close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13560

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.08.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 13560
(13) C1
(19)
A 61K 39/395
C 07K 16/18
A 61P 7/00
СРЕДСТВО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ ВЫРАБОТКИ ФАКТОРА VIII
СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ
(21) Номер заявки: a 20070980
(22) 2006.01.23
(31) 2005102119 (32) 2005.01.25 (33) RU
(85) 2007.08.25
(86) PCT/RU2006/000024, 2006.01.23
(87) WO 2006/080867, 2006.08.03
(43) 2008.02.28
(71) Заявитель: Бизяев Алексей Вячеславович (RU)
(72) Авторы: СЕЛИВАНОВ, Евгений Алексеевич; ГОНЧАР, Владимир Александрович; КРАВЕЦ, Василий Николаевич; РУГАЛЬ, Виктор Иванович
(RU)
(73) Патентообладатель: Бизяев Алексей
Вячеславович (RU)
(56) КАЛАШНИКОВА Л.А. и др. Клиническая медицина.- 2003.- Т. 81.- № 9.С. 42-45.
BY 13560 C1 2010.08.30
(57)
Средство для стимуляции выработки фактора VIII свертывания крови у больного гемофилией A, содержащее ксеногенные поликлональные иммуноглобулины класса G с молекулярной массой 150 кДа к антигенам эндотелиальных и мезенхимальных стволовых
клеток, полученных из костного мозга донора.
Изобретение относится к медицине, в частности к лекарственным препаратам, содержащим антитела, а именно иммуноглобулины. Оно может быть использовано при лечении
гемофилии А, обусловленной недостаточной выработкой или отсутствием выработки
фактора VIII в организме больного.
Гемофилия А - это наследственное заболевание, обусловленное дефицитом или, реже,
наследственной молекулярной аномалией фактора VIII свертывания крови. По данным
2003 [Van Dame et al. Haemophilia.- № 1.- P. 94-103], она встречается примерно в одном
случае на 5000 лиц мужского пола и характеризуется спонтанными кровоизлияниями в
мягкие ткани и суставы, которые вызывают тяжелые геморрагические осложнения, такие
как гемартрозы, гемомиазиты и т.п. Гемофилия сопровождается также снижением иммунитета к вирусным и бактериальным инфекциям. Тяжесть осложнений строго коррелирует
со степенью дефицита фактора VIII в плазме больного. У здорового человека концентрация фактора VIII в плазме крови составляет 150 нг/мл. Различают три степени тяжести гемофилии А в зависимости от концентрации фактора VIII: легкая - при концентрации
BY 13560 C1 2010.08.30
фактора VIII 5-25 % от нормы, средней тяжести - при концентрации фактора VIII 1-4 % от
нормы и тяжелая - при концентрации фактора VIII менее 1 % от нормы.
Известно [Нильссон И.Н. Гемофилия.- Санкт-Петербург, 1999.- 101 с.], что снижение
или отсутствие выработки фактора VIII у больных гемофилией А связано с рядом причин,
из которых одна из основных - усиление функции генов - супрессоров синтеза фактора
VIII; наряду с этим снижение выработки фактора VIII может быть результатом ослабленного образования организмом клеток-продуцентов фактора VIII. Адекватная терапия гемофилии А должна быть направлена на подавление активности супрессоров выработки
фактора VIII, стимуляцию функции клеток-предшественников эндотелиоцитов и усиление
функции выработки фактора VIII. Однако до настоящего времени не существовало препаратов, влияющих на перечисленные процессы.
Современное лечение больных гемофилией А заключается во введении им свежезамороженной плазмы донорской крови, криопреципитата, а также концентратов фактора VIII
свертывания крови [Якунина Л.Н. и др. Современные принципы лечения детей, больных
гемофилией // Вопросы гематологии/онкологии и иммунопатологии в педиатрии.- 2004.Т. 3.- № 2.- С. 1-4]. Указанное лечение не приводит к выздоровлению и может вызвать ряд
осложнений, связанных с инфузионной терапией, в первую очередь гепатиты. Однако самым большим недостатком заместительной терапии является то, что она подавляет собственную выработку фактора VIII, в результате чего больной нуждается в постоянных
регулярных инъекциях указанных препаратов.
В основу изобретения поставлена задача получения лекарственного препарата, стимулирующего выработку фактора VIII свертывания крови у больного гемофилией А.
Согласно изобретению предложено средство для стимуляции выработки фактора VIII
свертывания крови, содержащее поликлональные иммуноглобулины класса IgG с молекулярной массой 150 кД, полученные как гуморальный иммунный ответ на комплекс антигенов эндотелиальных и мезинхимальных стволовых клеток.
Заявляемое средство может быть получено как ксеногенный гуморальный иммунный
ответ на комплекс антигенов эндотелиальных и мезенхимальных стволовых клеток.
Иммуноглобулины класса IgG, подклассов IgG1-IgG4 имеют одинаковые константные
регионы с постоянной последовательностью аминокислот и различные вариабельные
участки; различия в вариабельных участках приводят к различию основных эффекторных
характеристик. Выработанные как результат гуморального ответа на эндотелиальные и
мезинхимальные стволовые клетки, они стимулируют функциональную активность эндотелиальных клеток, регулируют развитие клеток-предшественников эндотелиоцитов и активируют мезинхимальные стволовые клетки.
Заявляемое средство может быть получено следующим образом.
Для получения антигена трепанобиоптат донорского костного мозга, включающий эндотелиальные, эндостальные и периостальные мезенхимальные стволовые клетки, отмывали от форменных элементов крови физиологическим раствором, измельчали
механическим перетиранием до однородного состояния и взвешивали в физиологическом
растворе. Однородную взвесь центрифугировали со скоростью 1500 об/мин. Надосадочную жидкость трижды замораживали и оттаивали, после чего снова перетирали и центрифугировали со скоростью 3000 об/мин. Содержание белка в надосадочной жидкости
определяли биуретовым методом и доводили разбавлением физиологическим раствором
до концентрации 2,2 мг/мл.
Полученный таким образом антиген вводили животному в количестве 2,2 мг на 1 кг
массы тела иммунизируемого объекта. В качестве иммунизируемого животного могут
быть использованы любые биологические ксеногенные объекты, способные дать гуморальный иммунный ответ на введение чужеродного белка, например домашний и крупный
рогатый скот. Первая инъекция антигена проводилась в полном адъюванте Фрейнда или
иного стимулятора иммунного ответа. Последующие инъекции проводились с интервалом
2
BY 13560 C1 2010.08.30
2-7 дней так, чтобы весь курс иммунизации занимал 20-50 дней. У иммунизированного
объекта забирают кровь в стерильную посуду без консервантов и антикоагулянтов. Норма
забора крови у животного не превышает 10 мл/кг массы тела.
После осаждения форменных элементов крови и формирования сгустка надосадочную
жидкость (сыворотку) перенесли в другой стерильный сосуд. Иммуноглобулиновые фракции выделили из надосадочной жидкости высаливанием, осадок отделили, растворили в
дистиллированной воде и разделили на фракции хроматографически. Фракцию, соответствующую классу IgG, вымыли специальным элюатом и очистили диализом через полупроницаемую мембрану. Очищенный раствор стерилизовали фильтрацией, дозированно
разлили и высушили в вакууме или атмосфере инертного газа до остаточной влажности 25 %. Ампулы запаивали. Каждая ампула содержала разовую дозу заявляемого средства.
Хранение препарата осуществляли при 4 °С в темном месте сроком не более 24 месяцев.
В качестве источника антигенного материала - эндотелиальных и мезинхимальных
стволовых клеток человека могут быть использованы ткани периостальных, эндостальных
и интерстициальных пространств костного мозга, полученные в виде трепанобиоптатов
костного мозга от здоровых доноров. Полученный антиген, содержащий эндотелиальные
и мезинхимальные стволовые клетки, можно использовать сразу после получения или
хранить в замороженном состоянии до употребления.
Вариант осуществления изобретения.
Изобретение иллюстрируется примерами получения и применения заявляемого средства.
Пример.
Иммунизации подвергли здоровую козу с массой тела 25 кг. В четырех различных
точках тела ей ввели по 55 мг антигена, эмульгированного в полном адъюванте Фрейнда.
Спустя 14 дней вводили парентерально без адъюванта 6 раз такое же количество антигена
с интервалами между инъекциями 2-4 дня. Суммарная доза антигена составила 1,54 г.
Контроль титра антител (иммуноглобулинов) к эндотелиальным и мезенхимальным
стволовым клеткам проводили перед каждой инъекцией, начиная с 4-й. Перед пятой инъекцией титр антител составил 1 : 512, перед шестой - 1 : 1024, перед эксфузией крови 1 : 2048. Через 7 дней после последнего введения антигена из яремной вены козы взяли
без консерванта 250 мл крови. Сыворотку отделили от сгустка и форменных элементов
крови центрифугированием при скорости 3000 об/мин в течение 30 минут. Из сыворотки
осадили полиглобулиновую фракцию добавлением насыщенного раствора сульфата аммония. Надосадочную жидкость отделили центрифугированием, осадок растворили в дистиллированной воде, концентрация белка в растворе составила 5 мг/мл. Раствор ввели в
хроматографическую колонку и после разделения на фракции иммуноглобулины IgG
элюировали 0,025 М трис-HCE pH 7,8-0,15 М трис-HCE буфером с pH 7,8. Раствор подвергли диализу через полупроницаемую мембрану против дистиллированной воды в течение 2 суток. После диализа раствор иммуноглобулинов стерилизовали фильтрацией через
миллипоровские фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Жидкий стерильный раствор разлили по 1 мл в ампулы. Содержание белка в одной дозе составило 5 мг. Сушку лиофилизацией проводили в режиме лиофилизации иммуноглобулинов (от -60 до 37 °С). Ампулы
герметически запаивали. До использования средство хранили при 4 °С.
Титр антител в готовом препарате составил 1 : 1200 к антигенам эндотелиальных и мезинхимальных стволовых клеток. Остаточная влажность 3 мас. %. Лиофилизированный
препарат представляет собой белую пористую гигроскопическую массу, растворяющуюся
без остатка в воде или физологическом растворе при комнатной температуре в течение
60 с. Содержимое ампулы растворяется в 1 мл воды, раствор прозрачный, слегка опалесцирующий.
Препарат исследовался на стерильность, токсичность и апирогенность в соответствии
с регламентированными методиками. Специфическую безвредность определяли по его
способности вызывать гемагглютинацию и тромбоагглютинацию в соответствующих те3
BY 13560 C1 2010.08.30
стах, а также лимфотоксичность в микролимфоцитотоксическом тесте по методу Терасаки
[Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача.- С.-Петербург, 1998.- 156 с.]
при действии на форменные элементы крови концентратами заявляемого средства.
В испытуемых разведениях препарат не обладал токсическими свойствами. Морфологические исследования при световой и электронной микроскопии не выявили токсических
признаков - вакуолизации и нарушения структуры цитоплазмы, ее окраски стандартными
красителями, целостность органелл клеток не нарушена.
Заявляемое средство было испытано на больных гемофилией А в тяжелой форме. Для
испытаний были выбраны больной Г. 14 лет, больной Ц. 22 лет и больной И. 38 лет. Все
обычно получали инъекции фактора VIII по 500-600 международных единиц и криопреципитата в количестве 8-10 доз внутривенно с частотой один раз в 2-3 дня.
Лечение заявляемым средством проводили в течение 3 дней курсом из 3 внутривенных
инъекций в дозе 0,05-0,1 мг средства на килограмм веса больного. Наблюдение проводили
в течение 35 суток.
Результаты исследования представлены в таблице.
Уровень фактора VIII в плазме крови больных гемофилией (% от нормы)
Исходный
Количество переливауровень
Через
Через Через 35
Пациент
Возраст
ний фактора VIII за
фактора
сутки неделю
суток
время наблюдения
VIII
Г-н М.
14 лет
0,46
0,40
1,00
1,20
1
Ц-в А.
22 года
0,42
0,60
0,63
0,79
3
И-в С.
38 лет
1,10
0,80
1,30
1,10
2
Как видно из таблицы, у больных Г. и Ц. содержание фактора VIII повысилось (всего
от трех инъекций). У больного И. содержание фактора VIII осталось без изменений, однако улучшение общего состояния потребовало только двух переливаний фактора VIII за 35
суток.
За период наблюдения у всех больных отмечено снижение числа переливаний экзогенного фактора VIII до единичных в месяц. Не отмечено случаев инфекционных, простудных и герпетических заболеваний, несмотря на то, что лечение проводилось зимой.
Отмечено субъективное улучшение качества жизни: не происходило спонтанных кровоизлияний в полости суставов, появилась большая свобода движений в суставах рук и ног,
улучшились сон, аппетит и настроение больных.
Заявляемое средство может применяться при лечении гемофилии А. Оно может выпускаться биотехнологической отраслью фармацевтической промышленности.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
93 Кб
Теги
патент, by13560
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа