close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14024

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.02.28
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 14024
(13) C1
(19)
C 12P 19/00
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 9-β
β-D-АРАБИНОФУРАНОЗИЛАДЕНИНА
(21) Номер заявки: a 20091203
(22) 2009.08.04
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Ерошевская Людмила Анатольевна; Квач Сергей Вячеславович; Зинченко Анатолий Иванович
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное научное учреждение "Институт
микробиологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) US 6911341 B2, 2005.
US 3616208, 1971.
JP 59-13800 A, 1984.
JP 54-89090 A, 1979.
BY 9975 C1, 2007.
JP 55-104894 A, 1980.
JP 55-29941 A, 1980.
ЕРОШЕВСКАЯ Л.А. и др. Микробиология и биотехнология XXI столетия:
Материалы международной конференции. - Минск, 2002. - С. 175-176.
BY 14024 C1 2011.02.28
(57)
Способ получения 9-β-D-арабинофуранозиладенина, включающий инкубирование при
температуре 60 °С эквимолярных количеств аденина и урациларабинозида в фосфатном
буфере с рН 7,0 в присутствии уридинфосфорилазы и пуриннуклеозидфосфорилазы
Escherichia coli и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что используют
0,2-0,3 М K-фосфатный буфер, аденин и урациларабинозид вносят в реакционную смесь в
количестве 450-550 ммоль/л каждого, концентрация уридинфосфорилазы в реакционной
смеси составляет 400 е.а./мл, а пуриннуклеозидфосфорилазы - 2000 е.а./мл.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к ферментативным способам
получения 9-β-D-арабинофуранозиладенина (синонимы: ара-А, видарабин, аденинарабинозид) - модифицированного нуклеозида, который обладает широкой активностью в отношении ДНК-содержащих вирусов, в том числе вируса герпеса, вызывающего энцефалиты,
кератиты и др. заболевания человека [1-5], и может быть использован для получения активной субстанции при производстве соответствующих лекарственных препаратов.
Химические методы синтеза ара-А характеризуются многостадийностью и низкими
выходами [6, 7].
Получение ара-А путем ферментации - культивирования микроорганизма Streptomyces
antibioticus NRRL 3238 - также малоэффективно [8].
Известен способ получения ара-А [9], заключающийся в замене урацила в молекуле
1-β-D-арабинофуранозилурацила (ара-У) на аденин при последовательном действии двух
иммобилизованных бактериальных ферментов - уридинфосфорилазы (УРФ) и пуриннуклеозидфосфорилазы (ПНФ), изолированных из Escherichia coli. Исходные ара-У и аденин
берутся в концентрациях соответственно 5 и 6 мМ. Процесс ведут при 60 °С в 5 мМ фос-
BY 14024 C1 2011.02.28
фатном буфере (рН 7,0). Выход ара-А на затраченный ара-У составляет 56 %, что приводит к расходу ара-У в количестве 1,6 г на 1 г полученного ара-А. Волуметрический выход
ара-А (выражающийся в количестве целевого продукта, получаемого с единицы объема
реакционной смеси) составляет 0,75 г/л.
Недостатки способа состоят в следующем:
1) относительно невысокий выход целевого продукта в расчете на ара-У, приводящий
к значительному расходу дорогостоящего модифицированного нуклеозида;
2) незначительный волуметрический выход ара-А, обуславливающий низкую эффективность использования единицы объема биореактора.
Известен способ получения ара-А [10], заключающийся в том, что смесь ара-У и аденина, взятых в концентрации по 75 мМ, инкубируют в фосфатном буфере с УРФ и ПНФ
Escherichia coli. Степень биоконверсии ара-У в ара-А составляет 70 %. Волуметрический
выход целевого продукта до выделения его из реакционной смеси составляет 14 г/л.
Недостатками способа являются невысокая степень конверсии ара-У в целевой продукт (70 %) и низкий (14 г/л) волуметрический выход целевого продукта.
Информация о процедуре и результатах выделения ара-А из реакционной смеси в источнике не приведена, что затрудняет выбор данного аналога в качестве прототипа.
Из известных способов получения ара-А наиболее близким к предлагаемому способу
по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения ара-А [11]
(прототип) из ара-У и аденина под действием смеси УРФ и ПНФ Escherichia coli. Исходные субстраты - ара-У и аденин - берут в эквимолярных концентрациях, составляющих
74,6 мМ. Процесс ведут при 60 °С в 30 мМ фосфатном буфере (рН 7,0). Степень биоконверсии достигает 70 %. После выделения целевого продукта из реакционной смеси кристаллизации получают ара-A с выходом 65 %.
Недостатками способа являются:
1) относительно низкий выход ара-А (65 %), что приводит к высокому расходу дорогостоящего ара-У, составляющему 1,42 г на получение 1 г целевого продукта;
2) сравнительно невысокий волуметрический выход ара-А, составляющий 12,8 г/л реакционной смеси, что обуславливает низкую эффективность использования единицы объема биореактора.
Высокий расход дорогостоящего сырья и низкий волуметрический выход целевого
продукта ограничивает возможность применения рассматриваемого способа в условиях
промышленного производства.
В основу всех известных способов ферментативного получения ара-А положена обратимая реакция трансгликозилирования, что затрудняет достижение высоких выходов целевого продукта. В некоторых известных способах [12-14] для повышения выхода ара-А в
реакционную смесь вносят избыточное (обычно 3-кратное) количество сравнительно хорошо растворимого ара-У. Это способствует сдвигу равновесия процесса в сторону прямой реакции, однако приводит к значительному расходу исходного нуклеозида, стоимость
которого в десятки раз превышает стоимость аденина.
Кроме того, известные способы характеризуются низкими волуметрическими выходами ара-А. Этот недостаток обусловлен тем, что процесс ведут при низких концентрациях исходных реагентов.
Целью предлагаемого изобретения является повышение выхода ара-А в расчете на
затраченный ара-У и повышение волуметрического выхода целевого продукта.
Указанная цель достигается тем, что смесь ара-У (донор арабинозного остатка) и аденина (акцептор) в эквимолярных количествах, составляющих 450-550 ммоль/литр каждого, инкубируется в 0,2-0,3 M K-фосфатном буфере (рН 7,0) при 60 °С с УРФ и ПНФ,
изолированных из Escherichia coli. Целевой продукт выделяют из реакционной смеси известными приемами [11].
2
BY 14024 C1 2011.02.28
Процесс ведут в фосфатном буфере в связи с тем, что фермент УРФ, действие которого необходимо для расщепления молекулы ара-У на урацил и арабинозо-1-фосфат, проявляет свою активность только в присутствии ионов неорганического фосфата.
Температура (60 °С) и величина рН (7,0) реакционной смеси совпадают с указанными
в способе-прототипе и, согласно литературным данным [9, 12-14], обеспечивают максимальную активность использующихся ферментов.
Заявляемый способ описывается следующим уравнением реакции:
NH 2
Аденин
O
N
N
NH
HO
N
N
H
O
O
OH
Ара-У
HO
O
O
P i+УРФ
O
P
O
OH
ПНФ
-P i
N
OH
O
OH
N
N
HO
-Урацил
HO
NH 2
N
N
.
OH
HO
Арабинозо-1-фосфат
Ара-А
На первой стадии процесса УРФ с участием фосфат-ионов расщепляет ара-У на урацил и арабинозо-1-фосфат. На второй стадии ПНФ из арабинозо-1-фосфата и аденина синтезирует ара-А с освобождением неорганического фосфата.
В отличие от известных способов получения ара-А из аденина и ара-У, в предлагаемом техническом решении в реакционную смесь вносятся такие большие количества исходных субстратов (в среднем по 500 нмолей/л), которые ранее не применялись.
Существенно (с 30 до 200-300 мМ) повышена также экспериментально подобранная концентрация K-фосфатного буфера.
Следует отметить, что в начале процесса в растворенном состоянии находится весь
ара-У и приблизительно одна десятая часть аденина. По мере синтеза ара-А концентрация
растворенного аденина снижается, что вызывает постепенное растворение аденина, находящегося в осадке.
Указанные отличия являются существенными, поскольку только при применении этих
параметров процесса удается достичь цели изобретения - повышения выхода ара-А в расчете на затраченный ара-У и повышения волуметрического выхода целевого продукта. По
мнению авторов, положительный эффект обусловлен следующими причинами.
Во-первых, в ходе протекания первой стадии процесса после достижения урацилом в
реакционной среде концентрации 89 мМ (концентрация насыщенного раствора) он начинает выпадать в осадок, что по закону действующих масс сдвигает равновесие реакции в
сторону более глубокого фосфоролиза ара-У, тем самым приводя к большему накоплению
в среде арабинозо-1-фосфата - субстрата для заключительной стадии синтеза ара-А. При
недостаточно высоких концентрациях исходного ара-У этот эффект наблюдаться не может.
Во-вторых, по мере протекания второй стадии процесса образующийся ара-А после
достижения им концентрации 11,2 мМ (концентрация насыщенного раствора) также
начинает выпадать в осадок, что закономерно благоприятствует синтезу большего количества этого продукта. При этом, чем большее количество ара-А будет выведено из сферы
обратимой реакции, тем, в конечном счете, более высокий выход целевого продукта будет
достигнут. Иными словами, вклад этого эффекта (выпадение ара-А в ходе процесса в осадок) в повышение выхода целевого продукта тем весомее, чем более высокие концентрации субстратов берутся в реакцию.
Высокий выход целевого продукта, при условии больших количеств взятых в реакцию
субстратов, автоматически обеспечивает достижение его высокого волуметрического выхода.
3
BY 14024 C1 2011.02.28
Следует отметить, что использование ара-У и аденина в концентрациях больших, чем
в предлагаемом способе, нерационально, так как приводит к значительным техническим
трудностям, связанным с перемешиванием реакционной смеси, содержащей большое количество выпавших в осадок ара-А и урацила.
Используемые высокие концентрации K-фосфатного буфера найдены экспериментальным путем, поскольку влияние этого параметра на эффективность процесса неоднозначно.
С одной стороны, повышение концентрации ионов фосфата благоприятствует фосфоролизу ара-У, приводящему к образованию промежуточного продукта (арабинозо-1-фосфата),
необходимого для синтеза ара-A. С другой стороны, фосфат-ионы способствуют фосфоролитическому разложению самого образующегося целевого продукта.
По мнению авторов, только сочетание указанных выше признаков способа (повышение количества вносимых в реакционную смесь аденина и ара-У с 74,6 до 450-550 ммоль/л
в сочетании с повышением концентрации K-фосфатного буфера с 30 до 200-300 мМ) приводит к решению поставленной задачи. Это сочетание признаков является новым, так как
не встречается в общедоступной патентной и научно-технической литературе, и отвечает
критерию "технический уровень", поскольку не является очевидным для специалистов.
Заявляемый способ иллюстрируют нижеприведенные примеры его конкретного осуществления.
Пример 1
Получение ара-А в оптимальных условиях проведения процесса.
Реакционную смесь (0,1 л), содержащую 6,755 г аденина (50 ммоль), 12,210 г ара-У
(50 ммоль), 0,25 M K-фосфатный буфер (рН 7,0), УРФ (40000 ед. активности) и ПНФ
(200000 ед. активности), изолированные из клеток Escherichia coli БМ-11, согласно известному методу [15], инкубировали при 60 °С с перемешиванием. За приростом количества целевого продукта в смеси следили с помощью тонкослойной хроматографии.
После прекращения прироста ара-А в реакционной смеси (продолжительность процесса 17 ч; степень конверсии ара-У в целевой продукт 96 %) ее развели в 10 раз горячей
дистиллированной водой, выдержали 30 мин на кипящей водяной бане до полного растворения ара-А и после доведения рН до 9,0 поместили на холод (бытовой холодильник) на 24 ч.
Сформировавшийся осадок собрали на стеклянном фильтре под вакуумом, промыли
50 мл охлажденной дистиллированной воды и после перекристаллизации из воды высушили в суховоздушном сушильном шкафу при температуре 60 °С в течение 5 ч. Получили
12,135 г препарата ара-А с содержанием основного вещества 98 % (44,5 ммоль), что соответствует 89 %-ному выходу в расчете на взятый в реакцию ара-У. Волуметрический выход целевого продукта составил 118,9 г/л реакционной смеси.
При хроматографировании на тонкослойных пластинках "Silufol-UV254" фирмы
"Serva" (Германия) в системе растворителей изо-пропанол:25 %-ный водный аммиак
(7:2; об/об) подвижность целевого продукта совпадала с Rf контрольного препарата ара-А.
T. пл. целевого продукта 257-260 °С.
УФ-спектр: (рН 1), λмакс нм (ε): 257 (15200); (рН 7), λмакс нм (ε): 259 (14500); (рН 13),
λмакс нм (ε): 260 (15400).
Элементный анализ для C10H13N5O4, MM 267;
найдено %: С 45,04; H 5,01; N 26,15;
вычислено: С 44,94; H 4,90; N 26,21.
ЯМР (ДМСО d6), (δ), м.д. от TMC: 8,15 (1 H, с, Н-8); 8,09 (1 H, с, Н-2); 7,18 (2 H,
с, NH2); 6,21 (1 H, д, H-1', J1'2' = 4,5 Гц); 5,57 (1 H, д, ОН-3', JOH,3' = 5,5 Гц); 5,48 (1 H,
д, ОН-2', JOH,2' = 4,0 Гц); 4,09 (2 H, м, H2', H3'); 3,72 (1 H, м, Н-4'); 3,63 (2 H, м, Н-5', Н-5'').
Пример 2
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
процесс вели в 0,20 M К-фосфатном буфере при концентрациях аденина и ара-У в исходной реакционной смеси, равных 450 мМ.
4
BY 14024 C1 2011.02.28
После выделения из реакционной смеси получили 10,1 г (37,8 ммоль) ара-А, что соответствует 84 %-ному выходу в расчете на взятый в реакцию ара-У. Волуметрический выход целевого продукта составил 101,0 г/л реакционной смеси.
Пример 3
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
процесс вели в 0,30 M К-фосфатном буфере при концентрациях аденина и ара-У в исходной реакционной смеси, равных 550 мМ.
После выделения из реакционной смеси получили 12,0 г (45,1 ммоль) ара-А, что соответствует 82 %-ному выходу в расчете на взятый в реакцию ара-У. Волуметрический выход целевого продукта составил 120,5 г/л реакционной смеси.
Пример 4
Получение ара-А при использовании УРФ и ПНФ, продуцируемых другими штаммами Escherichia coli.
Условия примера соответствуют описанным в примере 1 за исключением того, что
объем реакционной смеси составлял 10 мл и в качестве биокатализаторов использовали
УРФ и ПНФ, изолированные из клеток различных штаммов Escherichia coli. Достигнутые
выходы реакции синтеза ара-А (без выделения целевого продукта) представлены в таблице.
Сравнительная оценка эффективности использования УРФ и ПНФ различных
штаммов Escherichia coli для получения ара-А
Штамм бактерий
E. соli ЦМПМ В-2035
E. coli ЦМПМ В-2039
E. coli БИМ В-452Д
E. coli БИМ В-200Д
E. coli БИМ В-389Д
E. coli БИМ В -238
E. coli БИМ В-379
E. coli БМ- 11
E. соli БМТ-1Д/1А
E. coli БИМ В-378
Выход реакции синтеза
ара-А, %
95,5
96,0
96,2
96,3
95,9
95,0
94,3
96,0
96,1
93,5
Относительная
эффективность, %
99,5
100
100,2
100,3
99,9
99,0
98,2
100
100,1
97,4
Из данных таблицы следует, что в предлагаемом техническом решении могут быть
использованы УРФ и ПНФ, изолированные из различных штаммов бактерии Escherichia
coli.
Представленные материалы свидетельствуют о том, что использование предлагаемого
способа получения ара-А обеспечивает по сравнению с известным способом-прототипом
следующие преимущества:
увеличение выхода целевого продукта в расчете на исходный модифицированный
нуклеозид (ара-У) с 65 до 82-89 %;
повышение волуметрического выхода целевого продукта с 12,8 до 101,2-120,5 г/л реакционной смеси.
Таким образом, расходы ара-У на получение 1 г целевого продукта снижаются с 1,42
до 1,03-1,11 г и существенно повышается эффективность использования единицы объема
биореактора. Предлагаемый метод высокотехнологичен и может быть успешно применен
в условиях производства.
5
BY 14024 C1 2011.02.28
Источники информации:
1. Cass С.E. 9-β-D-arabinofuranosyladenine (AraA)//Antibiotics, V 2. Mechanism of Action
of Antieukaryotic and Antiviral Compounds (ed. F.E. Hahn). Berlin etc. Springer-Verlag. - 1979. P. 85-108.
2. Whitley R.J., Soong S-J., Hirsch M.S., Karehmer A.W., Dolin R., Galasso G., Dunnick J.K.,
Alford C.A. The NIAID Collaborative Antiviral Study Group: Herpes simplex encephalitis.
Vidarabine therapy and diagnostic problems // N. Eng. J. Med. - 1981. - VoI. 304. - P. 313-318.
3. Новые подходы к химиотерапии герпесвирусных инфекций / Н.П.Чижов, Г.И.Головина, Т.И.Юрлова, Т.С.Брязжикова//Антибиотики и химиотерапия. - 1993. - T. 38. № 10-11. - C. 75-82.
4. Suzuki M., Okuda Т., Shiraki K, Synergistic antiviral activity of acyclovir and vidarabine
against herpes simplex virus types 1 and 2 and varicella-zoster virus // Antiviral Res. - 2006. Vol. 72, № 2. - P. 157-161.
5. Shen W., Kim J.S., Mitchell S., Kish P., Kijek P., Hilfinger J. 5'-O-D-valyl ara A, a potential prodrug for improving oral bioavailability of the antiviral agent vidarabine // Nucleosides,
Nucleotides, Nucleic Acids. - 2009. - Vol. 28, № 1. - P. 43-55.
6. Ranganathan R. A novel purine nucleoside synthesis: 9-β-D-arabinofuranosyladenine //
Tetrahedron Lett. - 1975. -Vol. 16, № 13. - P. 1185-1188.
7. Chattopadhyaya J.B., Reese C.B. A synthesis of purine arabinosides // Nucleic Acids Res. 1978. - Vol. 1. - P. - s67-s72.
8. Patent 1159290 GB. Fermentation process for 9-(beta-D-arabinofuranosyl)adenine:
pat./Parke Davis & Co., заявл. 29.12.1967; опубл. 23.07.1969.
9. Константинова И.Д., Леонтьева H.А., Галегов Г.А., Рыжова О.И., Чувиковский Д.В.,
Антонов К.В., Есипов P.С., Таран С.А., Веревкина К.Н., Феофанов С.А., Мирошников А.И.
Биотехнологический способ получения рибавирина. Действие рибавирина и некоторых
его комбинаций на репродукцию вируса осповакцины (Vaccinia Virus) // Биоорганическая
химия. - 2004. - T. 30, № 6. - С. 613-620.
10. Spoldi E., Ghisotti D., CaIi S., Grisa M., Orsini G., Tonon G., Zuffi G. Recombinant
bacterial cells as efficient biocatalysts for the production of nucleosides // Nucleosides, Nucleotides, Nucleic Acids. - 2001. - Vol. 20, № (4-7). - P. 977-979.
11. Patent 6911341 US. Recombinant bacterial strains for the production of natural nucleosides and modified analogues thereof/G. Bestetti, S. Cali, D. Ghisotti. G. Orsini, G. Tonon,
G. Zuffi, заявл. 25.06.2002; опубл. 28.06.2005 (прототип).
12. Ерошевская Л.А., Барай В.Н., Зинченко А.И., Квасюк E.И., Михайлопуло И.А.
Препаративный синтез противовирусного нуклеозида 9-β-D-аденинарабинозида с помощью
бактериальных клеток // Антибиотики мед. биотехнол. - 1986. - T. 31, № 3. - С. 174-178.
13. Rogert М.С., Trelles J.A., Porro S., Lewkowicz E.S., Iribarren A.M. Microbial synthesis
of antiviral nucleosides using Escherichia coli BL21 as biocatalyst // Biocatal. Biotransform. 2002. - Vol. 20, № 5. - P. 347-351.
14. Wei X.K., Ding Q.B., Zhang L., Guo Y.L., Ou L., Wang C.L. Induction of nucleoside
phosphorylase in Enterobacter aerogenes and enzymatic synthesis of adenine arabinoside //
J. Zhejiang Univ. Sci. B. - 2008. - Vol. 9, № 7. - P. 520-526.
15. Бокуць С.Б., Барай У.M., Дудчык Н.У., Зiнчанка A.I. Метад комплекснага
выдзялення i ачысткi нуклеазiдфасфарылаз Escherichia coli // Весцi АН Беларусi, сер. бiял.
навук. - 1994. - № 4. - С. 45-50.
ациональный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
113 Кб
Теги
патент, by14024
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа