве 1
мкмоль за 1 мин.
Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался в качестве
продуцента лизил-тРНК-синтетазы и для получения Ap4A.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1. Культивирование Escherichia coli LysU-12.
Культивирование Escherichia coli LysU-12 проводят в 4-х колбах Эрленмейера объемом 250 мл, содержащих по 50 мл питательной среды, на термостатируемой биологической качалке с частотой колебания платформы 170-190 об/мин при температуре 37 °С.
Питательная среда приготовляется на дистиллированной воде и имеет следующий состав
(%): триптон ("Sigma" США) -1,0; дрожжевой экстракт ("Sigma" США) - 0,5; NaCl - 1,0
(рН 7,0). Стерилизацию среды осуществляют горячим паром под давлением в режиме 0,5
атм, 15 мин. После стерилизации в среду вносят ампициллин до концентрации 100 мкг/мл.
В процессе культивирования проводят измерение оптической плотности культуры при
λ = 600 нм. При достижении оптической плотности 0,6-1 в среду вносится стерильный
изопропил-β-D-тиогалактопиранозид до концентрации 1 мМ и культивирование продолжается в течение последующих 5 ч. По окончании выращивания клетки осаждают центрифугированием при 8 000 g в течение 10 мин и дважды отмывают от питательной среды
0,15 M раствором NaCl. Получают клеточную биомассу в количестве 4,3 г.
Лизил-тРНК-синтетазная активность выращенной культуры составляет 106,6 ед./г клеток или 458,3 ед./л культуральной жидкости.
Пример 2. Использование штамма Escherichia coli LysU-12 для получения Ap4A.
1,0 г клеток, полученных как в примере 1, суспендируют в 2,5 мл буфера, содержащем
50 мМ NaH2PO4, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол (рН 8,0), и разрушают ультразвуком на
дезинтеграторе микроорганизмов UDM-10 (Techpan, Польша) при мощности 0,5 кВт в те4
BY 13343 C1 2010.06.30
чение 5 мин при 4 °С. После центрифугирования образца в течение 30 мин при 20000 g из
полученного супернатанта выделяют лизил-тРНК-синтетазу, используя одностадийную
аффинную хроматографию на смоле Ni-NTA (Qiagen, США) по методике фирмыпроизводителя [11].
Полученную лизил-тРНК-синтетазу вносят в реакционную смесь (конечный объем 1,0
л), содержащую (мМ): хлорид магния - 10, хлорид цинка - 0,16, буфер MOPS-KOH (рН
7,5) - 20, ATP - 4,3, L-лизин - 2,4, 250 ед. пирофосфатазы, и инкубируют при 37 °С в течение 3,5 ч. В этих условиях выход реакции достигает 95 % от теоретически возможного.
Целевой продукт выделяют из реакционной смеси путем хроматографии на колонке со
смолой DE-32 (Whatman, Англия) с использованием линейного градиента бикарбоната
аммония (РЕАХИМ, Украина) (100 до 400 мМ). Элюат выпаривают досуха на роторном
испарителе при 55 °С. Осадок промывают охлажденным спиртом и высушивают под вакуумом. Получают 1,5 г хроматографически чистого Ap4A. Таким образом, выход изолированного целевого продукта в расчете на исходный ATP составляет 80 % от теоретически
возможного.
Элементный состав, хроматографическая подвижность при хроматографировании на
тонкослойных пластинках "Sorbfil" фирмы Сорбиополимер (Россия) в системе растворителей диоксан-вода-25 % аммиак (6:4:1), а также параметры УФ- и ПМР-спектров целевого продукта совпадали с соответствующими характеристиками заведомо известного
образца - Ap4A (Sigma, США).
Продуцирующая способность штамма Escherichia coli LysU-12 в сравнении с другими
штаммами микроорганизмов представлена в таблице.
Сравнение продуцирующей способности предлагаемого и известных рекомбинантных штаммов микроорганизмов, применяющихся для получения Ap4A
Штамм микроорганизмов Ар4А-продуцирующая способность штамма
г Ap4A/г клеток г Ар4А/л культуральной
жидкости
Escherichia coli LysU-12
1,5
6,1
Источник информации
Предлагаемое
техническое
решение
[8]
[7]
Escherichia coli lysU2
0,64
2,4
Escherichia coli
0,38
3,4
TG2(pXLys5)
Escherichia coli
-*
-*
[12]
JM101Tr(pXLys5)
Escherichia coli
-*
-*
[13]
PAL3103SKTR(pXLys5)
Escherichia coli
-*
-*
[14]
655cN(pBR322/EcoTyrTS)
Escherichia coli
-*
-*
[14]
655cN(pBR322/BstTyrTS)
*- данные отсутствуют.
Из данных таблицы следует, что Ар4А-продуцирующая способность штамма Escherichia coli LysU-12 значительно выше любого из известных штаммов, применяющихся
для получения этого продукта.
Таким образом, получен штамм, обладающий по сравнению со штаммом-прототипом:
значительно более высокой активностью лизил-тРНК-синтетазы, выраженной как в ед.
акт./г клеток (106,6 против 42,4), так и в ед. акт./л культуральной жидкости (458,3 против
159,4);
5
BY 13343 C1 2010.06.30
повышенной продуцирующей способностью при использовании для получения Ap4A 1,5 г Ap4A/г клеточной биомассы (против 0,64) и 6,1 г Ap4A/л культуральной жидкости
(против 2,4);
более простой процедурой использования для получения Ap4A.
Источники информации:
1. Патент США 5049550, МПК А61К 031/70, 1991.
2. Kikuta Y., Ohiwa E., Okada K., Watanabe A., Haruki S. Clinical application of diadenosine tetraphosphate (Ap4A:F-1500) for controlled hypotension // Acta Anaesthesiol. Scand.1999.- Vol. 43.- P. 82-86.
3. Pintor J., Bautista A., Carracedo G., Peral A. UTP and diadenosine tetraphosphate accelerate
wound healing in the rabbit cornea // Ophthal. Physiol. Opt.- 2004.- Vol. 24.- No. 3.- P. 186-193.
4. Патент США 4886749, МПК C12P 19/00, 1989.
5. Leveque F., Gazeau M., Fromant M., Blanquet S., Plateau P. Control of Escherichia coli
lysyl-tRNA synthetase expression by anaerobiosis // J. Bacteriol.- 1991.- Vol. 173.- No. 24.- P.
7903-7910.
6. Kitabatake S., Dombou U., Tomioka I., Nakajima H. Synthesis of P1,P4-di(adenosine 5'-)
tetraphosphate by leucyl-tRNA synthetase, coupled with ATP regeneration // Biochem. Biophys.
Res. Commun.- 1987.- Vol. 146.- No. 1.- P. 173-178.
7. Theoclitou M., Wittung E., Hindley A., El-Thaher T., Miller A. Characterisation of stress
protein LysU. Enzymic synthesis of diadenosine 5',5'"-P1, P4-tetraphosphate (Ap4A) analogues
by LysU // J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1.- 1996.- No. 16.- P. 2009-2019.
8. Бурко Д.В., Квач С.В., Зинченко А.И. Применение генно-инженерной лизил-тРНКсинтетазы Escherichia coli в реакции синтеза диаденозин-5',5"'-Р1,Р4-тетрафосфата. Микробная биотехнология: фундаментальные и прикладные аспекты: Сб. науч. тр. Т. 1 / Под
ред. Э.И. Коломиец и А.Г. Лобанка. - Минск: Новапринт, 2007. - С. 109-117.
9. Sambrook J., Frittsch E., Maniatis Т. Molecular cloning: a laboratory manual / 2-nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 2222 p.
10. Досон P., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика. 3-е изд.- M.:
Мир, 1991.- 361 с.
11. http://kirschner.med.harvard.edu/files/protocols/QIAGEN_QIAexpressionist_EN. pdf /
A handbook for high-level expression and purification of 6xHis-tagged protein.
12. Brevet A., Chen J., Leveque F., Plateau P., Blanquet S. In vivo synthesis of adenylylated
bis(5'-nucleosidyl) tetraphosphates (Ap4N) by Escherichia coli aminoacyl-tRNA synthetases //
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989.- Vol. 86.- No. 21.- P. 8275-8279.
13. Brevet A., Chen J., Leveque F., Blanquet S., Plateau P. Comparison of the enzymatic
properties of the two Escherichia coli lysyl-tRNA synthetase species // J. Biol. Chem.- 1995.Vol. 270.- No. 24.- P. 14439-14444.
14. Barker D.G. Cloning and amplified expression of the tyrosyl-tRNA synthetase genes of
Bacillus stearothermophilus and Escherichia coli // Eur. J. Biochem.- 1982.- Vol. 125.- No. 2.- P.
357-360.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
6
Размер файла
112 Кб
Теги
by13343, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа