close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY13984

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.02.28
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/483
G 01N 21/64
B 82B 1/00
СПОСОБ ВИЗУАЛИЗАЦИИ IN VITRO КЛЕТОК СЕЛЕЗЕНКИ,
КОСТНОГО МОЗГА ИЛИ АСЦИТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ,
ОБРАЗУЮЩЕЙСЯ ПРИ ВНУТРИБРЮШИННОМ РАЗВИТИИ
КАРЦИНОМЫ ЭРЛИХА ИЛИ ГЕПАТОМЫ 22А У МЫШИ
(21) Номер заявки: a 20090269
(22) 2009.02.26
(43) 2010.10.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт физиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Терпинская Татьяна Ильинична; Яшин Константин Дмитриевич; Осипович Виталий Семенович;
Артемьев Михаил Валентинович;
Лемеш Ренальд Григорьевич; Кульчицкий Владимир Адамович (BY)
BY 13984 C1 2011.02.28
BY (11) 13984
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт физиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(56) ЯШИН К.Д. и др. Нано- и микросистемная техника. - 2008. - № 12. - С. 48-52.
ЯШИН К.Д. и др. Доклады БГУИР. 2008. - № 2. - С. 72-78.
RU 2342654 C1, 2008.
US 2007/0059775 A1.
RU 2343828 C2, 2009.
УЛАЩИК В.С. Здравоохранение. 2009. - № 2. - С. 4-10.
(57)
Способ визуализации in vitro клеток селезенки, костного мозга или асцитической жидкости, образующейся при внутрибрюшинном развитии карциномы Эрлиха или гепатомы
22а у мыши, заключающийся в том, что готовят суспензии живых клеток селезенки, костного мозга или опухолевого асцита животного в физиологическом растворе, контролируя
жизнеспособность клеток пробой с трипановым синим, готовят суспензию наночастиц
CdSe/ZnS со стабилизирующим тиольным покрытием, состоящим из 70-80 % меркаптопропионовой кислоты и 20-30 % тиоглицерина, в дистиллированной воде с концентрацией
наночастиц 3,0 мг/мл или в 0,9 %-ном водном растворе NaHCO3 или NaCl с концентрацией наночастиц 0,3-0,75 мг/мл, смешивают суспензию живых клеток с суспензией наночастиц в дистиллированной воде в соотношении 1:1 или с суспензией наночастиц в 0,9 %ном водном растворе NaHCO3 или NaCl в соотношении 1:4, инкубируют при температуре
20-37 °С в течение 30-60 минут, готовят прижизненные препараты типа "раздавленная
капля" и анализируют их на флюоресцентном микроскопе, при этом для возбуждения
флюоресценции используют осветитель на светодиоде с максимумом излучения на длине
волны 470 нм, для наблюдения и регистрации флюоресценции используют систему
PLOEMOPAK с полосовыми фильтрами возбуждения 370-490 нм и эмиссии 520-700 нм,
осуществляют визуальный анализ препаратов и полученных с помощью цифровой камеры
снимков.
Изобретение относится к биологии и медицине.
BY 13984 C1 2011.02.28
Известен способ привитальной визуализации клеток с помощью полупроводниковых
нанокристаллов с тиольным покрытием. Он заключается в обработке клеток in vitro или
in vivo наночастицами, которые проникают в клетки или присоединяются к клеточной
мембране, вследствие чего клетки светятся при облучении их возбуждающим светом. В
частности, используют наночастицы с ядром Cd/Se, эпитаксильной пленкой Zn/S и пассивирующим покрытием из меркаптоуксусной кислоты, конъюгированной с бычьим сывороточным
альбумином [1]. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому.
Общим признаком для заявляемого способа и прототипов является использование
флюоресцентных наночастиц с тиольным покрытием для привитальной визуализации клеток.
Однако проблемой способа является конгломерация наночастиц в физиологических
растворах и жидкостях в присутствии входящих в их состав двухвалентных катионов
(например, Mg2+ и Ca2+) [2], что ведет к ухудшению проникновения наночастиц в клетки
и снижению качества окрашивания.
Задачей заявляемого способа является улучшение качества визуализации за счет использования наночастиц, обладающих меньшей склонностью к агрегации в физиологических растворах. Это улучшает результаты окрашивания и визуализации.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ визуализации in vitro
клеток селезенки, костного мозга или асцитической жидкости, образующейся при внутрибрюшинном развитии карциномы Эрлиха или гепатомы 22а у мыши, заключающийся в
том, что готовят суспензии живых клеток селезенки, костного мозга или опухолевого асцита животного в физиологическом растворе, контролируя жизнеспособность клеток пробой с трипановым синим, готовят суспензию наночастиц CdSe/ZnS со стабилизирующим
тиольным покрытием, состоящим из 70-80 % меркаптопропионовой кислоты и 20-30 %
тиоглицерина, в дистиллированной воде с концентрацией наночастиц 3 мг/мл на дистиллированной воде или в 0,9 %-ном водном растворе NaHCO3 или NaCl с концентрацией
наночастиц 0,3-0,75 мг/мл, смешивают суспензию живых клеток с суспензией наночастиц
в дистиллированной воде в соотношении 1:1 или с суспензией наночастиц в 0,9 %-ном
водном растворе NaHCO3 или NaCl в соотношении 1:4, инкубируют при температуре 2037 °С в течение 30-60 мин, готовят прижизненные препараты типа "раздавленная капля" и
анализируют их на флюоресцентном микроскопе, при этом для возбуждения флюоресценции используют осветитель на светодиоде с максимумом излучения на длине волны 470
нм, для наблюдения и регистрации флюоресценции используют систему PLOEMOPAK с
полосовыми фильтрами возбуждения 370-490 нм эмиссии 520-700 нм, осуществляют визуальный анализ препаратов и полученных с помощью цифровой камеры снимков.
Стерическое расположение функциональных групп покрытия в наночастицах предлагаемой конструкции способствует большей устойчивости частиц к агрегации в физиологических растворах.
Способ визуализации осуществляют следующим образом.
Получают суспензию живых клеток. Клетки должны находиться в физиологическом
растворе или культуральной среде для сохранения их жизнеспособности. Жизнеспособность клеток контролируют пробой с трипановым синим.
Готовят суспензию нанокристаллов для визуализации. В качестве базового элемента
люминесцентной системы, построенной с применением нанокристаллов, используют наночастицы CdSe/ZnS со стабилизирующим тиольным покрытием, состоящим из 70-80 %
меркаптопропионовой кислоты и 20-30 % тиоглицерина. Максимум интенсивности фотолюминесценции наночастиц приходится на длину волны 560-580 нм. Фотолюминесценция
может быть вызвана возбуждающим светом широкого спектра - от ультрафиолетовой до
видимой части светового излучения (от 300 до 600 нм). Суспензию нанокристаллов готовят на дистиллированной воде, водном растворе 0,9 % NaHCO3 или 0,9 % NaCl. К суспензии клеток добавляют суспензию наночастиц, клетки инкубируют в течение 30-60 мин
при температуре 20-37 °С. Для просмотра клеточных суспензий готовят прижизненные
препараты типа "раздавленная капля" и анализируют их на флюоресцентном микроскопе.
2
BY 13984 C1 2011.02.28
Пример 1.
Для получения клеточных суспензий используют асцитическую жидкость, образующуюся при внутрибрюшинном развитии карциномы Эрлиха, перевиваемой на мышах линии Af. Отбирают из брюшной полости животного асцит с находящимися в нем клетками.
Добавляют к суспензии клеток суспензию наночастиц в соотношении 1:1. Концентрация
суспензии наночастиц - 3 мг/мл. Растворитель - дистиллированная H2O. Время окрашивания составляет 30-60 мин при температуре 20 °С. Для просмотра клеточных суспензий готовят прижизненные препараты типа "раздавленная капля", затем анализируют на
люминесцентном микроскопе Leitz MPV-2 с объективами 25х, 40х, 100х. Для наблюдения
и регистрации флуоресценции используют систему PLOEMOPAK с полосовыми фильтрами возбуждения и эмиссии 370-490 и 520-700 нм соответственно. Для возбуждения
флуоресценции используют осветитель на сверхъярком светодиоде с максимумом излучения на длине волны 470 нм. Снимки делают цифровой камерой Leica DC300 F под управлением программного комплекса Leica IM1000.
На фиг. 1 представлены окрашенные клетки асцитической жидкости, образующейся
при внутрибрюшинном росте карциномы Эрлиха у мышей, для окраски использован раствор нанокристаллов на дистиллированной воде. Количество клеток опухолевого асцита,
окрасившихся наночастицами, составило 4-13 % в разных препаратах. Наночастицы проникли через клеточную мембрану и внедрились внутрь клеток. В воспринявших наночастицы клетках хорошо различается ядро (очень яркое в случае проникновения наночастиц,
или, наоборот, более темное, чем цитоплазма), люминесценция ядра часто неравномерна,
иногда наблюдается более яркая тонкая полоска по контуру ядра, возможно, вследствие
оседания наночастиц на ядерной оболочке; заметна яркая или темная зернистость в цитоплазме. На многих клетках заметно оседание наночастиц на мембране.
Пример 2.
Для получения клеточных суспензий используют асцитическую жидкость, образующуюся при внутрибрюшинном развитии карциномы Эрлиха, перевиваемой на мышах линии Af. Отбирают из брюшной полости животного асцит с находящимися в нем клетками.
Готовят суспензию наночастиц на 0,9 % NaCl. Концентрация суспензии наночастиц 0,75 мг/мл. Разводят с асцитом в соотношении 4 части окрашивающей суспензии: 1 часть
асцита с клетками. Время окрашивания составляет 30-60 мин при температуре 20 °С.
Анализ препаратов проводят методами, описанными в примере 1.
На фиг. 2 представлены окрашенные клетки асцитической жидкости, образующейся
при внутрибрюшинном росте карциномы Эрлиха у мышей, для окраски использован раствор нанокристаллов на 0,9 % NaCl. Количество клеток опухолевого асцита, окрасившихся наночастицами, составило 8,76 ± 1,45 %. Описание препаратов аналогично примеру 1;
заметны некоторые слабо окрашенные клетки, возможно, вследствие оседания некоторого
количества нанокристаллов на мембранах.
Пример 3.
Для получения клеточных суспензий используют асцитическую жидкость, образующуюся при внутрибрюшинном развитии карциномы Эрлиха, перевиваемой на мышах линии Af. Отбирают из брюшной полости животного асцит с находящимися в нем клетками.
Готовят суспензию наночастиц на 0,9 % NaHCO3. Концентрация суспензии наночастиц 0,75 мг/мл. Разводят с асцитом в соотношении 4 части окрашивающей суспензии: 1 часть
асцита с клетками. Время окрашивания составляет 30 мин при температуре 20 °С. Анализ
препаратов проводят методами, описанными в примере 1.
На фиг. 3 представлены окрашенные клетки асцитической жидкости, образующейся
при внутрибрюшинном росте карциномы Эрлиха у мышей, для окраски использован раствор нанокристаллов на 0,9 % NaHCO3. Количество клеток опухолевого асцита, окрасившихся
наночастицами, составило 15,21 ± 2,17 %. Описание препаратов аналогично примеру 1, но
конгломерации частиц не наблюдается, очень четкая визуальная картина.
3
BY 13984 C1 2011.02.28
Пример 4.
Для получения клеточных суспензий используют асцитическую жидкость, образующуюся при внутрибрюшинном развитии гепатомы 22а, перевиваемой на мышах линии Af.
Отбирают из брюшной полости животного асцит с находящимися в нем клетками. Готовят
суспензию наночастиц на 0,9 % NaHCO3. Концентрация суспензии наночастиц - 0,3 мг/мл.
Разводят с асцитом в соотношении 4 части окрашивающей суспензии: 1 часть асцита с
клетками. Время окрашивания составляет 1 ч при температуре 37 °С. Анализ препаратов
проводят методами, описанными в примере 1.
На фиг. 4 представлены окрашенные клетки асцитической жидкости, образующейся
при внутрибрюшинном росте гепатомы 22а у мышей, для окраски использован раствор
нанокристаллов на 0,9 % NaHCO3. Количество клеток опухолевого асцита, окрасившихся
наночастицами, составило 18,86 ± 2,07 %. Описание препаратов аналогично примеру 3.
Пример 5.
Для получения клеточных суспензий используют костный мозг мыши линии Af. Для
получения клеток костного мозга животное забивают, осторожно извлекают кости бедра и
голени, отделяя их от мышечной ткани, срезают эпифизы, промывают из шприца с тонкой
иглой физиологическим раствором Эрла, вымывая костный мозг; пропускают через сито,
продавливая стеклянным пестиком костномозговую ткань и смывая клетки физиологическим раствором. Суспензию центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин, жидкость сливают,
клетки ресуспензируют в физиологическом растворе. Готовят суспензию наночастиц на
0,9 % NaHCO3. Концентрация суспензии наночастиц - 0,3 мг/мл. Разводят с суспензией
клеток костного мозга в соотношении 4 части окрашивающей суспензии: 1 часть клеточной суспензии. Время окрашивания составляет 30 мин при температуре 20 °С. Анализ
препаратов проводят методами, описанными в примере 1.
На фиг. 5 представлены окрашенные клетки костного мозга мышей, для окраски использован раствор нанокристаллов на 0,9 % NaHCO3. Наблюдалось окрашивание всех клеток
костного мозга. Тип и интенсивность окрашивания значительно отличаются в разных клетках: в некоторых ярко люминесцирует мембрана, в других - ядро или цитоплазматическая
зернистость, часто наблюдается слабое свечение цитоплазмы клетки и более темное ядро
(возможно, вследствие проникновения частиц в цитоплазму или оседания их на мембране).
Пример 6.
Для получения клеточных суспензий используют селезенку мыши линии Af. Для получения суспензий клеток селезенки животное забивают, вскрывают брюшную полость,
извлекают, не повреждая, селезенку, ополаскивают физиологическим раствором, измельчают
ножницами, а затем продавливают через сито стеклянным пестиком, смывая клетки в пробирку физиологическим раствором. Суспензию центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин,
жидкость сливают, клетки ресуспензируют в физиологическом растворе. Готовят суспензию наночастиц на 0,9 % NaHCO3. Концентрация суспензии наночастиц - 0,3 мг/мл. Разводят
суспензию нанокристаллов с суспензией клеток костного мозга в соотношении 4 части
окрашивающей суспензии: 1 часть клеточной суспензии. Время окрашивания составляет
30 мин при температуре 20 °С. Анализ препаратов проводят методами, описанными в
примере 1.
На фиг. 6 представлены окрашенные клетки селезенки мышей, для окраски использован раствор нанокристаллов на 0,9 % NaHCO3. Наблюдалось окрашивание 15,5 % клеток
селезенки. Тип и интенсивность окрашивания отличаются в разных клетках.
Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ
позволяет снизить степень конгломерации полупроводниковых наночастиц в физиологических растворах и достигнуть более качественной окраски клеток. Данный способ может
найти ее применение в биологии и медицине.
4
BY 13984 C1 2011.02.28
Источники информации:
1. Gao X, Chan WCW, Nie S. Quantum-dot nanocrystals for ultrasensitive biological labeling
and multicolor optical encoding. Journal of Biomedical Optics. - 2002. - V. 7. - No. 4. - P. 532-537.
2. Zhang Y., Chen Y., Westerhoff P., Crittenden J. C. Stability and removal of water soluble
CdTe quantum dots in water. Environ Sci Technol. - 2008. - V. 42. - No. 1. - P. 321-325.
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
5
BY 13984 C1 2011.02.28
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
3 485 Кб
Теги
by13984, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа