close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14154

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.04.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 5/06
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
АУТОЛОГИЧНЫХ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
ДЛЯ ПАТОГЕНЕТИЧЕСКОГО ЛЕЧЕНИЯ РАССЕЯННОГО
СКЛЕРОЗА
(21) Номер заявки: a 20090324
(22) 2009.03.09
(43) 2010.10.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение образования "Белорусская медицинская академия последипломного
образования" (BY)
(72) Авторы: Хулуп Геннадий Яковлевич;
Зафранская Марина Михайловна;
Федулов Александр Сергеевич; Нижегородова Дарья Борисовна (BY)
BY 14154 C1 2011.04.30
BY (11) 14154
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение образования "Белорусская
медицинская академия последипломного образования" (BY)
(56) ПЫКО И.В. и др. Медицинский журнал. - 2007. - № 4. - С. 18-22.
КОСМАЧЕВА С.М. и др. Медицинские новости. - 2008. - № 9. - С. 5-9.
(57)
Способ определения возможности использования аутологичных мезенхимальных
стволовых клеток для патогенетического лечения рассеянного склероза, заключающийся в
том, что выделяют мононуклеары костного мозга больного, получают из них путем культивирования мезенхимальные стволовые клетки 1-го пассажа, выделяют мононуклеары
периферической крови того же больного, окрашивают их карбоксифлуоресцеином, в течение 10 дней культивируют в питательной среде, содержащей миелин-специфический
протеин, с добавлением и без добавления мезенхимальных стволовых клеток 1-го пассажа, затем путем окрашивания моноклональными антителами к специфическим маркерам
эффекторных Т-клеток памяти регистрируют в культурах пролиферацию эффекторных
Т-клеток памяти в процентах и определяют коэффициент супрессии k пролиферации указанных клеток в процентах по формуле:
П эффТ + МСК × 100
k = 100 −
,
П эффТ
где ПэффТ + МСК - пролиферация эффекторных Т-клеток памяти при совместном культивировании мононуклеаров периферической крови с добавлением мезенхимальных стволовых клеток;
ПэффТ - пролиферация эффекторных Т-клеток памяти в культуре мононуклеаров периферической крови без добавления мезенхимальных стволовых клеток,
при этом при получении значения k более 50 % делают вывод о возможности использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для патогенетического лечения рассеянного склероза.
BY 14154 C1 2011.04.30
Изобретение относится к медицине, к разделам аутоиммунной патологии, трансплантологии, клеточной биологии, нейроиммунологии и неврологии.
Проблема лечения рассеянного склероза заключается в отсутствии эффективных протоколов, направленных на селективное подавление активности миелин-реактивных Т-лимфоцитов. Развитие перспективного направления патогенетической терапии аутоиммунных
воспалительных демиелинизирующих заболеваний основывается на использовании иммуносупрессирующих и нейропротективных свойств мезенхимальных стволовых клеток,
технология получения и культивирования которых является дорогостоящей процедурой. С
другой стороны, эффективность использования клеточных культур in vivo можно предсказать, оценив степень иммуносупрессорного действия мезенхимальных стволовых клеток
на миелин-специфический ответ лимфоцитов in vitro. Аналогов не обнаружено.
Задачей заявляемого способа является определение in vitro возможности аутологичных мезенхимальных стволовых клеток супрессировать миелин-специфический ответ эффекторных Т-клеток памяти с целью дальнейшего дифференцированного использования
клеточных культур мезенхимальных стволовых клеток для эффективного патогенетического лечения рецидивно-ремиттирующей формы рассеянного склероза.
Поставленная задача решается следующим способом. Предложен способ определения
возможности использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для патогенетического лечения рассеянного склероза, заключающийся в том, что выделяют мононуклеары костного мозга больного, получают из них путем культивирования мезенхимальные стволовые клетки 1-го пассажа, выделяют мононуклеары периферической крови
того же больного, окрашивают их карбоксифлуоресцеином, в течение 10 дней культивируют в питательной среде, содержащей миелин-специфический протеин, с добавлением и
без добавления мезенхимальных стволовых клеток 1-го пассажа, затем путем окрашивания
моноклональными антителами к специфическим маркерам эффекторных Т-клеток памяти
регистрируют в культурах пролиферацию эффекторных Т-клеток памяти в процентах и
определяют коэффициент супрессии k пролиферации указанных клеток в процентах по
формуле:
П эффТ + МСК × 100
k = 100 −
,
П эффТ
где ПэффТ + МСК - пролиферация эффекторных Т-клеток памяти при совместном культивировании мононуклеаров периферической крови с добавлением мезенхимальных стволовых клеток;
ПэффТ - пролиферация эффекторных Т-клеток памяти в культуре мононуклеаров периферической крови без добавления мезенхимальных стволовых клеток,
при этом при получении значения k более 50 % делают вывод о возможности использования аутологичных мезенхимальных стволовых клеток для патогенетического лечения рассеянного склероза.
Пример 1.
Больной А., 39 лет, поступил в отделение неврологии с диагнозом: рассеянный склероз,
рецидивно-ремиттирующее течение. У больного был осуществлен забор периферической
венозной крови и пунктата костного мозга из грудины. Из полученного биологического
материала методом центрифугирования на градиенте плотности в течение 30 мин и последующим отмыванием физиологическим раствором были выделены мононуклеарные клетки. Мононуклеары периферической крови (МПК) были временно заморожены в жидком
азоте. Мононуклеары костного мозга (МКМ) были использованы для получения 1-го пассажа мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (МСК КМ).
После достижения конфлюэнтности (80-100 % покрытие поверхности клетками) культура МСК КМ была снята с пластика методом трипсинизации, отмыта физиологическим
раствором и ресуспензирована в концентрации 2×106 клеток/мл. Параллельно были разморожены МПК, отмыты физиологическим раствором, ресуспензированы в концентрации
2
BY 14154 C1 2011.04.30
1×107 клеток/мл и окрашены внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином в
концентрации 7 µМ в 1 мл культуральной среды RPMI-1640 в течение 5 мин в темноте
при комнатной температуре. Внутриклеточное окрашивание останавливалось путем отмывания МПК полной культуральной средой (RPMI-1640 с 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина, 25 мкг/мл гентамицина, 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки).
После этого МПК засевались в 96-луночный культуральный планшет в концентрации
2×105 клеток/лунку и культивировались в присутствии МСК КМ, которые добавляли в соотношении 10:1, в течение 10 дней в питательной среде, содержащей 10 мкг/мл миелинспецифического протеина, в увлажненной атмосфере с 5 % CO2 при 37 °С с заменой на
6-й день супернатанта полной культуральной средой, содержащей 10 U/мл интерлейкина-2,
причем одновременно культивировались МПК без добавления МСК КМ в той же среде.
Регистрация миелин-специфической пролиферации эффекторных Т-клеток памяти с
фенотипом CD3+CCR7-CD45RO+ осуществлялась на 10-й день культивирования методом
проточной цитометрии. Для этого клеточные суспензии окрашивались моноклональными
антителами, меченными флуоресцентной меткой, к CD3, CCR7 и CD45RO маркерам
Т-клеток в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией пролиферации клеток.
Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Пролиферация CD3+CCR7-CD45RO+ эффекторных Т-клеток памяти
в ответ на миелин-специфический протеин у больного А.
Больной А.
Пролиферация
CD3+CCR7-CD45RO+
Т-клеток
в суспензии МПК, %
62,52
Пролиферация
CD3+CCR7-CD45RO+
Т-клеток в суспензии МПК
с добавлением МСК КМ (10:1), %
29,92
Согласно полученным данным был подсчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответа k (%) по формуле:
П эффТ + МСК × 100
29,92 × 100
= 52,14 % .
k = 100 −
= 100 −
П эффТ
62,52
Таким образом, коэффициент супрессии пролиферативного ответа k составил более
50 %, что свидетельствует о наличии возможного терапевтического эффекта МСК КМ при
использовании клеточных культур в патогенетическом лечении рассеянного склероза. В
связи с этим больному А. рекомендовано проведение аутологичной трансплантации МСК КМ
для иммунологической супрессии миелин-специфического ответа эффекторных Т-клеток
памяти.
Пример 2
Больной В., 32 года, поступил в отделение неврологии с диагнозом: рассеянный склероз,
рецидивно-ремиттирующее течение. У больного был осуществлен забор периферической
венозной крови и пунктата костного мозга из грудины. Из полученного биологического
материала методом центрифугирования на градиенте плотности в течение 30 мин и последующим отмыванием физиологическим раствором были выделены мононуклеарные клетки.
МПК были временно заморожены в жидком азоте. МКМ были использованы для получения 1-го пассажа МСК КМ.
После достижения конфлюэнтности (80-100 % покрытие поверхности клетками) культура МСК КМ была снята с пластика методом трипсинизации, отмыта физиологическим
раствором и ресуспензирована в концентрации 2×106 клеток/мл. Параллельно были разморожены МПК, отмыты физиологическим раствором, ресуспензированы в концентрации
1×107 клеток/мл и окрашены внутриклеточным красителем карбоксифлуоресцеином в
концентрации 7 µМ в 1 мл культуральной среды RPMI-1640 в течение 5 мин в темноте при
3
BY 14154 C1 2011.04.30
комнатной температуре. Внутриклеточное окрашивание останавливалось путем отмывания
МПК полной культуральной средой (RPMI-1640 с 25 мМ HEPES, 2 мМ L-глютамина,
25 мкг/мл гентамицина, 10 % инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки). После
этого МПК засевались в 96-луночный культуральный планшет в концентрации 2×105 клеток/лунку и культивировались в присутствии МСК КМ, которые добавляли в соотношении 10:1, в течение 10 дней в питательной среде, содержащей 10 мкг/мл миелин-специфического протеина, в увлажненной атмосфере с 5 % CO2 при 37 °С с заменой на 6-й день
супернатанта полной культуральной средой, содержащей 10 U/мл интерлейкина-2, причем
одновременно культивировались МПК без добавления МСК КМ в той же среде.
Регистрация миелин-специфической пролиферации эффекторных Т-клеток памяти с
фенотипом CD3+CCR7-CD45RO+ осуществлялась на 10-й день культивирования методом
проточной цитометрии. Для этого клеточные суспензии окрашивались моноклональными
антителами, меченными флуоресцентной меткой, к CD3, CCR7 и CD45RO маркерам
Т-клеток в течение 15 мин в темноте с последующей регистрацией пролиферации клеток.
Результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
+
+
Пролиферация CD3 CCR7"CD45RO эффекторных Т-клеток памяти
в ответ на миелин-специфический протеин у больного В.
Пролиферация
CD3 CCR7-CD45RO+ Т-клеток
в суспензии МПК, %
56,97
+
Больной В.
Пролиферация CD3+CCR7-CD45RO+
Т-клеток в суспензии МПК
с добавлением МСК КМ (10:1), %
38,22
Согласно полученным данным был подсчитан коэффициент супрессии пролиферативного ответа k (%) по формуле:
П эффТ + МСК × 100
38,22 × 100
= 32,91 % .
k = 100 −
= 100 −
П эффТ
56,97
Таким образом, коэффициент супрессии пролиферативного ответа k составил менее
50 %, что свидетельствует об отсутствии терапевтического эффекта МСК КМ при использовании клеточных культур в патогенетическом лечении рассеянного склероза. В связи с
этим больному В. не рекомендовано проведение аутологичной трансплантации МСК КМ
для иммунологической супрессии миелин-специфического ответа эффекторных Т-клеток
памяти.
Вывод.
При определении коэффициента супрессии пролиферативного ответа k более 50 % аутологичные МСК КМ могут быть использованы для патогенетического лечения больного
рассеянным склерозом.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
94 Кб
Теги
патент, by14154
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа