close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14098

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.02.28
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 14098
(13) C1
(19)
G 01N 21/17
C 12N 1/12
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ФИКОЦИАНИНА
В НАТИВНОЙ КУЛЬТУРЕ СПИРУЛИНЫ
(21) Номер заявки: a 20090816
(22) 2009.06.03
(43) 2011.02.28
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт биофизики и
клеточной инженерии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Мельников Станислав Сергеевич; Мананкина Елена Евгеньевна; Самович Татьяна Викторовна;
Будакова Елена Анатольевна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси"
(BY)
(56) WO 2005/123940 A2.
RU 2055842 C1, 1996.
RU 2321271 C1, 2008.
WO 2006/097627 A1.
BY 14098 C1 2011.02.28
(57)
Способ определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины, заключающийся в том, что отбирают пробу нативной культуры спирулины, определяют ее
оптическую плотность спектрофотометрически при длине волны 620 нм в диапазоне 1,03,0 и определяют содержание фикоцианина N (мг/л) при коэффициенте корреляции R,
равном 0,93, по формуле:
N = 77,8 x OD620 - 37,0,
где OD620 - оптическая плотность культуры при длине волны 620 нм.
Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к культивированию хозяйственно-полезных видов микроорганизмов, а именно к способам определения количества отдельных ценных веществ биомассы, а конкретно фикоцианина спирулины.
Сине-зеленая водоросль спирулина Spirulina (Arthrospira) platensis (Nordst.) Geitl. уже
более 35 лет является объектом промышленной биотехнологии для получения биомассы,
используемой для лечения и профилактики болезней, в качестве витаминно-кормовой добавки к рационам кормления сельскохозяйственных животных, для промышленного получения из нее различных ценных веществ - β-каротина, фикоцианина, полиненасыщенных жирных кислот.
Мировое производство сухой биомассы спирулины достигло в 2004 году 8000 т, а
объем продаж составил 158 млн. долларов США. Количество крупных ферм, занимающихся выращиванием спирулины, превысило 300 и продолжает быстро увеличиваться.
Спирулину выращивают во всех сопредельных Беларуси странах.
Биомасса водорослей содержит 70 % высококачественного белка, более 14 витаминов,
много полиненасыщенных жирных кислот и других ценных соединений. Одним из них
является фикоцианин - синий пигмент фикобилиновой природы, принимающий активное
BY 14098 C1 2011.02.28
участие в процессе фотосинтеза. Это сложноорганизованный глобулярный белок с молекулярной массой 264 кДа. По антиоксидантной активности превосходит аскорбиновую
кислоту в 20 раз, а тролокс в 16 раз. Установлено, что его антиоксидантные свойства выше, чем у α-токоферола, зеаксантина и кофейной кислоты. Фикоцианин стимулирует иммунную систему, перспективен при лечении болезней печени, канцерогенных заболеваний
и СПИДа, имеет высокую радиопротекторную активность (выводит из организма 137Cs и
90
Sr), используется при фотодинамической терапии опухолей у людей. Это свидетельствует, что фикоцианин является наиболее ценным веществом биомассы спирулины и при ее
выращивании с целью получения этого соединения, особенно с использованием стимуляторов биосинтеза фикоцианина, возникает необходимость постоянного контроля содержания фикоцианина в биомассе.
Известен способ получения белкового препарата из сухой биомассы спирулины [1].
Способ включает водную экстракцию, фракционную преципитацию сернокислым аммонием концентрацией от 20 до 70 % от насыщения, по завершении каждой стадии проводят
центрифугирование с отделением белкового осадка, обработку которого далее осуществляют на диэтиламиноэтиловом активированном носителе методом ионообменной хроматографии с последующими обработкой на мембранной установке до содержания солей
5 % и сушкой готового продукта до влажности не более 3 %. Хроматография на ДЭАЭ сефацеле и хроматография на суперозе-12 приводят к потере большей части пигмента.
Данный способ позволяет получить высокоочищенный препарат фикоцианина. Недостатками данного способа являются многостадийность, большой расход реактивов и времени
на выделение фикоцианина, большие потери его во время выделения (более 80 %).
Все остальные известные способы определения фикоцианина связаны с экстракцией
пигмента натрий-фосфатным буфером (pH 7,0) с трилоном Б после предварительного
осаждения и разрушения клеток, спектрофотометрированием и расчетом количества
фикоцианина по формуле: N = (OD615 - 0,474 x OD652)/5,34, где OD - оптическая плотность
суспензии клеток при данной длине волны [2]. Все эти способы не могут быть применены
при массовых анализах содержания фикоцианина в биомассе спирулины. Так, например,
исследование влияния всего лишь 3 различных веществ при 4 концентрациях каждого из
них на накопление фикоцианина клетками спирулины приведет при 3-кратной биологической повторности к необходимости определить содержание фикоцианина, учитывая контроль, в 39 пробах. Легко представить, насколько это трудоемкая задача и как велик будет
расход реактивов и электроэнергии (центрифугирование) при использовании существующих способов определения фикоцианина.
Информации, касающейся определения содержания фикоцианина в нативной культуре
спирулины, не найдено.
Задачей изобретения является создание дешевого и простого способа определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины (без разрушения клеток), что позволит расширить арсенал способов определения.
Задача решается следующим образом.
Способ определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины заключается в следующем. Сначала отбирают пробу нативной культуры спирулины и определяют ее оптическую плотность спектрофотометрически при длине волны 620 нм в
диапазоне 1,0-3,0. А затем определяют содержание фикоцианина N (мг/л) при коэффициенте корреляции R, равном 0,93, по формуле:
N = 77,8 x OD620 - 37,0,
где OD620 - оптическая плотность культуры при длине волны 620 нм.
Способ определения содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины осуществляется следующим образом: пробу нативной культуры спирулины помещают в кювету для спектрофотометрирования и на спектрофотометре или колориметре-нефелометре
определяют оптическую плотность при длине волны 620 нм, длине оптического пути 1 см
2
BY 14098 C1 2011.02.28
в максимуме поглощения фикоцианина и в диапазоне оптической плотности в пределах
1,0-3,0, затем содержание фикоцианина (N, мг/л) при коэффициенте корреляции R = 0,93
определяют по формуле:
N = 77,8 x OD620 - 37,0,
где 77,8 и 37,0 - коэффициенты, полученные расчетным путем, мг/л;
OD620 - оптическая плотность культуры при длине волны 620 нм.
При разработке данного способа использовали особенности пигментного состава, а
следовательно, и спектра поглощения нативной культуры водоросли. На фиг. 1 представлен спектр поглощения нативной культуры водоросли. Спирулина содержит хлорофилл α
(максимумы в спектре поглощения 438 и 678 нм), каротиноиды ("плечо" в области 490 нм)
и фикоцианин, имеющий хорошо разрешенный максимум в области 620 нм. Поглощение,
обусловленное иными пигментами в этой области спектра, отсутствует, и величина максимума при 620 нм пропорциональна количеству фикоцианина, находящегося в клетках
спирулины.
Штамм Spirulina (Arthrospira) platensis (Nordst.) Geitl. PPMSU-59 был получен из коллекции сине-зеленых водорослей МГУ. Водоросль выращивали в конических колбах на
250 мл (объем суспензии 150 мл) на модифицированной среде для выращивания спирулины (патент BY 9416 C1 2007.06.30) следующего состава (г/л): твердые шламоотходы ПО
"Беларуськалий" - 10; пищевая сода (NaHCO3) - 12; натриевая селитра (NaNO3) - 2,5; аммофос (NH4H2PO4) - 0,3; ацетат натрия (CH3COONa) - 0,3; цитрат железа (FeC6H5O7⋅H2O) 11,7 мг/л; раствор микроэлементов по Упитису - 1 мл. Культуру освещали светом люминесцентных ламп SL 40/32-765 интенсивностью 26 Вт/м2 с режимом 14 ч света - 10 ч темноты в течение суток, температура 26 °С. Засев культуры проводили таким образом,
чтобы начальная оптическая плотность суспензии при 750 нм была 0,22, что эквивалентно
содержанию 211 г абсолютно сухого вещества (АСВ) в 1 л культуры. Количество сухого
вещества в суспензии (г/л) рассчитывали по формуле [3]: N = (OD750 + 0,08)/1,42, где
OD750 - оптическая плотность суспензии, измеренная на спектрофотометре марки
SP830plus. При меньших количествах посевной биомассы культура дольше адаптируется
к новой среде и медленнее развивается. На 10-й день культивирования, определив оптическую плотность суспензии спирулины при 750 и 620 нм, клетки осаждали центрифугированием, промывали дистиллированной водой и растирали в ступке (без песка) в K-Naфосфатном буфере (50 мМ, pH 7,0). Полученную суспензию оставляли в холодильнике на
три часа, затем центрифугировали 3 мин при 13000 об/мин (Biofuge pico). Полученный
экстракт спектрофотометрировали на спектрофотометре (UVIKON 931) при 615 и 652 нм
и рассчитывали содержание фикоцианина по формуле [2]: N = (OD615 - 0,474 x OD652)/5,34.
На основании измерений величин оптической плотности (OD620) спектров поглощения
75 различных нативных культур спирулины разного возраста (от 10 до 14 суток) и одновременного определения соответствующих этим величинам количеств фикоцианина, с
помощью математической (статистической) обработки зоны измерений оптических плотностей культуры спирулины от 1,0 до 3,0 и количества фикоцианина в биомассе этой
культуры, получили уравнение аппроксимационной прямой вида:
N = 77,8 x OD620 - 37,0,
при значении коэффициента корреляции R = 0,93,
где N - содержание фикоцианина в мг в 1 л культуры спирулины,
77,8 и 37,0 - коэффициенты, полученные расчетным путем,
OD620 - оптическая плотность культуры при длине волны 620 нм.
На фиг. 2 представлена аппроксимационная прямая зависимости содержания фикоцианина в нативной культуре спирулины от OD620 (в интервале значений 1,0-3,0).
Пример
Берут 1-3 мл суспензии спирулины, помещают в кювету для спектрофотометрирования и на спектрофотометре (колориметре-нефелометре) определяют оптическую плот3
BY 14098 C1 2011.02.28
ность при длине волны 620 нм в максимуме поглощения фикоцианина. Используя
формулу:
N = 77,8 x OD620 - 37,0,
определяем содержание фикоцианина в нативной культуре (мг/л).
Например: при значении OD620 = 1,5 получим значение N = (77,8 x 1,5 - 37,0) = 79,7 (мг/л). Умножив полученную величину на объем суспензии в литрах, получим значение количества фикоцианина в имеющемся объеме суспензии спирулины.
Таким образом, предлагаемый способ определения содержания фикоцианина в культуре спирулины позволяет проводить массовые анализы содержания фикоцианина в клетках нативной культуры спирулины, значительно сократить время проведения анализа и
расходы на реактивы.
Источники информации:
1. Патент РФ 2320195, МПК A 23J 3/20, опубл. 27.03.2008.
2. Lamela Т., Marquez-Rocha F.J. Phycocyanin production in seawater culture of Arthrospira maxima // Ciencias marinas. - 2000. - Vol. 26, N 4. - P. 607-619.
3. Налимова А.А., Попова В.В., Цоглин Л.Н., Пронина Н.А. Влияние меди и цинка на
рост Spirulina platensis и аккумуляция клетками тяжелых металлов // Физиология растений. - 2005. - Т. 52. - С. 259-265.
Фиг. 1
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
87 Кб
Теги
by14098, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа