close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13934

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2010.12.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/53
G 01N 33/531
G 01N 33/543
A 61K 39/00
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОМАТИЧЕСКОГО АНТИГЕНА
ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ФАСЦИОЛЕЗА И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ
ФАСЦИОЛЕЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
(21) Номер заявки: a 20080301
(22) 2008.03.14
(43) 2009.10.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени
С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Якубовский Мирослав Викторович; Степанова Елена Анатольевна;
Трус Иван Анатольевич; Мясцова
Татьяна Яковлевна (BY)
BY 13934 C1 2010.12.30
BY (11) 13934
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) ОНУФРИЕНКО М.Э. Фасциолез крупного рогатого скота в северно-западном регионе России: Автореферат диссертации. Санкт-Петербург, 2004. - С. 8, 15-18.
KZ 13229 B, 2007.
KZ 14748 B, 2007.
SU 1159579 A, 1985.
Справочник ветеринарного врача. Ростов-на-Дону: Феникс, 2001. - С. 414-417.
(57)
1. Способ получения соматического антигена Fasciola hepatica для диагностики фасциолеза крупного рогатого скота, заключающийся в том, что гомогенизируют половозрелых
фасциол Fasciola hepatica в течение 15-25 минут при 4-10 °С, гомогенат центрифугируют
при 5000 g в течение 20 минут, полученную надосадочную жидкость обрабатывают ультразвуком 35 кГц 5 раз по 1 минуте и разводят физиологическим раствором до концентрации 1,2 мг белка в 1 мл.
2. Способ диагностики фасциолеза крупного рогатого скота с помощью твердофазного
иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что анализ проводят с соматическим
антигеном Fasciola hepatica, полученным способом по п. 1, причем антиген разводят 0,15 М
карбонатно-бикарбонатным буфером pH 9,8, фиксируют в лунках иммунологического
планшета в течение 18-24 часов при 4 °С, отмывают 0,1 М фосфатным буфером pH 7,4,
содержащим 0,01 % Твин-20, причем используют буфер, приготовленный на дистиллированной воде, после чего вносят в отдельные лунки образец сыворотки крови или молока
здорового животного в качестве контроля и образец сыворотки крови или молока обследуемого животного в качестве опыта, инкубируют образцы 1 час при 37 °С, вносят в лунки пероксидазный конъюгат, содержащий антитела к IgG быка, и инкубируют 1 час при
37 °С, затем вносят хромогенный субстрат и инкубируют 8-10 минут, реакцию останавливают добавлением 3 М серной кислоты и определяют оптические плотности контрольного
и опытного образцов при 450 нм, при этом вывод о наличии фасциолеза у обследуемого
животного делают в случае, если оптическая плотность опытного образца превышает оптическую плотность контрольного в 1,5 раза или более.
BY 13934 C1 2010.12.30
Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии, в частности к ранней
иммунологической диагностике фасциолеза крупного рогатого скота.
Фасциолез является повсеместно распространенной инвазией. На территории Республики Беларусь инвазированность крупного рогатого скота фасциолезом в среднем в 20022005 гг. регистрировалась на уровне 15,27 %, в т.ч. коров - 17,89 % [1].
Болезнь часто протекает хронически и характеризуется воспалительными явлениями
желчных протоков, интерстициальными гепатитами, циррозами печени, общей интоксикацией организма и снижением молочной и мясной продуктивности животных [2].
В СНГ у крупного рогатого скота возбудителем фасциолеза являются сосальщики из
семейства Fasciolidae - фасциола обыкновенная (Fasciola hepatica) и фасциола гигантская
(Fasciola gigantica). На территории Республики Беларусь, в прилегающих странах Балтии,
Польше, Украине, центральной части Российской Федерации только один вид может вызывать заболевание животных и людей фасциолезом - фасциола обыкновенная [3].
На территории республики другие виды фасциол не регистрировались.
Хотя обычно естественными хозяевами при фасциолезе является крупный рогатый
скот и овцы, болезнь была зарегистрирована у лошадей, коз, свиней и других животных.
Болеет фасциолезом и человек. Случаи заболевания человека отмечены и на территории
Республики Беларусь.
Особенностью протекания фасциолеза является то, что на первых этапах заражения
трудно диагностировать болезнь, так как отсутствуют клинические признаки. Скрытый
период болезни продолжается не менее 5-6 недель. Позднее клиническая картина не позволяет ставить точный диагноз, так как симптомы, наблюдаемые при фасциолезе, не являются достаточно специфичными.
Копрологические методы постановки диагноза своей целью ставят обнаружение яиц
трематоды в кале животных. Однако развивающиеся в дефинитивном хозяине ювенильные формы F. hepatica не выделяют яиц, что приводит к невозможности копрологической
диагностики фасциолеза до развития половозрелых форм фасциол. Следует отметить, что
и при эктопической локализации паразита (чаще в органах желудочно-кишечного тракта,
реже в лимфоузлах, легких, сердце, кровеносных сосудах, под кожей и др.) также невозможно определение наличия инвазионного начала [4].
В связи с тем, что невозможно выявить больных животных на ранних стадиях заболевания, приходится применять лечебно-профилактические обработки ко всем животным в
поздние сроки, что увеличивает себестоимость сельскохозяйственной продукции.
Для выявления животных на начальных стадиях развития фасциол предложены ряд
серологических способов с помощью антигена, содержащего белок трематод.
Известен антиген, являющийся суспензией высушенных фасциол (F. hepatica), на физиологическом растворе применяемый для диагностики фасциолеза во внутрикожной аллергической пробе (ВАП) [5].
Для приготовления данного антигена фасциол первично высушивают, далее измельчают. Порошок экстрагируют в физрастворе.
Но недостатком данного антигена является то, что полученный антиген оказался низкочувствительным и низко-специфичным и позволяет выявлять не более 60 % инвазированных животных. Сушка антигена приводит к последующему низкому уровню закрепления
его на планшете. Также недостатком является то, что требуется фиксация животных при
введении антигена внутрикожно, а также повторная фиксация для учета реакции, что требует дополнительных людских затрат. Интервал времени, необходимый между введением
и учетом (1-3 часа) недостаточен для проведения массовых обследований большого поголовья животных, что также не позволяет использование его в производственных условиях.
2
BY 13934 C1 2010.12.30
Ближайшим аналогом, т.е. прототипом, можно считать способ получения антигена,
использующегося в иммуноферментном анализе (ИФА). Для получения данного антигена
используется смесь экскреторно-секреторных компонентов Fasciola hepatica, очищенная и
фракционированная на цианбромактивированной сефарозе. Антиген перед использованием растворяют в фосфатно-солевом буфере 1 : 10 [6].
Недостатком данного антигена является сложность его получения, включающая инкубирование фасциол, очистку и фракционирование на цианбромактивированной сефарозе,
что является дорогостоящей процедурой, значительно увеличивающей стоимость антигена и не позволяющей получать его в достаточных количествах. Также данный способ получения не позволяет нарабатывать его в больших объемах. Недостатком данного способа
является необходимость использования только сывороток крови обследуемых животных и
невозможность постановки диагноза с использованием молока от инвазированных животных. Взятие крови требует дополнительных людских затрат необходимых для фиксации
животных. Также эта процедура оказывает негативное действие на самих животных, способствуя возникновению стресса, что приводит у них к снижению продуктивности.
Известными способами получить предлагаемый антиген для диагностики фасциолеза
крупного рогатого скота нельзя.
Известны различные способы применения антигена для диагностики фасциолеза.
Известен способ диагностики фасциолеза крупного рогатого скота с помощью реакции непрямой гемагглютинации [7].
Принцип данного способа основан на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, способны агглютинироваться в присутствии
гомологичных антител или антигенов [8].
Для чего получают суспензию эритроцитов барана, отмывают физ. раствором, стабилизируют их 3 % раствором формалина, танизируют раствором танина для повышения сорбционной способности и осаждаемости, сенсибилизируют раствором антигена 1 : 1,5 [9].
Исследуемые сыворотки разводят (1:5-1:5120) нормальной сывороткой, разведенной
физраствором и вносят по 0,5 мл каждого разведения в луночки пластин, добавляют 0,025 мл
диагностикума. Реакцию учитывают спустя 2 часа по характеру осадка на дне лунок [10].
Недостатком данного способа, несмотря на его достаточно высокую эффективность
(80-100 %), является трудоемкость способа подготовки сенсибилизированных эритроцитов и других компонентов для реакции непрямой гемагглютинации. Недостатком данного
способа является необходимость использования только сывороток крови обследуемых
животных и невозможность постановки диагноза с использованием молока от инвазированных животных.
Ближайшим аналогом, т.е. прототипом, можно считать способ диагностики фасциолеза крупного рогатого скота с помощью непрямого неконкурентного твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) [11].
Этот способ включает в себя разведение очищенного антигена 1 : 10 в 0,05М фосфатно-солевом буфере с pH 7,2-7,4. При инкубировании в течение 1 часа при температуре
37 °С или 10-12 часов при температуре 4 °С проводится фиксация в лунках пластикового
планшета разведенного на фосфатно-солевом буфере белкового антигена. Отмывают фосфатно-солевым буфером с добавлением твина (ФСБТ) 0,05-0,1 %. Вносят в лунки исследуемые сыворотки крови 1:40-1:160. Повторно инкубируют в течение 1 часа при температуре
37 °С. Вносят пероксидазный конъюгат (антитела к IgG быка меченые пероксидазой хрена). Инкубируют планшет в течение 45 минут при температуре 37 °С и, промыв планшет,
определяют активность пероксидазы, входящей в состав конъюгата, с помощью хромогенного субстрата при длине волны 449 нм, остановив реакцию добавлением стопреагентом (1 н NaOH) после 15-30 минут инкубирования при комнатной температуре [12].
3
BY 13934 C1 2010.12.30
Недостатком данного способа диагностики является то, что планшет инкубируют на
начальном этапе 10-12 часов в холодильнике при 4 °С, столь короткий временной интервал не позволяет закрепиться полностью специфичным белкам антигена. Для разведения
антигена используется ФСБ 1 : 10, при использовании которого не достигается максимально возможного уровня закрепления белка на пластике и происходит большой расход
антигена. Для промывки планшета используется 0,05 М фосфатно-солевой буфер с pH 7,27,4, также раствор готовят с большой концентрации твина. Приготовление ФСБ с приведенными компонентами приводит к низкой буферной емкости полученного раствора, повышает его пенообразование, что понижает качество отмывки планшет (остатки пены на
планшете и т.д.) и ухудшает конечную диагностическую значимость теста. Ферментативная реакция хромогенного субстрата останавливается спустя 15-30 минут, добавлением
стоп-реагента (1 н NaOH), что удлиняет время постановки реакции и указывает на неоптимальные соотношения состава субстратной смеси. Добавление стоп-реагента с низкой
концентрацией NaOH не останавливает реакцию полностью, что вносит ошибку в результаты окончательного измерения оптической плотности. Также недостатком данного способа является то, что в качестве исследуемого материала используется только сыворотка
крови и не используется молоко обследуемых животных, так как предложенный в прототипе способ получения антигена не позволяет применить его для диагностики фасциолеза
с использованием молока (недостоверные результаты). Мероприятие, связанное с взятием
крови от исследуемых животных, требует дополнительных людских затрат, необходимых
для фиксации крупного рогатого скота. Взятие крови оказывает негативное действие на
самих животных, способствуя возникновению стресса, что приводит у них к снижению
продуктивности.
Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является создание
дешевого, более эффективного способа получения и применения антигена для диагностики фасциолеза крупного рогатого скота, позволяющей диагностировать болезнь на
начальных этапах развития заболевания.
Поставленная задача способа получения соматического антигена Fasciola hepatica для
диагностики фасциолеза крупного рогатого скота, достигается тем, что гомогенизируют
половозрелых фасциол Fasciola hepatica в течение 15-25 минут при 4-10 °С, гомогенат
центрифугируют при 5000 g в течение 20 минут, полученную надосадочную жидкость обрабатывают ультразвуком 35 кГц 5 раз по 1 минуте и разводят физиологическим раствором до концентрации 1,2 мг белка в 1 мл.
Кроме того, в способе диагностики фасциолеза крупного рогатого скота с помощью
твердофазного иммуноферментного анализа, анализ проводят соматическим антигеном
Fasciola hepatica, полученным способом по п. 1, причем антиген разводят 0,15 М карбонатно-бикарбонатным буфером pH 9,8, фиксируют в лунках иммунологического планшета
в течение 18-24 часов при 4 °С, отмывают 0,1 М фосфатным буфером pH 7,4, содержащим
0,01 % Твин-20, причем используют буфер, приготовленный на дистиллированной воде,
после чего вносят в отдельные лунки образец сыворотки крови или молока здорового
животного в качестве контроля и образец сыворотки крови или молока обследуемого животного в качестве опыта, инкубируют образцы 1 час при 37 °С, вносят в лунки пероксидазный конъюгат, состоящий антитела к IgG быка, и инкубируют 1 час при 37 °С, затем
вносят хроматогенный субстрат и инкубируют 8-10 минут, реакцию останавливают добавлением 3 М серной кислоты и определяют оптические плотности контрольного и
опытного образцов при 450 нм, при этом вывод о наличии фасциолеза у обследуемого животного делают в случае, если оптическая плотность опытного образца превышает оптическую плотность контрольного в 1,5 раза и более.
4
BY 13934 C1 2010.12.30
Способ получения антигена для диагностики фасциолеза
Для приготовления антигена половозрелых фасциол 5-6 раз отмывают в физиологическом растворе. Фасциол гомогенизируют в течение 15-25 мин при 4-10 °С, гомогенат центрифугируют при 5000 g в течение 20 минут. Далее полученный раствор подвергают
ультразвуковой дезинтеграции на УЗДН-1 при 35 кГц 5 раз по 1 минуте.
Содержание белка в антигене определяют методом осаждения ТХУ и спектрофотометрии при 540 нм.
Доводят содержание белка в полученном растворе до 1,2 мг/мл (физиологическим раствором).
Готовят рабочее разведение антигена для иммобилизации панелей (разводят антиген
1 : 100 до концентрации белка 12 мкг/мл). Антиген разводят на карбонатно-бикарбонатном буфере pH = 9,8 (0,15 М).
Способ диагностики фасциолеза крупного рогатого скота
(Непрямая гетерогенная твердофазная модификация ИФА)
В лунки иммунологического планшета вносят 0,1 мл антигена, разведенного 0,15 М
КББ pH 9,8. Планшет с антигеном инкубировали 18-24 ч при 4 °С, после этого удаляют
избыток антигена пятикратной отмывкой ФСБТ (0,1 М фосфатный буфер на бидистиллированной воде, 0,05 % твин-20, pH 7,4). Вносят в лунки 0,1 мл сыворотки крови (разведение 1 : 100) или молока (разведение 1 : 25) в растворе ФСБ (0,1 М фосфатный буфер на
бидистиллированной воде, pH 7,4). Инкубируют 1 ч при 37 °С, промывают лунки ФСБТ и
добавляют 0,05 мл меченных пероксидазой антител к IgG крупного рогатого скота в
растворе ФСБ. Через 1 ч инкубации отмывают планшет ФСБТ и вносят в лунки 0,05 мл
субстратного раствора перекиси водорода с ортофенилендиамином (ОФД). Инкубируют
10 минут при комнатной температуре и останавливают реакцию добавлением 0,1-0,15 мл
3 М H2SO4. Интенсивность окраски в лунках определяют на спектрофотометре при 450 нм
(A450).
Превышение оптической плотности исследуемого образца над контролем (S/N) в 1,5 и
более раз свидетельствует об инвазировании крупного рогатого скота фасциолами - больное животное.
Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение антигена
Получили комплекс антигенов двух видов (соматический и экскреторно-секреторный)
из половозрелых фасциол.
Исходный материал (трематода F. hepatica) отобрали из печеней при убое больных
фасциолезом животных на мясокомбинате. Полученные трематоды 5-6 раз отмывали в
физиологическом растворе.
1. Для получения экскреторно-секреторных антигенов, отмытые фасциолы F. hepatica
сразу после сбора на мясокомбинате поместили в физиологический раствор (37 °С) и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С. Полученный раствор профильтровали и отцентрифугировали при 5000 g в течение 40 мин.
2. Для получения 1 серии соматических антигенов трематоды гомогенизировали на
гомогенизаторе в течение 15-25 мин при 4-10 °С. Гомогенат центрифугировали при 5000 g
в течение 20 мин. Далее полученный раствор подвергли ультразвуковой дезинтеграции на
УЗДН-1 при 35 кГц 5 раз по 1 минуте.
3. Для получения 2 серии соматических антигенов трематоды гомогенизировали на
гомогенизаторе в течение 5-10 мин при 4-10 °С. Гомогенат центрифугировали при 5000 g
в течение 20 мин. Далее полученный раствор подвергли ультразвуковой дезинтеграции на
УЗДН-1 при 35 кГц 5 раз по 1 минуте. После ультразвуковой дезинтеграции осуществили
концентрирование на мембране с порогом разделения 100±10 кДа).
5
BY 13934 C1 2010.12.30
4. Для получения 3 серии соматических антигенов трематоды гомогенизировали на
гомогенизаторе в течение 15-25 мин при 37 °С. Далее полученный раствор подвергли ультразвуковой дезинтеграции на УЗДН-1 при 35 кГц 5 раз по 1 минуте. Гомогенат центрифугировали при 10000 g в течение 20 мин. Надосадочную жидкость подвергли очистке
аффинной хроматографией.
Содержание белка в обоих полученных образцах определили методом осаждения ТХУ
и спектрофотометрии при 540 нм.
Пример 2. Испытание приготовленных серий антигенов в реакции иммуноферментного анализа с сыворотками крови животных при фасциолезе крупного рогатого скота.
Поставили ИФА (непрямая гетерогенная твердофазная модификация ИФА) с полученными антигенами.
Результаты исследований.
Таблица 1
Испытание приготовленных 4 серий антигенов
в реакции иммуноферментного анализа с сыворотками крови
и молоком животных при фасциолезе крупного рогатого скота
Используемая
серия антигена
Экскреторный антиген
1 серия соматического
антигена
2 серия соматического
антигена
3 серия соматического
антигена
Среднее превышение
Стандартное отклонение
оптической плотности поло- среднего превышения оптичежительной над отрицательной
ской плотности
сыворотки
сыворотки
молока
молока
крови
крови
1,14
0,91
0,35
0,27
1,62
1,58
0,17
0,16
1,37
1,20
0,12
0,21
1,28
0,98
0,15
0,24
Таким образом, 2 серия соматического антигена показала наиболее приемлемые результаты для дальнейшего использования его в ИФА с последующей оптимизацией параметров постановки для увеличения его диагностической значимости.
Пример 3. Оптимизация параметров постановки ИФА для увеличения его диагностической эффективности
3.1. Испытание использования различных составов буферных растворов.
Были приготовлены различные композиции КББ и ФСБ:
КББ: 0,05 М, с pH 9,4; 0,05 М, с pH 9,6; 0,05 М, с pH 9,8; 0,05 М, с pH 10,0; 0,1 М,
с pH 9,4; 0,1 М, с pH 9,6; 0,1 М, с pH 10,0; 0,15 М, с pH 9,4; 0,15 М, с pH 10,0; 0,2 М,
с pH 9,4; 0,2 М, с pH 9,6; 0,2 М, с pH 10,0;
ФСБТ: 0,01 М; 0,15 М; 0,20 М с pH 7,4, данные растворы ФСБ приготавливались в
нескольких сериях:
1. На бидистиллированной воде с добавлением 0,025, 0,05, 0,1, 0,15 0,2 % твин-20.
2. На физ. растворе с добавлением 0,025, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 % твин-20.
Наиболее высокие показатели среднего превышения оптической плотности положительной над отрицательной сывороткой (в 2 раза и более) были получены при сочетании
следующих буферов: КББ 0,15 М, с pH 9,8; ФСБТ 0,1 М фосфатный буфер на бидистиллированной воде, 0,05 % твин-20, pH 7,4.
6
BY 13934 C1 2010.12.30
3.2 Испытание различного времени закрепления белка на планшете.
Провели серию опытов с различным временем инкубирования планшета на начальном
этапе при 4 °С.
Планшеты инкубировали 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24, 26, 28 ч.
Установлено, что при инкубировании планшета в течение 10 часов результаты исследований резко снижались (превышение оптической плотности положительной над отрицательной сывороткой 1,3-1,4 раза), тогда как при более длительной инкубации 26-28 часа
наблюдались схожие результаты (превышение оптической плотности положительной над
отрицательной сывороткой в 2 раза и более).
Установлено, что наиболее оптимальное закрепление белка на планшете происходит
при инкубировании планшета с антигеном в течение 18-24 часов (превышение оптической
плотности положительной над отрицательной сывороткой в 2 раза и более).
3.3 Испытание различных способов остановки ферментативной реакции.
Провели серию опытов по остановке ферментативной реакции, добавлением серной
кислоты в различных количествах (0,025, 0,05, 0,10, 0,15) и концентрации (1 М, 2 М, 3 М, 4 М).
В результате исследований установлено, что полная остановка реакции происходит
при добавлении 0,1-0,15 мл 3 М серной кислоты через 8-10 минут.
Таким образом, были подобраны этапы и компоненты для приготовления антигена из
половозрелых фасциол предназначенного для ранней диагностики фасциолеза крупного
рогатого скота в ИФА по исследованию сывороток крови или молока обследуемых животных.
Использование соматического антигена фасциол и инкубирование планшета с антигеном на начальном этапе 18-24 часа позволяет достигнуть необходимой степени закрепления полученного антигена на планшете в отличие от антигена, полученного в прототипе.
Использование для разведения карбонатно-бикарбонатного буфера 0,15 М и pH 9,8 позволяет достигать максимально возможного уровня закрепления антигена на планшете по
сравнению с прототипом, где используется 0,05 М фосфатно-солевой буфер с pH 7,2-7,4.
Промывание планшета фосфатно-солевым буфером 0,1 М, содержащим 0,01 % Твин-20,
на дистиллированной воде не повышает его пенообразование, что позволяет достигнуть
оптимального качества отмывки планшет и способствует повышению конечной диагностической значимости теста, в отличие от прототипа 0,05 М фосфатно-солевого буфера с
pH 7,2-7,4, содержащего 150 mM хлористого натрия и 0,05-0,1 % Твина-20, который
оставляет остатки пены на планшете. Остановка реакции через 8-10 минут путем добавления серной кислоты в объеме 0,10-0,15 мл 3 М, на 5-20 минут сокращает время ферментативной реакции по сравнению с прототипом и позволяет полностью остановить
ферментативную реакцию и недопустить погрешность возникающую в способе, описанном в прототипе при использовании 1 н NaOH. Использование в качестве исследуемого
материала не только сыворотки крови, как в прототипе, но и молока обследуемых животных позволяет избежать дополнительных людских затрат необходимых для фиксации
крупного рогатого скота и позволяет избежать взятия крови, которое оказывает негативное действие на самих животных, способствуя возникновению стресса, что приводит у
них к снижению продуктивности.
Использование вышеуказанных параметров в их совокупности позволило подобрать
наиболее оптимальные этапы приготовления антигена из половозрелых фасциол для ранней диагностики фасциолеза крупного рогатого скота и способа диагностики фасциолеза
крупного рогатого скота позволяющего выявлять инвазированных животных на начальных этапах развития заболевания.
7
BY 13934 C1 2010.12.30
Источники информации:
1. Якубовский М.В. Методические рекомендации. Фасциолез крупного рогатого скота
(эпизоотология, иммунитет, иммунодиагностика и меры борьбы) / М.В.Якубовский,
Т.Я.Мясцова, С.И.Лавор, Н.Ю.Дурова, И.А.Трус. Утв. ГУВ МСХП 05.09.2006 г.
№ 10-1-5884.- Мн. - 2007. - С. 6.
2. Скрябин К.И. Краткий курс паразитологии домашних животных: Учебное пособие
для с.-х. техникумов/ К.И.Скрябин, А.М.Петров, И.О.Орлов и др.; под ред. Скрябина К.И.Москва: Гос. изд-во с.-х. лит., 1950. - С. 214-224.
3. Ятусевич А.И. Паразитология и инвазионные болезни животных / А.И.Ятусевич,
Н.Ф.Карасев, М.В.Якубовский - Минск: ИВЦ Минфина, 2007. - С. 56-64.
4. Dalton, J.P. Fasciolosis / Dalton, J.P. (Ed.), CAB International Publishing, Wallingford,
1999. - 544 p.
5. Демидов Н.В. Фасциолез / Н.В.Демидов // Итоги науки и техн. ВИНИТИ АН СССР.
Сер. Зоопаразитология. - Москва, 1979. - Т. 6. - С. 48.
6. Онуфриенко М.Э. Фасциолез крупного рогатого скота в Северо-Западном регионе
России: дис. … д-ра вет.: 03.00.19; 16.00.04 / М.Э.Онуфриенко. - СПб, 2004. - С. 67-87
(прототип).
7. Онуфриенко М.Э. Фасциолез крупного рогатого скота в Северо-Западном регионе
России: дис. … д-ра вет.: 03.00.19; 16.00.04 / М.Э. Онуфриенко. - СПб, 2004. - С. 81-85.
8. Практикум по вирусологии / Под редакцией В.М.Жавненко - Мн.: ДизайнПРО,
1998. - 144 с.: ил.
9. Онуфриенко М.Э. Фасциолез крупного рогатого скота в Северо-Западном регионе
России: дис. … д-ра вет.: 03.00.19; 16.00.04 / М.Э.Онуфриенко. - СПб, 2004. - С. 81-85.
10. Онуфриенко М.Э. Фасциолез крупного рогатого скота в Северо-Западном регионе
России: дис. … д-ра вет.: 03.00.19; 16.00.04 / М.Э.Онуфриенко. - СПб, 2004. - С. 81-85.
11. Онуфриенко М.Э. Фасциолез крупного рогатого скота в Северо-Западном регионе
России: дис. … д-ра вет.: 03.00.19; 16.00.04 / М.Э.Онуфриенко. - СПб, 2004. - С. 85-86
(прототип).
12. Онуфриенко М.Э. Фасциолез крупного рогатого скота в Северо-Западном регионе
России: дис. … д-ра вет.: 03.00.19; 16.00.04 / М.Э.Онуфриенко. - СПб, 2004. - С. 85-86.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
129 Кб
Теги
by13934, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа