close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13564

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.08.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 9/12
B 01D 15/08
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ НУКЛЕОЗИДДИФОСФАТКИНАЗЫ ИЗ
РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
(21) Номер заявки: a 20081207
(22) 2008.09.24
(43) 2010.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси"
(BY)
(72) Авторы: Дубовская Людмила Вячеславовна; Колеснева Екатерина Владимировна; Содель Дмитрий Леонидович; Волотовский Игорь Дмитриевич (BY)
BY 13564 C1 2010.08.30
BY (11) 13564
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биофизики и клеточной инженерии
Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) STRUGLICS A. et al. // Eur. J. Biochem.1999.- V. 262.- P. 765-767.
ROYMANS D. et al. // Experimental cell
Research.- 2000.- V. 261.- P. 127-138.
WO 01/07580 A1.
WO 84/04329 A1.
WO 96/27027 A1.
(57)
1. Способ получения нуклеозиддифосфаткиназы из растительного сырья, включающий гомогенизацию листьев растений и хроматографическое выделение целевого продукта, отличающийся тем, что растительное сырье гомогенизируют при 0-4 °С в 50 мМ
глицерофосфатном буфере с pH 7,4, содержащем 20 мМ ЭДТА, 15 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ и
5 мМ NaF, с добавлением 1 % (мас./объем) поливинилполипирролидона, 1 % (мас./мас.)
коктейля для ингибирования растительных протеаз, 500 мкМ Na3VO4, 10 мкМ NH4MoO4 и
2 мМ ДТТ, при соотношении массы растительного сырья в г к объему среды в мл, равном
1:2, полученный гомогенат разделяют центрифугированием и из полученной цитозольной
фракции выделяют целевой продукт с помощью аффинной хроматографии на колонке с
8-(2-аминоэтил)тиогуанозин-3',5'-цикломонофосфат-агарозой, причем все операции аффинной хроматографии, за исключением десорбции белков, проводят при 20-25 °С.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что центрифугирование гомогената осуществляют при (100000-125000)×g в течение 30-40 минут.
3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что десорбцию белков ведут раствором гуанозин-3',5'-цикломонофосфата при 0-4 °С.
Изобретение относится к области промышленности биоактивных веществ, а именно к
производству диагностических и лекарственных противоопухолевых препаратов из растительного сырья, и может быть использовано в химических и биотехнологических производствах, медицине и фармацевтической промышленности.
BY 13564 C1 2010.08.30
Нуклеозиддифосфаткиназа (НДФК; EC 2.7.4.6, нуклеозиддифосфатфосфотрансфераза;
нуклеозиддифосфаткиназа) представляет собой фермент, катализирующий перенос фосфатного остатка (γ-фосфата, Ф) от нуклеозидтрифосфатов (Н1ТФ, преимущественно АТФ)
к 5'-нуклеозиддифосфатам (Н2ДФ) по следующей схеме:
Н1ТФ + Фермент → Н1ДФ + Фермент∼Ф
Фермент~Ф + Н2ДФ → Н2ТФ + Фермент
Н1ТФ + Н2 ДФ → Н1ДФ + Н2ТФ
и, таким образом, выполняющий ключевую роль в поддержании физиологических концентраций нуклеозидтрифосфатов в клетке. Изоформы НДФК присутствуют во всех эукариотических клетках (грибы, растения и животные). Нуклеозиддифосфаткиназная
активность обнаружена в ряде клеточных компартментов, таких как цитозоль, митохондрии, микросомы и хлоропласты.
В клетках животных и человека НДФК участвует в контроле клеточного деления и регуляции транскрипции жизненноважных генов. Было обнаружено, что НДФК человека
подавляют метастатический потенциал опухолей [1].
Оказалось, что растения обладают высоким запасом экстрагируемой НДФК. В растениях присутствие НДФК обнаружено во всех вегетативных и репродуктивных органах и
тканях: корнях, листьях, клубеньках и клеточных культурах. Известно, что в растениях
изоформы нуклеозиддифосфаткиназы принимают участие в важных регуляторных процессах, таких как фоторецепторная фитохромная сигнализация и формирование УФответа, выступая в роли позитивного фактора транскрипции, а также в стрессовой сигнализации при тепловом и окислительном шоке и механическом повреждении. Наибольшая
активность НДФК в растениях регистрируется в цитоплазматической фракции (81-85 %),
где она представлена изоформой НДФК1.
В литературе описано несколько способов выделения НДФК из растительных объектов, однако нет эффективного способа выделения растворимой цитоплазматической
НДФК из растений. В связи с относительно легкой доступностью и простотой использования растительных объектов способ выделения и очистки цитоплазматической НДФК из
растительной ткани является актуальным для применения в научных лабораториях, на
химическом и фармакологическом производстве.
Известен способ получения НДФК из грубого экстракта корней свеклы [2], который
состоит из стадий: получение грубого экстракта из корней свеклы путем проведения гомогенизации ткани и фильтрование гомогената через ткань; выделение НДФК путем проведения преципитации белков с помощью сульфата аммония, диализа, центрифугирования,
ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-сефарозе с градиентной элюцией, диализа и хроматографии на гидроксиапатите с градиентной элюцией; диализ. Выход активной фракции по белку составляет 1,8 %.
Недостатком способа является трудоемкость и многоэтапность процесса выделения,
включающего несколько стадий хроматографии и сложный многоступенчатый процесс
элюции, что снижает выход продукта и уровень рентабельности производственного процесса, требует больших затрат времени и тем самым затрудняет его использование в производстве.
Наиболее близким является способ получения НДФК из митохондрий [3], включающий получение чистой фракции хлоропластов или митохондрий путем проведения следующих стадий: гомогенизация ткани, фильтрование гомогената через ткань,
центрифугирование фильтрата, центрифугирование осадка в градиенте плотности, отмывание отобранной митохондриальной фракции центрифугированием; выделение НДФК
путем проведения экстрагирования белка осмотическим разрушением, центрифугирования, ультрафильтрации, диализа, аффинной хроматографии на АТФ-агарозе с градиентной
элюцией, ультрафильтрации, диализа, ионообменной хроматографии на Mono Q-геле с градиентной элюцией; диафильтрацию. Выход активной фракции по белку составляет 2,6 %.
2
BY 13564 C1 2010.08.30
Недостатком известного способа является трудоемкость и многоэтапность процесса
выделения, включающего использование нерационального объекта, обладающего сложностью получения из сырья и невысоким содержанием целевого продукта, несколько стадий хроматографии и сложный многоступенчатый процесс элюции, что снижает выход
продукта и уровень рентабельности производственного процесса, требует больших затрат
времени и тем самым затрудняет его использование в производстве.
В основу изобретения положена задача создания эффективного способа получения
нуклеозиддифосфаткиназы из растительного сырья.
Технический результат - сокращение времени получения фермента, повышение выхода целевого продукта и рентабельности производственного процесса.
Поставленная задача решается следующим образом. Известный способ получения
нуклеозиддифосфаткиназы из растительного сырья включает гомогенизацию листьев растений и хроматографическое выделение целевого продукта. Согласно изобретению, растительное сырье гомогенизируют при 0-4 °С в 50 мМ глицерофосфатном буфере с pH 7,4,
содержащем 20 мМ ЭДТА, 15 мМ MgCl2, 1 мМ ДТТ и 5 мМ NaF, с добавлением 1 %
(мас./объем) поливинилполипирролидона, 1 % (мас./мас.) коктейля для ингибирования
растительных протеаз, 500 мкМ Na3VO4, 10 мкМ NH4MoO4 и 2 мМ ДТТ, при соотношении
массы растительного сырья в г к объему среды в мл, равном 1:2, полученный гомогенат
разделяют центрифугированием и из полученной цитозольной фракции выделяют целевой
продукт с помощью аффинной хроматографии на колонке с 8-(2-аминоэтил)тиогуанозин3',5'-цикломонофосфат-агарозой, причем все операции аффинной хроматографии, за исключением десорбции белков, проводят при 20-25 °С.
Центрифугирование гомогената осуществляют при (100000-125000)×g в течение 3040 минут.
Десорбцию белков ведут раствором гуанозин-3',5'-цикломонофосфата при 0-4 °С.
Существенными отличительными признаками изобретения являются использование
цитозольной фракции и выделение целевого продукта с помощью аффинной хроматографии на колонке с 8-(2-аминоэтил)тиогуанозин-3',5'-цикломонофосфат-агарозой, обладающей повышенными аффинными свойствами лиганда. Что позволило сократить время
получения фермента и повысить выход целевого продукта.
Гомогенность препарата доказана с помощью ДСН-гель-электрофореза, изоэлектрофокусирования и масс-спектрометрии.
Данный способ позволяет получать достаточное количество цитозольной нуклеозиддифосфаткиназы из различных растений.
Пример
Для получения нуклеозиддифосфаткиназы брали 5 г листьев овса, который гомогенизировали в 10 мл 50 мМ глицерофосфатного буфера с pH 7,4, содержащего 20 мМ ЭДТА,
15 мМ MgCl2, 1 мМ 1,4-дитиотрейтола (ДТТ) и 5 мМ NaF (буфер А), с добавлением 1 %
(мас./объем) поливинилполипирролидона, 1 % (мас./мас.) коктейля для ингибирования
растительных протеаз, 500 мкМ Na3VO4, 10 мкМ NH4MoO4 и 2 мМ ДТТ (буфер Б), при
соотношении массы растительного сырья (г) к объему (мл) среды, как 1:2. Гомогенат
фильтруют через ткань и осветляют центрифугированием при 113000×g 30 минут. Супернатант используют в качестве фракции растворимых цитозольных белков для аффинной
хроматографии. Все операции проводят при температуре от 0 до 4 °С. Экстракт растворимых белков, содержащий 4,5 мг общего белка, наносят на колонку, заполненную 600 мкл
8-(2-аминоэтил)тиогуанозин-3',5'-цикломонофосфат-агарозы (8-АЕТ-цГМФ-агарозы), в
которой 8-АЕТ-цГМФ мобилизован в качестве аффинного лиганда. Колонку с гелем предварительно уравновешивают 6 мл буфера А (100-200 мкл/мин) при 25 °С. После промывания 30 мл буфера А (200 мкл/мин) связанные белки элюируют при 4 °С в течение 15 часов
путем инкубации в 1,2 мл буфера А, содержащего конкурентный 10 мМ цГМФ. Элюат собирают и с целью смены буфера подвергают диализу против 25 мМ Трис-HCl буфера с pH
3
BY 13564 C1 2010.08.30
7,5 с содержанием 1 мМ β-меркаптоэтанола с использованием диализных пробирок (2 мл;
3,5 кДа). Фракцию помещают во флакон и высушивают лиофилизацией.
Выход активной фракции по белку составляет 0,5 мг (11 %).
Предлагаемый способ обеспечивает получение нуклеозиддифосфаткиназы из любого
растительного сырья с использованием одной стадии хроматографии и одноступенчатой
элюции, сокращает время выделения фермента, позволяет повысить его выход и повышает рентабельность производственного процесса.
Источники информации:
1. Патент США 6518062, МПК C 12N 15/09, 1993.
2. Yupsanis T. et al. Purification, properties and specificity of a NDP kinase from Alyssum
murale grown under Ni2+ toxicity // J. Plant Physiol.- 2007.- V. 164.- P. 113-1123.
3. Struglics A. and Hakansson G. Purification of a serine and histidine phosphorylated mitochondrial nucleoside diphosphate kinase from Pisum sativum // Eur.J.Biochem.- 1999.- V. 262.P. 765-773.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
83 Кб
Теги
by13564, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа