close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14007

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.02.28
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 9/04
C 12N 1/14
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗООКСИДАЗЫ
(21) Номер заявки: a 20081144
(22) 2008.09.05
(43) 2010.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Михайлова Раиса Владимировна; Семашко Татьяна Владимировна; Лобанок Анатолий Георгиевич (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное научное учреждение "Институт
микробиологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
BY 14007 C1 2011.02.28
BY (11) 14007
(13) C1
(19)
(56) RU 2170762 С2, 2001.
СУХАЧЕВА М.В. и др. Прикладная
биохимия и микробиология. - 2004. Т. 40. - № 1. - С. 32-36.
SU 631530, 1978.
СЕМАШКО Т.В. Селекция Penicillium
funiculosum - продуцента глюкозооксидазы, биосинтез и свойства фермента. Автореферат диссертации. - Минск,
2006. - С. 3-4, 6-7.
ЦИРКУНОВА Ж.Ф. Глюкозооксидазы
Penicillium adametzii и Penicillium funiculosum: биосинтез и свойства. Автореферат диссертации. - Минск, 2004. С. 4, 14.
МИХАЙЛОВА Р.В. и др. Прикладная
биохимия и микробиология. - 2002. Т. 38. - № 3. - С. 273-277.
(57)
Способ получения глюкозооксидазы, включающий внесение посевного материала
гриба Penicillium funiculosum в питательную среду, глубинное культивирование в условиях аэрации и последующее отделение культуральной жидкости, содержащей глюкозооксидазу, от биомассы гриба, отличающийся тем, что посевной материал Penicillium
funiculosum выращивают на агаризованной среде Чапека, содержащей 0,005-0,01 % рибофлавина, а глубинное культивирование проводят на питательной среде, содержащей,
мас. %:
сахарозу
6,0
KNO3
2,0
KCl
0,05-0,1
KH2PO4
0,1
MgSO4
0,05
H3BO4
0,001
MnSO4
0,001
ZnSO4
0,0001
CoCl2
0,00005
Na2MoO4
0,00005
CuSO4
0,00005
воду
остальное,
причем исходный pH среды составляет 5,0-5,2.
BY 14007 C1 2011.02.28
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способам получения путем
микробиологического синтеза внеклеточных глюкозооксидаз, которые широко применяются в медицине в качестве реагента для энзиматического метода определения глюкозы в
биологических жидкостях, в химической промышленности для получения глюконовой
кислоты и глюконатов, в пищевой промышленности как антиоксидант и консервант.
Известно, что продуцентами внеклеточных глюкозооксидаз являются грибы родов
Penicillium и Aspergillus. Однако глюкозооксидазы, синтезируемые грибами рода Penicillium, имеют более высокое сродство к β-D-глюкозе, чем аналогичные ферменты различных
штаммов грибов рода Aspergillus. Так, для глюкозооксидаз рода Aspergillus значение константы Михаэлиса (Km) равно 23,7-37,0 миллимоль, а для глюкозооксидаз грибов рода
Penicillium - 3,3-19,0 миллимоль.
Известен способ получения внутриклеточной глюкозооксидазы из мицелиального
гриба Penicillium pinophilum [1]. Недостатками этого способа являются необходимость постоянного поддержания pH среды на уровне 6,5 при культивировании гриба, синтез им
внутриклеточного фермента и, как следствие, сложность и трудоемкость процесса очистки глюкозооксидазы.
Известен способ образования глюкозооксидазы Penicillium vitale Pidopi. et Bilai при
поверхностном выращивании [2] и "Способ выделения глюкозооксидазы из культуральной жидкости продуцента Penicillium vitale Pidopi. et Bilai" [3], предусматривающий отделение мицелия, введение каолина в культуральную жидкость и отделение вместе с ним
сорбированной на нем каталазы и извлечение глюкозооксидазы из полученного раствора
осаждением спиртом и сушкой целевого продукта. Недостатками данных способов являются: 1) поверхностный способ культивирования, сопровождающийся загрязнением воздуха рабочей зоны спорами гриба и, вследствие этого, повышением уровня заболеваемости персонала болезнями верхних дыхательных путей [4], 2) наличие в культуральной
жидкости гриба более 50 % балластных белков (в том числе и каталазы) и нерастворимых
веществ, усложняющих процесс очистки фермента.
Известен способ получения глюкозооксидазы на основе штамма Penicillium variabile
P16 в условиях глубинного культивирования [5, 6]. Недостатком данного способа является
необходимость поддержания определенного уровня pH питательной среды путем введения в среду нерастворимой соли (CaCO3), необходимость поддержания при культивировании высокой температуры (28 °С), что делает процесс энергоемким, низкий выход
целевого продукта и образование при выращивании гриба сопутствующего фермента внеклеточной каталазы, затрудняющей процесс очистки глюкозооксидазы.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является
"Способ получения внеклеточной глюкозооксидазы" на основе Penicillium funiculosum
KM МГУ 433 [7, 8]. Данный способ предусматривает культивирование продуцирующего
микроорганизма P. funiculosum КМ МГУ 433 на питательной среде (исходный pH 6,8-6,9),
содержащей: источники углерода (сахарозу 8-12 %) и азота (нитрат калия 1-4 %), минеральные соли и микроэлементы. Посевной материал выращивают в пробирках на суслоагаре. Засев производят спорами гриба, используя культуру 3-8-недельного возраста. Гриб
выращивают в колбах на качалке с 180 об/мин при 15-26 °С в течение 5 суток. Уровень
образования глюкозооксидазы, синтезируемой наиболее активным продуцентом
P. funiculosum КМ МГУ 433, составляет 152 ед/мл культуральной жидкости (по методике
Bergmeyer [9]) или 11 ед/мг внеклеточного белка.
Недостатками данного способа являются:
использование для выращивания посевного материала и хранения культуры суслоагара - питательной среды, содержащей большое количество углеводов, что может привести к нестабильности гриба вследствие гетерокариоза;
2
BY 14007 C1 2011.02.28
выращивание гриба при высоком исходном значении pH среды (6,8-6,9) и конечном
pH (5,0), что может создавать условия для контаминации бактериальной инфекцией;
длительность культивирования гриба (120 ч), что удорожает процесс;
низкая удельная активность синтезируемой глюкозооксидазы (11 ед/мг белка), что
свидетельствует об образовании в процессе культивирования большого количества балластных белков, затрудняющих процесс очистки глюкозоокисляющего фермента.
Задачей предлагаемого изобретения является стабилизация культур продуцентов, повышение выхода целевого продукта и упрощение процесса его получения.
Поставленная задача решается путем выращивания штаммов Penicillium funiculosum
для получения посевного материала на агаризованной среде Чапека с рибофлавином, глубинного культивирования грибов на питательной среде, не содержащей K2HPO4, с исходным pH 5,0-5,2 (конечным pH 3,4-3,6), в условиях аэрации с последующим отделением
биомассы и использованием фильтрата культуральной жидкости для получения препаратов глюкозооксидаз.
Продуценты глюкозооксидазы - штаммы Penicillium funiculosum: P. funiculosum 15.3,
P. funiculosum 95.132, P. funiculosum 14.1, P. funiculosum 27, P. funiculosum 28.25,
P. funiculosum 39.10, P. funiculosum 46.1, P. funiculosum 56, хранящиеся в коллекции лаборатории ферментов Института микробиологии НАН Беларуси. Для поддержания и хранения грибов используют агаризованную среду Чапека с 0,005-0,01 % рибофлавина.
Культивирование грибов ведут на питательной среде, содержащей в качестве соли калия KCl, с исходным pH 5,0-5,2. Представленная среда является оптимальной для получения глюкозоокисляющего фермента.
Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного осуществления.
Пример 1.
В качестве объектов исследования используют P. funiculosum 15.3, P. funiculosum
95.132, P. funiculosum 14.1, P. funiculosum 27, P. funiculosum 28.25, P. funiculosum 39.10,
P. funiculosum 46.1, P. funiculosum 56. Штаммы поддерживают на агаризованных средах:
Чапека или Чапека с добавлением рибофлавина. Культуры пересевают не реже 1 раза в
4 месяца на вышеуказанные среды.
Для анализа биохимической стабильности штаммы культивируют на питательной среде следующего состава ( %): сахароза - 6,0; KNO3 - 2,0; KH2PO4 - 0,1; KCl - 0,1; MgSO4 0,05; H3BO4 - 0,001; MnSO4 - 0,001; ZnSO4 - 0,0001; CoCl2 - 0,00005; Na2MoO4 - 0,00005;
CuSO4 - 0,00005; исходный pH 5,0-5,2. В качестве посевного материала используют споровые суспензии (2,5-5⋅104 спор/мл среды) грибов, выращенных на вышеуказанных агаризованных средах при 24-26 °С в течение 14 сут. Культивирование грибов ведут глубинно в
колбах Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл питательной среды на круговой качалке
(180-200 об/мин) при температуре 24-26 °С в течение 92-94 ч. По окончании культивирования биомассу грибов отделяют фильтрованием. В фильтрате культуральной жидкости
определяют количество глюкозооксидазы спектрофотометрическим методом, основанным
на энзиматическом превращении бензохинона в гидрохинон [10, 11], где за единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует образование
1 миллимоль H2O2 в течение 1 мин при 25 °С.
Установлено, что оптимальной для выращивания посевного материала и дальнейшего
поддержания и хранения штаммов P. funiculosum является среда Чапека с рибофлавином.
Уже при минимальном его внесении наблюдался положительный эффект на стабилизацию
культур. Наилучший результат получен при внесении рибофлавина в количестве 0,0050,01 %. Дальнейшее увеличение концентрации рибофлавина в среде нецелесообразно, поскольку ведет к ингибированию роста культур. Поскольку результаты, полученные при
использовании в качестве посевного материала грибов, выращенных на агаризованной
3
BY 14007 C1 2011.02.28
среде Чапека с 0,005 и 0,01 % рибофлавином, практически не отличались. В табл. 1 для
сравнительного анализа представлены данные только одного из вариантов опытов.
Таблица 1
Агаризованная среда для выращивания культур
Чапека
Чапека с 0,01 % рибофлавином
Штаммы
ГлюкозоГлюкозоP. funiculosum
Коэффициент
Коэффициент ваоксидазная активоксидазная активвариации, %
риации, %
ность, ед/мл
ность, ед/мл
15.3
6,45 ± 0,80
12,4
6,90 ± 0,38
5,5
95.132
11,20 ± 1,79
16,0
12,30 ± 0,78
6,3
14.1
9,32 ± 4,42
47,4
10,10 ± 2,22
22,0
27
11,23 ± 3,91
34,8
13,92 ± 1,50
10,8
28.25
13,60 ± 6,89
50,7
14,29 ± 1,63
11,4
39.10
11,60 ± 5,80
50,0
12,87 ± 2,40
18,6
46.1
12,13 ± 1,71
14,1
18,10 ± 0,89
4,9
56
11,30 ± 3,85
34,1
12,64 ± 2,64
20,9
Представленные в табл. 1 данные показывают, что в результате использования для получения посевного материала грибов, поддерживаемых на среде Чапека с рибофлавином,
увеличивается уровень синтеза фермента и снижается коэффициент вариации, что свидетельствует о стабилизации культур. Следует отметить, что при хранении грибов на среде с
рибофлавином культуры сохраняют свою активность в течение 3-7 лет.
Пример 2.
В качестве объектов исследования используют 3 штамма P. funiculosum 15.3, 95.132 и
46.1. Процесс ведут на среде прототипа [7]. Условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.
Количество глюкозооксидазы в фильтратах культуральных жидкостей определяют колориметрически с о-дианизидином по методу Bergmeyer [9], где за единицу глюкозооксидазы принимается то количество фермента, которое разлагает 1 микромоль D-глюкозы за
1 мин, и спектрофотометрически методом [10, 11], описанным в примере 1.
Таблица 2
Глюкозооксидазная активГлюкозооксидазная активШтаммы
ность, ед/мл, определяемая
Конечный рН
ность, ед/мл, определяемая
P. funiculosum
по методу [9] аналогично
по методу [10, 11]
прототипу
15.3
4,7
52,7
3,2
95.132
4,7
107,0
6,5
46.1
4,5
155,1
9,4
В табл. 3 условия примера соответствуют вышеописанным в данном примере за исключением того, что процесс ведут на среде прототипа без добавления в среду K2HPO4
что позволяет снизить исходный pH среды до 5,0-5,2.
Таблица 3
Глюкозооксидазная активГлюкозооксидазная активШтаммы
ность, ед/мл, определяемая
Конечный pH
ность, ед/мл, определяемая
P. funiculosum
по методу [9] аналогично
по методу [10, 11]
прототипу
15.3
3,6
79,1
4,8
95.132
3,4
156,8
9,5
46.1
3,4
216,0
13,1
4
BY 14007 C1 2011.02.28
Как видно из табл. 2 и 3, в отсутствии в среде K2HPO4 уровень синтеза фермента грибами увеличился на 40-50 %, а значения конечного pH среды уменьшаются до 3,4-3,6.
Пример 3.
Условия примера соответствуют описанным в примере 2 (табл. 3) за исключением того, что процесс ведут добавляя в среду в качестве минеральной соли KCl (источник ионов
K+ и Cl−) в различных концентрациях. В качестве объекта исследования использован
наиболее активный штамм P. funiculosum 46.1.
Таблица 4
Глюкозооксидазная активность,
Концентрация
Глюкозооксидазная активность, ед/мл,
ед/мл, определяемая по методу
KCl, %
определяемая по методу [10, 11]
[9]
0,025
232,7
14,1
0,050
295,4
17,9
0,075
297,0
18,0
0,100
298,7
18,1
0,150
219,5
13,3
0,200
199,7
12,1
Контроль (среда
без добавления
216,2
13,1
KCl)
Согласно данным, представленным в табл. 4, введение в среду KCl позволяет улучшить выход фермента на 37-38 % по сравнению с контролем и на 94-95 % по сравнению с
аналогичным показателем прототипа.
Пример 4.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
глюкозооксидазную активность определяют по методу Bergmeyer [9] аналогично прототипу.
Как видно из табл. 5, выращивание предлагаемым способом обеспечивает высокий
уровень образования фермента, а удельная активность грибов возрастает более чем в
40 раз.
Таблица 5
Глюкозооксидазная активность
Штаммы
Конечный pH
ед/мг белка (удельная акP. funiculosum
ед/мл
тивность)
15.3
3,5
122,1
445,6
95.132
3,5
203,0
520,4
14.1
3,6
166,7
496,0
27
3,4
228,8
520,1
28.25
3,4
211,7
534,6
39.10
3,6
235,5
490,6
46.1
3,6
300,1
572,7
56
3,5
208,1
533,5
КМ МГУ 433
152,0
11,0
(прототип) [7, 8]
Преимущество предлагаемого способа получения глюкозооксидазы:
1. Стабилизация свойств продуцентов за счет использования для поддержания культур
и получения посевного материала агаризованной среды Чапека с 0,005-0,01 % рибофлавином.
5
BY 14007 C1 2011.02.28
2. Образование фермента с высокой удельной активностью, что свидетельствует о
низком содержании сопутствующих белков и облегчает дальнейший процесс очистки
глюкозооксидазы.
3. Сокращение срока культивирования, что позволяет снизить энергозатраты и обеспечить рентабельность процесса.
4. Выращивание грибов в кислой среде (pH 5,0-5,2 против 6,8-6,9), что позволяет снизить возможность контаминации бактериальными инфекциями.
Источники информации:
1. Production, purification and characterization of glucose oxidase from a newly isolated
strain of Penicillium pinophilum / D. Rando, G.W. Kohring, F. Giffhorn // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1997. - Vol. 48. - P. 34-40.
2. Витковская В.А., Вакуленко В.А., Лаврищева Т.Н. и др. К уточнению режима поверхностного культивирования продуцента глюкозооксидазы. Труды УкрНИИСП, 1965. Вып. 10. - С. 164-172.
3. А.с. СССР 1074137, МПК A C12 N 9/04, 1981.
4. Закаляк Н.Р. Гiгiенiчна i токсилогiчна характеристика гриба Penicillium vitale як
промислового штаму у виробництвi мiкроциду та глюкозооксидази 2005 года : Автореф.
дис…. канд. мед. наук: 14.02.01. Львiв. нац. мед. ун-т iм. Д. Галицького. - Л., 2005. - 20 с.
5. Petruccioli M., Federici F. Glucose oxidase production by Penicillium variabile P16: effect of medium composition // J. Appl. Bacteriol. - 1993. - Vol. 75. - P. 369-372.
6. Garzillo A.M., Paolo S.Di., Fenice M., Petruccioli M., Buonocore V., Federici F. Production, purification and characterization of glucose oxidase from Penicillium variabile P16 / // Biotechnol. Appl. Biochem. - 1995. - Vol. 22. - P. 169-178.
7. Патент РФ 2170762, МПК7 C2 C 12N 1/14, 9/04, 2001 (прототип).
8. Сухачева М.В., Давыдова М.Е., Нетрусов А.И. Получение и свойства глюкозооксидазы из Penicillium funiculosum 433 // Прикладная биохимия и микробиология. - 2004. Т. 40. - № 1. - С. 32-36 (прототип).
9. Bergmeyer H.U., Gawehn K., Grassl M. Glucose oxidase: assay method // in Methods of
Enzymatic Analysis. Ed. H.U. Bergmeyer. - Academic Press Inc. - New York. - 1974. - Vol. 1. P. 457-458.
10. Ciucu A., Patroescu C. Fast spectrometric method of determining the activity of glucose
oxidase // Analyt. Lett. - 1984. - Vol. 17. - P. 1417-1427.
11. Markwell J., Frakes L.G., Brott E.C. Aspergillus niger mutants with increased glucose
oxidase production // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1989. - Vol. 30. - № 2. - P. 166-169.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
107 Кб
Теги
by14007, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа