close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13675

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.10.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/48
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРОКСИДАЗНОЙ АКТИВНОСТИ
МИЕЛОПЕРОКСИДАЗЫ В ПЛАЗМЕ КРОВИ
(21) Номер заявки: a 20090884
(22) 2009.06.17
(43) 2009.12.30
(71) Заявитель: Белорусский государственный университет (BY)
(72) Авторы: Горудко Ирина Владимировна (BY); Панасенко Олег Михайлович (RU); Соколов Алексей
Викторович (RU); Черенкевич Сергей Николаевич (BY); Сергиенко
Валерий Иванович (RU)
BY 13675 C1 2010.10.30
BY (11) 13675
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Белорусский государственный университет (BY)
(56) WAUGH W.H. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 2003, v. 25, № 10, p. 831-834.
ПАНАСЕНКО О.М.
и
др.
//
Биофизика. - 2008. - Т. 53. - № 4. - С.
573-581.
Власова и.и. и др. // Биохимия. - 2006. Т. 71. - Вып. 6. - С. 825-837.
NOWAK D. et al. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis, 1997,
№ 45, С. 67-71 [http://www.cardiosite.ru/
recommendations/article.asp?pr = 1&id =
1256].
RU 2196509 C2, 2003.
SU 1474512 A1, 1989.
RU 2298183 C2, 2007.
EP 389381 A1, 1990.
(57)
Способ определения пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови,
включающий внесение о-дианизидина в качестве субстрата в разбавленную буферным
раствором плазму крови, спектрофотометрическое определение скорости его окисления
после добавления пероксида водорода и определение активности миелопероксидазы, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора используют фосфат-цитратный
буфер с pH 4,5, пероксид водорода добавляют до концентрации 100-200 мкМ, спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в отсутствие и в присутствии ингибитора миелопероксидазы - гидразида 4-аминобензойной
кислоты, активность миелопероксидазы определяют по разности скоростей окисления
о-дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты.
Изобретение относится к биохимической диагностике, а именно к способам определения активности миелопероксидазы (МПО) в плазме крови.
Являясь биохимическим маркером активации нейтрофилов, МПО может играть решающую роль при различных патологических состояниях, сопровождающихся воспалительной реакцией организма (атеросклероз, сердечно-сосудистые, онкологические,
нейродегенеративные заболевания, нарушения дыхательной функции легких, при заболеваниях почек, системных васкулитах, ревматоидном артрите и др.). При секреторной де-
BY 13675 C1 2010.10.30
грануляции или гибели нейтрофила МПО может в значительном количестве попадать в
кровь, и образующиеся в результате ее функционирования сильные окислители - реакционные производные галогенов, азота, кислорода, в том числе и свободные радикалы - способны вызывать в очагах воспаления повреждение собственных тканей организма.
Известны иммунохимические способы определения количества освобожденной лейкоцитами МПО, основанные на иммуноферментном методе анализа (ИФА) [1].
Эти способы основываются на количественном выявлении МПО с применением моноклональных антител к этому ферменту. Однако ИФА является дорогостоящим методом,
требующим наличия иммуноферментного анализатора, который имеется не в каждой клинике, его осуществление требует выполнения большого числа подготовительных операций. Но главное, данный метод не позволяет оценить функциональную активность МПО,
от которой в первую очередь зависит, насколько интенсивна наработка этим ферментом
реакционных продуктов-окислителей, и которая в конечном итоге определяет степень повреждения биологически важных молекул, а вместе с тем степень тяжести течения заболевания и развитие его осложнений.
Активность МПО можно характеризовать как через продукцию гипогалоидных кислот
(галогенирующая активность), так и через окисление ароматических субстратов по пероксидазному циклу (пероксидазная активность). Однако скорость реакции гипогалоидных
кислот с функциональными группами биологически важных молекул плазмы крови
настолько высока (k > 106 М-1с-1), что современные методы не в состоянии зарегистрировать их образование в плазме крови, а значит и определить в ней галогенирующую активность МПО.
Оценка пероксидазной активности МПО в крови осложнена тем обстоятельством, что
в плазме крови присутствуют гем-содержащие белки, выполняющие функцию пероксидазы, важнейшим из которых является гемоглобин.
В качестве прототипа принят способ определения общей пероксидазной активности
плазмы, включающий внесение в плазму крови субстрата, в качестве которого используют
о-дианизидин, и спектрофотометрическое определение скорости его окисления в присутствии пероксида водорода (3 мМ) в фосфатном буфере (pH 6,9) [2].
Однако известный способ имеет недостатки, так как не позволяет оценивать пероксидазную активность именно присутствующей в плазме МПО, а лишь общей пероксидазной
активности, включающей вклад как МПО, так и других псевдопероксидаз, маскирующих
истинную активность МПО.
Задачей изобретения является создание способа быстрого и реального определения
пероксидазной активности МПО в плазме крови.
Поставленная задача достигается тем, что в способе определения пероксидазной активности миелопероксидазы в плазме крови, включающем внесение о-дианизидина в качестве
субстрата в разбавленную буферным раствором плазму крови, спектрофотометрическое
определение скорости его окисления после добавления пероксида водорода и определение
активности миелопероксидазы, в качестве буферного раствора используют фосфатцитратный буфер с pH 4,5, пероксид водорода добавляют до концентрации 100-200 мкМ,
спектрофотометрическое определение скорости окисления субстрата осуществляют в отсутствие и в присутствии ингибитора миелопероксидазы гидразида 4-аминобензойной кислоты, активность миелопероксидазы определяют по разности скоростей окисления одианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида-4-аминобензойной кислоты.
Сущность изобретения состоит в том, что субстрат о-дианизидин вносят в разбавленную буферным раствором плазму крови в отсутствие и в присутствии гидразида 4аминобензойной кислоты, спектрофотометрически определяют скорость окисления субстрата после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ), пероксидазную активность
МПО в плазме крови определяют по разности скоростей окисления субстрата о-
2
BY 13675 C1 2010.10.30
дианизидина в отсутствие и в присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты. Сущность предлагаемого изобретения поясняется фиг. 1, фиг. 2, где:
на фиг. 1 приведена зависимость пероксидазной активности МПО в плазме от концентрации Н2О2;
на фиг. 2 показана pH-зависимость пероксидазной активности МПО в плазме.
Способ позволяет определить активность МПО. Это дает возможность прогнозировать
развитие заболеваний, уточнить диагноз и своевременно принять меры, направленные на
регулирование активности этого фермента, а также провести мониторинг МПО во время
клинических испытаний фармакологических препаратов.
Стоимость определения сокращается в несколько тысяч раз, что делает способ экономически выгодным.
Простота и скорость дают возможность использовать способ в экспресс-диагностике.
Способ осуществляется следующим образом. Для работы используют спектрофотометр. Отделенную от клеточного осадка путем центрифугирования плазму крови в количестве 60-70 мкл вносят в спектрофотометрическую кювету объемом 0,8 мл, содержащую
смесь лимонной кислоты и Na2HPO4 (pH 4,5) в отсутствие и в присутствии ингибитора
МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты (50 мкМ), и субстрат о-дианизидин
(380 мкМ). Пробу тщательно перемешивают непосредственно в кювете и начинают регистрацию увеличения ее оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 450460 нм в течение 8-10 мин после добавления пероксида водорода (100-200 мкМ). Оптическим контролем служит проба, содержащая такой же, как и в опытной пробе, объем буферного раствора и субстрата.
Расчет активности фермента проводят по формуле:
∆D − ∆Dинг. V
⋅ ,
[МПО] =
t
υ
где ∆D и ∆Dинг. - прирост оптической плотности в отсутствие и в присутствии гидразида
4-аминобензойной кислоты за t минут;
V - общий объем реакционной смеси;
t - время измерения активности;
ν - объем образца плазмы.
Пример 1, демонстрирующий выбор оптимальной концентрации пероксида водорода
при определении пероксидазной активности МПО в плазме.
В одну опытную кювету объемом 0,8 мл вносили 60 мкл плазмы, МПО в концентрации 100 нг/мл, фосфат-цитратный буфер (pH 4,5) и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В
другую - все то же самое, плюс гидразид 4-аминобензойной кислоты в концентрации
50 мкМ. В контрольную кювету вносили 60 мкл физиологического раствора, буферный
раствор в объеме, равном объему в опытной кювете и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ).
Содержание кювет тщательно перемешивали и одновременно в три кюветы добавляли
раствор пероксида водорода. Предлагаемым способом была измерена пероксидазная активность МПО в плазме при разных концентрациях пероксида водорода (50-1000 мкМ).
Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и начинали регистрацию оптической плотности в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны 460 нм в
течение 8-10 мин. Активность МПО в плазме рассчитывалась согласно формуле:
∆D − ∆Dинг.
,
[МПО] =
t
где ∆D и ∆Dинг. - прирост плотности плазмы крови за t мин в отсутствие и в присутствии
гидразида 4-аминобензойной кислоты.
Результаты измерений приведены на фиг. 1, откуда следует, что зависимость пероксидазной активности в плазме от концентрации пероксида водорода носит экстримальный
характер.
3
BY 13675 C1 2010.10.30
Анализ данных, приведенных на фиг. 1, позволяет сделать вывод о том, что при концентрации пероксида водорода, равной 100-200 мкМ, активность МПО в плазме максимальна.
Пример 2, демонстрирующий выбор значения pH, оптимального для определения пероксидазной активности МПО в плазме.
Определение пероксидазной активности МПО плазмы проводили, как описано в примере 1, но при разных значениях pH. Пероксид водорода использовали в концентрации
100 мкМ.
Результаты использования метода определения активности МПО при разных значениях pH приведены на фиг. 2, откуда следует, что зависимость активности МПО в плазме от
pH носит экстримальный характер с максимумом при pH 4,5.
Анализ данных, приведенных на фиг. 2, позволяет сделать вывод о том, что при значении pH, равном 4,5, активность МПО в плазме максимальна.
Пример 3, демонстрирующий необходимость использования ингибитора МПО с целью исключения возможного искажения определяемого значения пероксидазной активности МПО присутствующим в плазме гемоглобином.
Предлагаемым способом была измерена пероксидазная активность МПО в плазме, содержащей гемоглобин. Определение пероксидазной активности плазмы проводили, как
описано в примере 1. Результаты использования метода определения МПО в плазме, содержащей МПО и гемоглобин, приведены в табл. 1.
Таблица 1
Показатели пероксидазной активности МПО плазмы крови,
содержащей гемоглобин
[МПО]
∆D
∆Dинг
Плазма с добавками гемоглобина
0,037
0,036
0,001
Плазма с добавками МПО
0,026
0,001
0,025
Анализ данных, приведенных в табл. 1, позволяет сделать вывод о том, что использование ингибитора МПО - гидразида 4-аминобензойной кислоты позволяет в пределах
ошибки эксперимента исключить влияние гемоглобина на определение активности МПО
в плазме.
Пример 4
Предлагаемым способом измерена активность МПО в плазме крови 5 человек.
В одну опытную кювету объемом 0,8 мл вносили 60 мкл плазмы, фосфат-цитратный
буфер (pH 4,5) и субстрат - о-дианизидин (380 мкМ). В другую опытную кювету вносили
все то же самое, плюс гидразид 4-аминобензойной кислоты в концентрации 50 мкМ. В
контрольную кювету вносили 60 мкл физиологического раствора, буферный раствор в
объеме, равном объему в опытной кювете и о-дианизидин (380 мкМ). Содержание кювет
тщательно перемешивали и одновременно в три кюветы добавляли раствор пероксида водорода (100 мкМ). Содержимое кювет еще раз тщательно перемешивали и начинали регистрацию плотности в опытных кюветах против контрольной пробы при длине волны
460 нм в течение 8-10 мин.
Активность МПО в плазме рассчитывалась согласно формуле:
∆D − ∆D инг. 0,8
,
[МПО] =
⋅
t
0,06
где ∆D и ∆Dинг. - прирост оптической плотности плазмы крови за t мин в отсутствие и в
присутствии гидразида 4-аминобензойной кислоты;
0,8 - объем реакционной смеси (мл);
0,06 - объем плазмы в опытной пробе (мл).
Полученные результаты приведены в табл. 2.
4
BY 13675 C1 2010.10.30
Таблица 2
Показатели активности МПО в плазме
Номер образца
[МПО]
1
0,013
2
0,012
3
0,103
4
0,007
5
0,080
Анализ данных, приведенных в табл. 2, позволяет сделать вывод о том, что предлагаемый способ позволяет определить активность МПО в плазме крови.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и реально определить активность МПО, стоимость определения сокращается в несколько тысяч раз, что делает способ
экономически выгодным.
Источники информации:
1. Zhang, R., Brennan, M.-L., Fu, X., Aviles, R.J., Pearce, G.L., Penn, M.S., Topol, E.J.,
Sprecher, D.L., and Hazen, S.L. (2001) JAMA, 286, 2136-2142.
2. Waugh, W.H. (2003) J. Pediatr. Hematol. Oncol, 25, 831-834 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
95 Кб
Теги
by13675, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа