close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13874

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.12.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61B 5/00
G 01N 33/48
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ РЕЦИДИВА
РАССЕЯННОГО СКЛЕРОЗА
(21) Номер заявки: a 20081376
(22) 2008.10.31
(43) 2010.06.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение образования "Белорусская
медицинская академия последипломного образования" (BY)
(72) Авторы: Нижегородова Дарья Борисовна; Зафранская Марина Михайловна; Федулов Александр Сергеевич (BY)
BY 13874 C1 2010.12.30
BY (11) 13874
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение образования "Белорусская
медицинская академия последипломного образования" (BY)
(56) RU 2021611 C1, 1994.
RU 2081412 C1, 1997.
RU 2104543 C1, 1998.
RU 2112242 C1, 1998.
BY 3882 C1, 2001.
RU 2272292 C1, 2006.
(57)
Способ прогнозирования развития рецидива рассеянного склероза, заключающийся в
том, что выделяют из периферической венозной крови мононуклеары (МПК), удаляют из
части МПК путем иммуномагнитной сепарации γδT-лимфоциты, окрашивают интактные
МПК и МПК с удаленной популяцией γδT-лимфоцитов 5(6)-карбоксифлуоресцеином,
культивируют в течение 10 дней в питательной среде, содержащей миелинспецифический протеин, окрашивают интактные МПК и МПК с удаленной популяцией
γδT-лимфоцитов меченными флуоресцентной меткой моноклональными антителами к
CD3+ маркеру T-клеток, регистрируют в обеих культурах количество поделившихся
T-клеток, определяют коэффициент пролиферации клеток k в процентах по формуле:
П
k = 100 − МПК − γδT × 100,
П МПК
где Пмпк-γδT - количество поделившихся T-клеток в культуре МПК с удаленной популяцией
γδT-лимфоцитов;
Пмпк - количество поделившихся T-клеток в интактной культуре МПК,
и при значении k менее 40 % прогнозируют развитие рецидива рассеянного склероза.
Изобретение относится к медицине, к разделам нейроиммунологии, неврологии, аутоиммунной патологии и клеточной биологии.
Проблема прогнозирования осложнений рассеянного склероза связана с отсутствием
до настоящего времени лабораторных критериев оценки возможного развития рецидива
заболевания. На сегодняшний день существует диагностический алгоритм обследования
больных рассеянным склерозом (клиническая картина, офтальмологическое обследование, магнитно-резонансная томография), который позволяет идентифицировать рецидив
рассеянного склероза, однако уже после его развития.
BY 13874 C1 2010.12.30
Задачей заявляемого способа является раннее прогнозирование возможного рецидива
с целью назначения своевременного патогенетического лечения и предотвращения развития осложнений.
Поставленная задача решается следующим образом. Предложен способ прогнозирования развития рецидива рассеянного склероза, заключающийся в том, что выделяют из периферической крови мононуклеары (МПК), удаляют из части МПК путем магнитной
сепарации γδT-лимфоциты, окрашивают интактные МПК и МПК с удаленной популяцией
γδT-лимфоцитов 5(6)-карбоксифлуоресцеином, культивируют в течение 10 дней в питательной среде, содержащей миелин-специфический протеин, окрашивают интактные
МПК и МПК с удаленной популяцией γδT-лимфоцитов меченными флуоресцентной меткой моноклональными антителами к CD3+ маркеру T-клеток, регистрируют в обеих культурах количество поделившихся T-клеток, определяют коэффициент пролиферации
клеток k в процентах по формуле:
П
k = 100 − мпк − γδT x100 ,
П мпк
где Пмпк-γδT - количество поделившихся T-клеток в культуре МПК с удаленной популяцией
γδT-лимфоцитов;
Пмпк - количество поделившихся T-клеток в интактной культуре МПК,
и при значении k менее 40 % прогнозируют развитие рецидива рассеянного склероза.
Пример 1.
Больной Н., 38 лет, поступил в отделение неврологии с диагнозом: "Рассеянный склероз, рецидивно-ремиттирующее течение". У больного был осуществлен забор периферической венозной крови, из которой методом центрифугирования на градиенте плотности в
течение 30 мин с последующим отмыванием физиологическим раствором были выделены
мононуклеары периферической крови (МПК).
Суспензия МПК была разделена на 2 части: из одной части МПК были удалены
γδT-лимфоциты методом иммуномагнитной сепарации с использованием набора моноклональных антител к γδT-клеточному рецептору, а вторая часть МПК оставалась интактной. Для иммуномагнитной сепарации γδT-клеток МПК, в концентрации
1x107 МПК/мл, инкубировались с 10 мкл специфическими первичными моноклональными
антителами в течение 10 мин, а затем с 10 мкл вторичными моноклональными антителами, несущие магнитные шарики в течение 10 мин. После инкубации пробирка с клетками
помещалась в магнитный сепаратор на 10 мин, в результате чего меченная моноклональными антителами популяция γδT-лимфоцитов оставалась в магнитном поле прибора, в то
время как немеченые МПК, содержащие αβT-лимфоциты, сливались в отдельную стерильную пробирку.
Интактные МПК и МПК с удаленной популяцией γδT-лимфоцитов в концентрации
1x107 клеток/мл окрашивались внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином
(CFSE, 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) в концентрации 7 µM в 1 мл
культуральной среды RPMI-1640 в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре.
После остановки окрашивания путем отмывания МПК полной культуральной средой
(RPMI-1640 с 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 % инактивированной человеческой сывороткой группы AB) клетки засевались в 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2x105 клеток/лунку и культивировались в течение
10 дней в присутствии 10 мкг/мл миелин-специфического протеина в увлажненной атмосфере с 5 % CO2 при 37 °С с заменой на 6-й день полной культуральной среды, содержащей 10 U/мл интерлейкина-2.
Регистрация миелин-специфической пролиферации αβT-лимфоцитов в присутствии и
отсутствии популяции γδT-клеток осуществлялась на 10-й день культивирования методом
проточной цитометрии. Для этого МПК и МПК с удаленной популяцией γδT-лимфоцитов
2
BY 13874 C1 2010.12.30
окрашивались 3 мкл моноклональных антител к CD3+ маркеру T-клеток, меченных флуоресцентной меткой, в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией количества
поделившихся клеток. Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Количество поделившихся CD3+ Т-клеток в ответ на миелин-специфический
протеин у больного Н.
% поделившихся αβT-клеток в
% поделившихся αβT-клеток в
суспензии МПК в присутствии
суспензии МПК в отсутствие
γδT-лимфоцитов (Пмпк)
γδT-лимфоцитов (Пмпк-γδT)
Больной Н.
52,77
50,55
Согласно полученным данным, был подсчитан коэффициент пролиферации k ( %) по
формуле:
П
k = 100 − мпк − γδT x 100 = 100 − (50,55x100) / 52,77 = 4,21 %
П мпк
Таким образом, коэффициент пролиферации k составил менее 40, что позволяет прогнозировать возможное развитие рецидива рассеянного склероза. В связи с этим рекомендовано изменение схемы лечения и назначение курса иммуносупрессирующей
патогенетической и/или кортикостероидной терапии.
Пример 2.
Больной К., 35 лет, поступил в отделение неврологии с диагнозом: "Рассеянный склероз, рецидивно-ремиттирующее течение". У больного был осуществлен забор периферической венозной крови, из которой методом центрифугирования на градиенте плотности в
течение 30 мин с последующим отмыванием физиологическим раствором были выделены
мононуклеары периферической крови (МПК).
Суспензия МПК была разделена на 2 части: из одной части МПК были удалены
γδT-лимфоциты методом иммуномагнитной сепарации с использованием набора моноклональных антител к γδT-клеточному рецептору, а вторая часть МПК оставалась интактной. Для иммуномагнитной сепарации γδT-клеток МПК, в концентрации
1x107 МПК/мл, инкубировались с 10 мкл специфическими первичными моноклональными
антителами в течение 10 мин, а затем с 10 мкл вторичными моноклональными антителами, несущие магнитные шарики в течение 10 мин. После инкубации пробирка с клетками
помещалась в магнитный сепаратор на 10 мин, в результате чего меченая моноклональными антителами популяция γδT-лимфоцитов оставалась в магнитном поле прибора, в то
время как немеченые МПК, содержащие αβT-лимфоциты, сливались в отдельную стерильную пробирку.
Интактные МПК и МПК с удаленной популяцией γδT-лимфоцитов в концентрации
1x107 клеток/мл окрашивались внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином
(CFSE, 5- and 6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester) в концентрации 7 µM в 1 мл
культуральной среды RPMI-1640 в течение 5 мин в темноте при комнатной температуре.
После остановки окрашивания путем отмывания МПК полной культуральной средой
(RPMI-1640 с 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 % инактивированной человеческой сывороткой группы AB) клетки засевались в 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2x105 клеток/лунку и культивировались в течение
10 дней в присутствии 10 мкг/мл миелин-специфического протеина в увлажненной атмосфере с 5 % CO2 при 37 °С с заменой на 6-й день полной культуральной среды, содержащей 10 U/мл интерлейкина-2.
3
BY 13874 C1 2010.12.30
Регистрация миелин-специфической пролиферации αβT-лимфоцитов в присутствии и
отсутствии популяции γδT-клеток осуществлялась на 10-й день культивирования методом
проточной цитометрии. Для этого МПК и МПК с удаленной популяцией γδT-лимфоцитов
окрашивались 3 мкл моноклональных антител к CD3+ маркеру T-клеток, меченных флуоресцентной меткой, в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией количества
поделившихся клеток. Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
Количество поделившихся CD3+ T-клеток в ответ на миелин-специфический протеин у больного К.
% поделившихся αβT-клеток в
% поделившихся αβT-клеток в
суспензии МПК в присутствии суспензии МПК в отсутствие γδTγδT-лимфоцитов (Пмпк)
лимфоцитов (Пмпк-γδT)
Больной К.
38,75
23,16
Согласно полученным данным, был подсчитан коэффициент пролиферации k ( %) по
формуле:
П
k = 100 − мпк − γδT x 100 = 100 − (23,16x100) / 38,75 = 40,23 %
П мпк
Таким образом, коэффициент пролиферации k составил более 40, что позволяет прогнозировать отсутствие возможного развития рецидива рассеянного склероза. В связи с
этим рекомендовано проводить поддерживающую терапию и не изменять схему лечения.
Выводы.
При определении коэффициента пролиферации k менее 40 можно прогнозировать
возможное развитие рецидива рассеянного склероза с целью назначения своевременного
патогенетического лечения и предотвращения развития осложнений заболевания.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
90 Кб
Теги
by13874, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа