close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13409

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.08.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 21/64
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОЛАТОВ
(21) Номер заявки: a 20070018
(22) 2007.01.10
(43) 2008.08.30
(71) Заявители: Государственное научное
учреждение "Институт биофизики и
клеточной инженерии Национальной
академии наук Беларуси"; Учреждение образования "Международный государственный экологический
университет имени А.Д.Сахарова"
(BY)
(72) Авторы: Воробей Александр Васильевич; Воробей Павел Александрович; Пинчук Сергей Владимирович
(BY)
(73) Патентообладатели: Государственное
научное учреждение "Институт биофизики и клеточной инженерии
Национальной академии наук Беларуси"; Учреждение образования
"Международный государственный
экологический университет имени
А.Д.Сахарова" (BY)
BY 13409 C1 2010.08.30
BY (11) 13409
(13) C1
(19)
(56) LAPA R.A.S. et al. Analytica Chimica
Acta, 1997. - V. 351. - P. 223-228.
ВОРОБЕЙ П.А. и др. Материалы международного симпозиума “Активные формы кислорода, азота и хлора в регуляции
клеточных функций в норме и при патологии”, часть 1, Гродно, 2006, - С. 39-43.
Экспериментальная витаминология
(справочное руководство). Минск, Наука
и техника, 1979. - С. 371-376.
VOROBEI P. et al. Photochemistry and
Photobiology, 2006. - V. 82. - P. 817-822.
ТЕЛЕГИНА Т.А. и др. Прикладная биохимия и микробиология, 2005. - Т. 41. № 3. - С. 315-323.
КРИЦКИЙ М.С. и др. Доклады Академии наук, 2001. - Т. 380. - № 3. С. 408-410.
ВОРОБЕЙ П.А. и др. Материалы международной конференции “Медико-биологические аспекты действия физических факторов”, Минск, “Бизнесофсет”,
2006. - С. 64-66.
BY a20050254, 2006.
(57)
Способ количественного определения фолатов, включающий фоторазрушение фолатов
в анализируемой пробе, измерение интенсивности флуоресценции образующихся фотопродуктов и определение концентрации фолатов по калибровочному графику зависимости
интенсивности флуоресценции фотопродуктов от концентрации фолатов в пробе, отличающийся тем, что для фоторазрушения фолатов используют фотосенсибилизируемое
воздействие.
Изобретение относится к химической, биологической и пищевой технологиям, медицине и ветеринарии, в частности к количественному определению фолатов, и может быть
использовано для экспрессного количественного определения фолатов в растворах, культуральных средах, продуктах питания и биологических жидкостях.
Фолаты являются водорастворимыми витаминами. Для контроля их содержания в организме человека и животных, в продуктах питания, а также в ряде технологических процессов
требуются высокочувствительные экспрессные способы количественного определения
BY 13409 C1 2010.08.30
различных форм фолатов, включая используемую в качестве витаминной добавки синтетическую форму - фолиевую кислоту (ФК).
Известен способ количественного определения фолатов путем выращивания микроорганизмов, требующих для своего роста фолаты, на содержащей анализируемую пробу
среде с последующим определением скорости роста микроорганизмов [1]. Однако этот
способ характеризуется длительным временем проведения анализа и низкой точностью.
Известен способ количественного определения фолатов путем их связывания антителами [2] или фолат-связывающими белками [3] с последующим определением числа связавшихся молекул (радиоиммунологический анализ, иммуноферментный анализ, иммунофлуоресцентный анализ, иммунохемилюминесцентный анализ и анализ с использованием
поверхностного плазмонного резонанса). Однако различная специфичность антител и фолатсвязывающих белков к разным формам фолатов затрудняет применение этого способа для
определения общего содержания нескольких форм фолатов, присутствующих в анализируемой пробе.
Известен способ количественного определения фолатов путем фотометрии или флуориметрии фолатов или продуктов их взаимодействия со специфическими химическими
реагентами [4], в том числе после хроматографического разделения различных форм фолатов в анализируемой пробе [5]. Однако этот способ характеризуется низкой чувствительностью.
Наиболее близким, принятым за прототип, является фотохимический способ количественного определения фолатов путем их разрушения при поглощении ими УФ-излучения
с последующей флуориметрией образующихся фотопродуктов [6]. Данный способ имеет
ряд недостатков: в пробах с концентрацией фолатов менее 0,5 мг/л и/или содержащих
белки, ароматические аминокислоты, антиоксиданты и ряд других соединений скорость
фоторазрушения фолатов является весьма низкой, что ведет к значительному увеличению
времени проведения анализа и/или снижению чувствительности. Нелинейная зависимость
количества образуемых фотопродуктов от дозы облучения снижает точность анализа. Использование для разрушения фолатов УФ-излучения затрудняет анализ биологических
проб, как правило, содержащих поглощающие УФ-излучение соединения. В связи со значительными различиями в спектрах поглощения различных форм фолатов для их фоторазрушения необходимо использовать УФ-излучение с различной длиной волны, что
усложняет систему для облучения и ограничивает возможность анализа проб, содержащих
различные формы фолатов.
Задачей изобретения является повышение чувствительности, сокращение времени
проведения анализа, увеличение точности и обеспечение возможности проведения анализа проб, содержащих различные формы фолатов, в том числе в присутствии других биологических молекул.
Поставленная задача в способе количественного определения фолатов достигается путем их фоторазрушения в анализируемой пробе, измерения интенсивности флуоресценции
образующихся фотопродуктов и определения концентрации фолатов по калибровочному
графику зависимости интенсивности флуоресценции фотопродуктов от концентрации фолатов в пробе. Согласно изобретению, для фоторазрушения фолатов используют фотосенсибилизируемое воздействие.
Отличительным признаком изобретения является использование фотосенсибилизируемого воздействия для фоторазрушения фолатов. Для чего в анализируемую пробу вводят
краситель-фотосенсибилизатор, поглощающий излучение в видимой области спектра и
сенсибилизирующий фоторазрушение фолатов с образованием флуоресцирующих фотопродуктов. По интенсивности флуоресценции фотопродуктов определяют концентрацию
фолатов в пробе. Такое определение возможно вследствие того, что фотосенсибилизируемое воздействие вызывает разрыв связи C9-N10 в молекулах различных форм фолатов с
образованием флуоресцирующих фотопродуктов, в частности птеринов [7], имеющих высокий квантовый выход флуоресценции.
2
BY 13409 C1 2010.08.30
Использование фотосенсибилизируемого воздействия для разрушения фолатов с образованием флуоресцирующих фотопродуктов позволяет значительно сократить время проведения анализа и увеличить чувствительность способа, что дает возможность определять
содержание фолатов в пробах с низкой их концентрацией, содержащих белки, ароматические аминокислоты, антиоксиданты и другие соединения, т.к. скорость фотосенсибилизированного разрушения фолатов в таких пробах значительно выше, чем скорость
фоторазрушения при поглощении ими УФ-излучения; повысить точность анализа, поскольку количество образуемых фотопродуктов линейно зависит от дозы облучения;
обеспечить возможность анализа проб, содержащих поглощающие УФ-излучение соединения; упростить систему для облучения и увеличить точность определения суммарного
содержания фолатов в пробах, содержащих различные их формы.
Способ осуществляют следующим образом: к анализируемой пробе добавляют краситель-фотосенсибилизатор, способный при поглощении излучения в видимой области
спектра генерировать радикалы и активные формы кислорода, вызывающие разрушение
молекул фолатов. Образцы освещают поглощаемым фотосенсибилизатором светом, после
чего измеряют интенсивность флуоресценции образовавшихся в них продуктов фотосенсибилизированного разрушения фолатов. По калибровочному графику определяют концентрацию фолатов в пробе. Построение калибровочного графика осуществляют путем
измерения интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения фолатов в пробах с известным составом и концентрацией фолатов.
На фиг. 1 представлена зависимость интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения ФК при λвозб. = 350 нм и λрег. = 445 нм от концентрации ФК
в культуральной среде RPMI-1640 (R 1145) после освещения в течение 3 мин в присутствии фотосенсибилизатора 5,10,15,20-мезо-тетра(4-N-метил-пиридил)порфина (ТМРуР) в
концентрации 2 мкМ. Растворы, содержащие ФК, разводили в 20 раз в дистиллированной
воде, вводили ТМРуР, помещали в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см и
освещали поглощаемым ТМРуР видимым светом люминесцентных ламп Philips TLK
40W/03 (плотность мощности - 110 Вт/м2).
На фиг. 2 представлена зависимость интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения ФК при λвозб. = 350 нм и λрег. = 445 нм от времени
освещения водного раствора ФК (4,5 мг/л) в присутствии фотосенсибилизатора 5,10,15,20тетрафенил-21Н,23Н-порфинтетрасульфоната (TPPS4) в концентрации 10 мкМ. Раствор
помещали в кварцевую кювету с длиной оптического пути 1 см и освещали поглощаемым
TPPS4 видимым светом галогеновой лампы KGM (плотность мощности - 150 Вт/м2).
Фиг. 1 демонстрирует линейную зависимость интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения ФК птериновой природы с характерными
длинами волн возбуждения (350 нм) и флуоресценции (445 нм) от концентрации ФК в
пробе в диапазоне 0,01-0,70 мг/л. Линейная зависимость от концентрации ФК наблюдается также и при регистрации интенсивности флуоресценции образуемых при фотосенсибилизированном разрушении ФК-ρ-аминобензоилглутаматов в облученной пробе.
Фиг. 2 демонстрирует линейную зависимость интенсивности флуоресценции продуктов фотосенсибилизированного разрушения ФК от времени освещения пробы до 45 мин. Такая зависимость повышает точность и экспрессность получения результата по сравнению
с экспоненциальной зависимостью при фоторазрушении ФК под действием УФ излучения
[8].
Достоинствами предлагаемого способа являются высокая чувствительность (до 0,01
мг/л по сравнению с 0,1 мг/л в прототипе) и короткое время проведения анализа (время
освещения пробы не превышает 10 мин при возможности одновременного освещения
большого количества проб).
3
BY 13409 C1 2010.08.30
Источники информации:
l. O'Broin S.D., Kelleher B.P., Davoren A., Gunter E.W. Field study screenin of blood folate
concentrations: specimen stability and finger stick sampling. Am. J. Clin. Nutr. 66, 1997. P. 1398-1405.
2. Caselunghe M.B., Lindeberg J. Biosensor-based determination of folic acid in fortified
food. Food Chemistry 70, 2000. - P. 523-532.
3. Finglas P.M., Kwiatkowska C, Faulks R.M., Morgan M.R.A. Comparison of a nonisotopic, microtitration plate folate-binding protein assay and a microbiological method for the determination of folate in raw and cooked vegetables. Journal of Micronutrient Analysis 4, 1998. P. 309-322.
4. Nagaraja P., Vasantha R.A., Yathirajan H.S. Spectrophotometric determination of folic
acid in pharmaceutical preparations by coupling reactions with iminodibenzyl or 3-aminophenol
or sodium molybdate-pyrocatechol. Analytical Biochemistry 307, 2002. - P. 316-321.
5. Lucock M.D., Green M., Priestnall M., Daskalakis I., Levene M.I., Hartley R. Optimisation of chromatographic conditions for the determination of folates in foods and biological tissues for nutritional and clinical work. Food Chemistry 53, 1995. - P. 329-338.
6. Lapa R.A.S., Lima J.L.F.C., Reis B.F.; Santos J.L.M.; Zagatto E.A.G. Photochemicalfluorimetric determination of folic acid in a multicommutated flow system. Analytica Chimica
Acta 351, 1997. - P. 223-228.
7. Steindal A.E., Juzeniene A., Johnsson A., Moan J. Photodegradation of 5-methyltetrahydrofolate. Photochem. Photobiol. in press, 2006.
8. Vorobey P., Steindal A.E., Off M.K., Vorobey A., Moan J. Influence of human serum albumin on photodegradation of folic acid in solution. Photochem. Photobiol. 82, 2006. - P. 817-22.
Фиг. 1
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
155 Кб
Теги
by13409, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа