close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14385

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.06.30
(12)
(51) МПК (2009)
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07K 14/435
A 61K 39/385
G 01N 33/53
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИГЕНА ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ
ГИПОДЕРМАТОЗА И СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ
ГИПОДЕРМАТОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА
(21) Номер заявки: a 20080300
(22) 2008.03.14
(43) 2009.10.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени
С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Якубовский Мирослав Викторович; Степанова Елена Анатольевна; Трус Иван Анатольевич; Мясцова Татьяна Яковлевна (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии имени С.Н.Вышелесского"
(BY)
BY 14385 C1 2011.06.30
BY (11) 14385
(13) C1
(19)
(56) МАВРИН Н.А. и др. // Ветеринария. 2007. - № 9. - С. 11-14.
СТЕПАНОВА Е.А. Ученые записки
учреждения образования "Витебская
государственная академия ветеринарной медицины". Т. 40, Ч. 1. - Витебск,
2004. - С. 310-311.
СТЕПАНОВА Е.А. Международная научно-практическая конференция "Современные вопросы патологии сельскохозяйственных животных". - Минск,
2003. - С. 272-273.
СТЕПАНОВА Е.А. и др. Ветеринарная
наука - производству. Научные труды.
Вып. 36. - Минск, 2002. - С. 206-209.
СТЕПАНОВА Е.А. и др. // Известия
Национальной академии наук Беларуси. Серия аграрных наук. - 2004. - № 3. С. 94-96.
(57)
1. Способ получения соматического антигена Hypoderma bovis для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота, отличающийся тем, что гомогенизируют личинки
Hypoderma bovis II и III стадий, гомогенат центрифугируют при 5000 g в течение 20 минут, полученную надосадочную жидкость обрабатывают ультразвуком 35 кГц 5 раз по
1 минуте, очищают путем фракционирования сульфатом аммония, добавляя его до конечной концентрации 45-55 %, после чего полученный антиген разводят физиологическим
раствором до концентрации 1,2 мг белка в 1 мл.
2. Способ диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью твердофазного иммуноферментного анализа, отличающийся тем, что анализ проводят с соматическим антигеном, полученным способом по п. 1, причем антиген разводят 0,15 М
карбонатно-бикарбонатным буфером pH 9,8, фиксируют в лунках иммунологического
планшета в течение 8-12 часов при 4 °С, отмывают 0,1 M фосфатным буфером pH 7,4, содержащим 0,01 % Твин-20, причем используют буфер, приготовленный на дистиллированной воде, после чего вносят в отдельные лунки образец сыворотки крови или молока
здорового животного в качестве контроля и образец сыворотки крови или молока обследуемого животного в качестве опыта, инкубируют образцы 1 час при 37 °С, вносят в лун-
BY 14385 C1 2011.06.30
ки пероксидазный конъюгат, содержащий антитела к IgG быка и инкубируют 1 час при
37 °С, затем вносят хромогенный субстрат и инкубируют 8-10 минут, реакцию останавливают добавлением 3 M серной кислоты и определяют оптические плотности контрольного
и опытного образцов при 450 нм, при этом вывод о наличии гиподерматоза у обследуемого животного делают в случае, если оптическая плотность опытного образца превышает
оптическую плотность контрольного в 1,5 раза или более.
Изобретение относится к области ветеринарной паразитологии, в частности к ранней
иммунологической диагностике гиподерматоза крупного рогатого скота.
Гиподерматоз является повсеместно распространенной инвазией. На территории Республики Беларусь инвазированность животных личинками подкожного овода в среднем в
1997-1998 гг. регистрировалась на уровне 17,70 %, а в отдельных хозяйствах - до 65,0085,00 %. В последние годы (2001-2007) она составляет 0,9-4,9 % [1].
Болезнь протекает хронически и характеризуется воспалительными явлениями в местах обитания личинок оводов, общей интоксикацией организма и снижением молочной и
мясной продуктивности животных.
На крупном рогатом скоте паразитируют два вида подкожного овода: Hypoderma
bovis - строка, или обыкновенный подкожник, и Hypoderma lineatum - пищеводник, или
южный подкожник [2].
Ранее на территории республики регистрировались оба вида, однако пищеводник
встречался достаточно редко [3].
При проведении нами исследований в 2001-2006 гг. на территории республики обнаружен только один вид подкожного овода - Hypoderma bovis - строка [4].
При сопоставлении полученных данных с исследованиями, которые проводились в
республике в 1950-х гг., установлено исчезновение на территории Беларуси вида Hypoderma lineatum. Проанализировав литературные данные, мы пришли к заключению, что
это явление можно объяснить влиянием на подкожных оводов препаратов группы хлор- и
фосфорорганических соединений, которые активно использовались для лечения и профилактики гиподерматоза на территории республики в 1960-1980-х гг., а также большей чувствительностью Hypoderma lineatum, по сравнению с Hypoderma bovis, к действию
противооводовых обработок, с изменением соотношения видов подкожных оводов (преобладанием личинок строки) и с постепенным смещением границ распространения оводов
с севера на юг.
Хотя обычно естественными хозяевами подкожного овода являются крупный рогатый
скот и олени, гиподерматоз был зарегистрирован у лошадей, овец, коз и других животных.
Имаго подкожного овода может нападать и на человека, вызывая у него патологические
процессы.
Особенностью протекания гиподерматоза является то, что на первых этапах заражения трудно диагностировать болезнь, так как личинки подкожного овода находятся в организме животного в течение 7-9 месяцев (после откладывания оводом яиц на шерсть
животного), и они могут быть выявлены визуальным осмотром только в последние 1-2
месяца своего цикла развития. На протяжении всего этого продолжительного периода, когда животные уже инвазированы личинками подкожного овода, но им еще не поставлен
диагноз (в связи с отсутствием клинических признаков), ежегодные потери молока составляют 90-200 кг от каждой больной гиподерматозом коровы, мяса - от 13 до 18 кг. В
связи с тем, что невозможно выявить больных животных на ранних стадиях заболевания,
приходится применять лечебно-профилактические обработки ко всем животным, что увеличивает себестоимость сельскохозяйственной продукции.
Для выявления животных на начальных стадиях развития личинок подкожного овода
предложены ряд серологических способов с помощью антигена, содержащего белок личинок.
2
BY 14385 C1 2011.06.30
Известен антиген, содержащий белок личинок подкожного овода, применяемый для
диагностики гиподерматоза в иммуноферментном анализе (ИФА) [5].
Но недостатком данного антигена является то, что для его получения используются
личинки Hypoderma lineatum, которые не обитают на территории Республики Беларусь.
Также при получении этого антигена не используется хитин личинок, который содержит
большое количество специфичных водорастворимых белков, а отделение которого также
усложняет процесс его получения. При очистке антигена используются аффинная и ионообменная хроматографии, которые являются технологически трудоемкими и дорогостоящими процессами, требующими высокоточного оборудования.
Ближайшим аналогом, т.е. прототипом, можно считать аллерген, обладающий антигенными свойствами, полученный из личинок Hypoderma bovis для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота, содержащий белок в виде личинок подкожного овода 23 стадии развития, фенол, дистиллированную воду (растворитель) [6].
Недостатком данного антигена является его низкая степень очистки в процессе его
получения, при которой не происходит закрепление водорастворимых белков на планшете, что не позволяет использовать его в иммуноферментном анализе. Также в состав антигена для его фиксации добавляется до 0,3 % фенола, что снижает эффективность
диагностики гиподерматоза.
Известными способами получить предлагаемый антиген для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота нельзя.
Известны различные способы диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота.
Известен способ диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью реакции непрямой гемагглютинации [7].
Принцип данного способа основан на том, что эритроциты, на которых предварительно адсорбированы антигены или антитела, способны агглютинироваться в присутствии
гомологичных антител или антигенов [8, 9].
Для диагностики гиподерматоза с помощью реакции непрямой гемагглютинации получают суспензию эритроцитов барана, отмывают физраствором, стабилизируют их 3 %
раствором формалина, тонизируют раствором танина для повышения сорбционной способности и осаждаемости, сенсибилизируют раствором антигена 1:5 [10].
Исследуемые сыворотки разводят (начиная с разведения 1:200) нормальной кроличьей
сывороткой, разведенной фосфатно-солевым буфером, и вносят по 0,5 мл каждого разведения в луночки пластин, добавляют 1-2 капли диагностикума. Реакцию учитывают спустя 18-20 часов по характеру осадка на дне лунок [11].
Однако описанный способ подготовки сенсебилизированных эритроцитов и других
компонентов для реакции непрямой гемагглютинации представляет собой трудоемкий
способ. Кроме того, недостатком данного способа, несмотря на его достаточно высокую
эффективность (98,5-100 %), является необходимость использования сывороток крови обследуемых животных. Мероприятие, связанное со взятием крови от исследуемых животных, требует дополнительных людских затрат, необходимых для фиксации крупного
рогатого скота. Взятие крови оказывает негативное действие на самих животных, способствуя возникновению стресса, что приводит у них к снижению продуктивности.
Также известен высокоэффективный способ использования антигена во внутрикожной
аллергической реакции для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота [12].
Способ аллергической диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота основан
на возникновении у животных, инвазированных личинками подкожного овода, реакции
гиперчувствительности замедленного типа на гиподерматозный антиген.
Недостатком данного способа является то, что для проведения диагностики требуется
большое количество времени, учет реакции проводится спустя 24-48 часов, при повторном обследовании животных, что требует их повторной идентификации и фиксации. При
проведении диагностики расходуется большое количество антигена на одно исследование,
3
BY 14385 C1 2011.06.30
наработка которого из-за малого веса личинки и трудоемкости их сбора является проблематичной.
Ближайшим аналогом, т.е. прототипом, можно считать способ диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью иммуноферментного анализа с использованием личинок Hypoderma lineatum [13].
Этот способ включает в себя фиксацию в лунках пластикового планшета 0,1 мл очищенного, разведенного на карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) 0,1 M pH 9,5 белкового антигена, инкубирование на начальном этапе 18 часов при 4 °С, отмывание лунок
планшета фосфатно-солевым буфером (ФСБ) (0,01 M фосфатный буфер, 150 mM NaCl,
0,1 % Твин 20, pH 7,4), последовательного внесения в лунки 0,1 мл исследуемых сывороток крови в различных разведениях, повторного инкубирования в течение 1 часа при
37 °С, внесения 0,1 мл пероксидазного конъюгата (антитела к IgG быка, меченные пероксидазой хрена), инкубирования планшета в течение 1 часа при 37 °С, внесения в лунки
0,1 мл субстратного раствора перекиси водорода с 3,3, 5,5 тетраметилбензидином, инкубирования при комнатной температуре 20 минут, остановке реакции добавлением 0,1 мл
1 M H2SO4 и определения интенсивности окраски в лунках на спектрофотометре при
длине волны 450 нм [14].
Недостатком данного способа является то, что для постановки иммуноферментного
анализа используется антиген из личинок Hypoderma lineatum, которые не обитают на
территории Республики Беларусь. Планшет инкубируют на начальном этапе 18 часов при
4 °С, что удлиняет время постановки реакции. Для разведения антигена используется КББ
0,1 M, с pH 9,5, при использовании которого не достигается максимально возможного
уровня закрепления белка на пластике. Для промывки планшета используется ФСБсодержащий низкоконцентрированный раствор фосфатного буфера, также раствор готовят
на изотоническом растворе поваренной соли, с большой концентрацией твина. Приготовление ФСБ с приведенными компонентами приводит к низкой буферной емкости полученного раствора, повышает его пенообразование, что понижает качество отмывки
планшет (остатки пены на планшете и т.д.) и ухудшает конечную диагностическую значимость теста. После применения блокирующего раствора не применяется промывка лунок, что также снижает диагностическую значимость теста. Реакция останавливается
спустя 20 минут добавлением серной кислоты с низкой концентрацией, что удлиняет время постановки реакции и указывает на неоптимальные соотношения состава субстратной
смеси. Также недостатком данного способа является то, что в качестве исследуемого материала используется только сыворотка крови и не используется молоко обследуемых животных, так как предложенный в прототипе способ получения антигена не позволяет
применить его для диагностики фасциолеза с использованием молока (недостоверные результаты). Мероприятие, связанное со взятием крови от исследуемых животных, требует
дополнительных людских затрат, необходимых для фиксации крупного рогатого скота.
Взятие крови оказывает негативное действие на самих животных, способствуя возникновению стресса, что приводит у них к снижению продуктивности.
Задачей, на решение которой направлено заявленное изобретение, является создание
дешевого, более эффективного способа получения антигена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота и способа диагностики, позволяющего выявлять заболевание
на начальных этапах развития гиподерматоза.
Поставленная задача достигается тем, что в способе получения соматического антигена Hypoderma bovis для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота гомогенизируют личинки Hypoderma bovis II и III стадий, гомогенат центрифугируют при 5000 g в
течение 20 минут, полученную надосадочную жидкость обрабатывают ультразвуком
35 кГц 5 раз по 1 минуте, очищают путем фракционирования с помощью сульфата аммония, добавляя его до конечной концентрации 45-55 %, после чего полученный антиген
разводят физиологическим раствором до концентрации 1,2 мг белка в 1 мл.
4
BY 14385 C1 2011.06.30
Кроме того, в способе диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью твердофазного иммуноферментного анализа анализ проводят с соматическим антигеном, причем антиген разводят 0,15 M карбонатно-бикарбонатным буфером, pH 9,8,
фиксируют в лунках иммунологического планшета в течение 8-12 часов при 4 °С, отмывают 0,1 M фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,01 % Твин-20, причем используют
буфер, приготовленный на дистиллированной воде, после чего вносят в отдельные лунки
образец сыворотки крови или молока здорового животного в качестве контроля и образец
сыворотки крови или молока обследуемого животного в качестве опыта, инкубируют образцы 1 час при 37 °С, вносят в лунки пероксидазный конъюгат, содержащий антитела к
IgG быка и инкубируют 1 час при 37 °С, затем вносят хромотогенный субстрат и инкубируют 8-10 минут, реакцию останавливают добавлением 3 M серной кислоты и определяют
оптические плотности контрольного и опытного образцов при 450 нм, при этом вывод о
наличии гиподерматоза у обследуемого животного делают в случае, если оптическая
плотность опытного образца превышает оптическую плотность контрольного в 1,5 раза
или более.
Способ получения антигена для диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота
Для приготовления антигена личинки Hypoderma bovis II и III стадий 5-6 раз отмывают в физиологическом растворе. Личинки гомогенизируют, гомогенат центрифугируют
при 5000g в течение 20 минут для удаления детрита. Далее полученный раствор подвергают ультразвуковой дезинтеграции на УЗДН-1 при 35 кГц 5 раз по 1 минуте. Надосадочную жидкость подвергают очистке фракционированием сульфатом аммония (44-55 %
насыщения).
Содержание белка в антигене определяют методом осаждения ТХУ и спектрофотометрии при 540 нм.
Доводят содержание белка в полученном растворе до 1,2 мг/мл (физиологическим
раствором).
Готовят рабочее разведение антигена для иммобилизации панелей (разводят антиген
1:100 до концентрации белка 12 мкг/мл). Антиген разводят на карбонатно-бикарбонатном
буфере, pH = 9,8 (0,15 M).
Способ диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота.
В лунки иммунологического планшета вносят 0,1 мл антигена, разведенного 0,15 M
КББ, pH 9,8. Планшет с антигеном инкубируют 8-12 часов при 4 °С, после этого удаляют
избыток антигена пятикратной отмывкой ФСБТ (0,1 M фосфатный буфер на бидистиллированной воде, 0,01 % Твин-20, pH 7,4). Вносят в лунки 0,1 мл сыворотки крови (разведение 1:25) или молока (разведение 1:25) в растворе ФСБ (0,1 M фосфатный буфер на
бидистиллированной воде, pH 7,4). Инкубируют 1 час при 37 °С, промывают лунки ФСБТ
и добавляют 0,05 мл меченных пероксидазой антител к IgG крупного рогатого скота в
растворе ФСБ. Через 1 час инкубации отмывают планшет ФСБТ и вносят в лунки 0,05 мл
субстратного раствора перекиси водорода с ортофенилендиамином (ОФД). Инкубируют
10 минут при комнатной температуре и останавливают реакцию добавлением 0,1-0,15 мл
3 M H2SO4. Интенсивность окраски в лунках определяют на спектрофотометре при 450 нм
(А450).
Превышение оптической плотности исследуемого образца над контролем (S/N) в
1,5 раза и более свидетельствует об инвазировании крупного рогатого скота личинками
подкожного овода - больное животное.
Изобретение позволяет диагностировать гиподерматоз крупного рогатого скота на
ранних стадиях развития заболевания с использованием антигена из личинок подкожного
овода, обитающего на территории республики.
Для изготовления антигена в качестве сырья используются личинки подкожного овода
вида Hypoderma bovis, единственного обитающего на территории Республики Беларусь.
Личинки подкожного овода являются промежуточной стадией метаморфоза имаго под5
BY 14385 C1 2011.06.30
кожного овода рода Hypoderma, отряда Diptera (двукрылые), подотряда Brachycera (короткоусые), вид Hypoderma bovis [16].
Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1. Получение антигена.
Получили комплекс антигенов двух видов (соматический и экскреторный) из личинок
Hypoderma bovis.
Исходный материал (личинки Hypoderma bovis II и III стадий) собрали при убое больных гиподерматозом животных на мясокомбинате. Полученные личинки 5-6 раз отмывали
в физиологическом растворе.
1. Для получения экскреторных антигенов отмытые личинки H. bovis сразу после сбора на мясокомбинате поместили в физиологический раствор (37 °С) и инкубировали в течение 24 часов при 37 °С. Полученный раствор профильтровали и центрифугировали при
5000 g в течение 40 минут.
2. Для получения 1 серии соматических антигенов личинки гомогенизировали на гомогенизаторе. Гомогенат центрифугировали при 5000 g в течение 20 минут для удаления
детрита. Далее полученный раствор подвергли ультразвуковой дезинтеграции на УЗДН-1
при 35 кГц 5 раз по 1 минуте. Надосадочную жидкость подвергли очистке фракционированием сульфатом аммония (45-55 % насыщения).
3. Для получения 2 серии соматических антигенов личинки гомогенизировали на гомогенизаторе. Гомогенат центрифугировали при 5000 g в течение 20 минут для удаления
детрита. Далее полученный раствор подвергли ультразвуковой дезинтеграции на УЗДН-1
при 35 кГц 5 раз по 1 минуте. Надосадочную жидкость подвергли очистке фракционированием сульфатом аммония (20-25 % насыщения).
4. Для получения 3 серии соматических антигенов личинки гомогенизировали на гомогенизаторе. Гомогенат центрифугировали при 5000 g в течение 20 минут для удаления
детрита. Далее полученный раствор подвергли ультразвуковой дезинтеграции на УЗДН-1
при 35 кГц 5 раз по 1 минуте. После ультразвуковой дезинтеграции осуществили концентрирование на мембране с порогом разделения 100±10 кДа.
5. Для получения 4 серии соматических антигенов личинки освобождали от хитина,
гомогенизировали на гомогенизаторе. Далее полученный раствор подвергли ультразвуковой дезинтеграции на УЗДН-1 при 35 кГц 5 раз по 1 минуте. Гомогенат центрифугировали
при 10000 g в течение 20 минут для удаления детрита. Надосадочную жидкость подвергли
очистке аффинной хроматографией.
Содержание белка в полученных образцах определили методом осаждения ТХУ и
спектрофотометрии при 540 нм.
Пример 2. Испытание приготовленных серий антигенов с сыворотками крови животных при клиническом проявлении гиподерматоза крупного рогатого скота
Поставили иммуноферментный анализ (непрямая гетерогенная твердофазная модификация ИФА) с полученными антигенами.
Результаты исследований:
Испытание приготовленных 5 серий антигенов с сыворотками крови и молоком
животных при клиническом проявлении гиподерматоза крупного рогатого скота
Среднее превышение оптичеСтандартное отклонение
ской плотности положитель- среднего превышения оптиИспользуемая серия
ной пробы над отрицательной
ческой плотности
антигена
сыворотки
сыворотки крови
молока
молока
крови
Экскреторный антиген
1,08
0,97
0,41
0,26
1 серия соматического ан1,52
1,57
0,11
0,13
тигена
6
BY 14385 C1 2011.06.30
Используемая серия
антигена
2 серия соматического антигена
3 серия соматического антигена
4 серия соматического антигена
Продолжение таблицы
Среднее превышение оптичеСтандартное отклонение
ской плотности положитель- среднего превышения оптиной пробы над отрицательной
ческой плотности
сыворотки
сыворотки крови
молока
молока
крови
1,23
1,11
0,29
0,36
1,12
0,90
0,37
0,29
1,41
1,20
0,42
0,37
Таким образом, 2 серия соматического антигена показала наиболее приемлемые результаты для дальнейшего его использования (наибольшее значение среднего превышения
оптической плотности положительной пробы над отрицательной) с последующей оптимизацией параметров способа диагностики для увеличения его диагностической значимости.
Пример 3. Оптимизация параметров способа диагностики для увеличения его диагностической эффективности
3.1. Испытание использования различных составов буферных растворов.
Были приготовлены различные композиции КББ и ФСБ:
КББ: 0,05 M с pH 9,4; 0,05 M с pH 9,6; 0,05 M с pH 9,8; 0,05 M с pH 10,0; 0,1 M с pH
9,4; 0,1 M с pH 9,6; 0,1 M с pH 10,0; 0,15 M с pH 9,4; 0,15 M с pH 10,0; 0,2 M с pH 9,4;
0,2 M с pH 9,6; 0,2 M с pH 10,0;
ФСБТ: 0,01 M; 0,15 M; 0,20 M с pH 7,4.
Данные растворы ФСБ приготавливались в нескольких сериях:
1. На бидистиллированной воде с добавлением 0,025; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 % Твин-20.
2. На физрастворе с добавлением 0,025; 0,05; 0,1; 0,15; 0,2 % Твин-20.
Наиболее высокие показатели среднего превышения оптической плотности положительной пробы над отрицательной (в 2 раза и более) были получены при сочетании следующих буферов: КББ 0,15 M с pH 9,8; ФСБТ 0,1 M фосфатный буфер на бидистиллированной воде, 0,05 % Твин-20, pH 7,4.
3.2 Испытание различного времени закрепления белка на планшете.
Провели серию опытов с различным временем инкубирования планшета на начальном
этапе при 4 °С. Планшеты инкубировали 5, 6, 7, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 24 часа.
Установлено, что при инкубировании планшета с антигеном в течение 5-7 часов результаты исследований резко снижались (превышение оптической плотности положительной пробы над отрицательной было в 1,2-1,3 раза), тогда как при более длительной
инкубации (14-24 часа) наблюдались схожие результаты (превышение оптической плотности положительной над отрицательной сывороткой было в 2 раза и более).
Таким образом, наиболее приемлемые результаты были достигнуты при инкубировании планшета с антигеном в течение 8-12 часов (превышение оптической плотности положительной над отрицательной сывороткой было в 2 раза и более).
3.3 Испытание различных способов остановки ферментативной реакции.
Провели серию опытов по остановке ферментативной реакции добавлением серной
кислоты в различных количествах (0,025, 0,05, 0,10, 0,15, 0,2 мл) и концентрации (1 M,
2 M, 3 M, 4 M).
В результате исследований установлено, что полная остановка реакции происходит
при добавлении 0,1-0,15 мл 3 M серной кислоты через 8-10 минут.
Таким образом, были подобраны этапы и компоненты для приготовления антигена из
личинок подкожного овода, предназначенного для выявления животных, инвазированных
7
BY 14385 C1 2011.06.30
личинками Hypoderma bovis на ранних стадиях развития заболевания по исследованию
сыворотки крови или молока обследуемых животных.
Очищение антигена из личинок Hypoderma bovis путем фракционирования с помощью
сульфата аммония до достижения насыщения 45-55 % позволяет достигнуть необходимой
степени очистки для оптимального закрепления полученного антигена на планшете в отличие от антигена, полученного в прототипе. Инкубирование планшета с антигеном на
начальном этапе 8-12 часов позволяет сократить время постановки диагноза на 6 часов по
сравнению с прототипом, не ухудшив его диагностической значимости. Использование
для разведения карбонатно-бикарбонатного буфера 0,15 M с pH 9,8 позволяет достигать
максимально возможного уровня закрепления антигена на планшете по сравнению с прототипом, где используется КББ 0,1 M с pH 9,5. Промывание планшеты фосфатно-солевым
буфером 0,1 M, содержащим 0,01 % Твин-20, на дистиллированной воде не повышает его
пенообразование, что позволяет достигнуть оптимального качества отмывки планшета и
способствует повышению конечной диагностической значимости теста, в отличие от прототипа - 0,01 M фосфатного буфера, содержащего 150 mM хлористого натрия и 0,1 %
Твина-20, который оставляет остатки пены на планшете. Остановка реакции через 8-10
минут путем добавления серной кислоты в объеме 0,10-0,15 мл 3 М, на 10-12 минут сокращает время ферментативной реакции по сравнению с прототипом, позволяет полностью остановить ферментативную реакцию и не допустить погрешность, возникающую в
способе, описанном в прототипе при использовании 0,1 мл 1 M серной кислоты. Использование в качестве исследуемого материала не только сыворотки крови, как в прототипе,
но и молока обследуемых животных позволяет избежать дополнительных людских затрат,
необходимых для фиксации крупного рогатого скота, и позволяет избежать взятия крови,
которое оказывает негативное действие на самих животных, способствуя возникновению
стресса, что приводит у них к снижению продуктивности.
Использование вышеуказанных параметров в их совокупности позволило подобрать
наиболее оптимальные этапы приготовления антигена из личинок Hypoderma bovis для
ранней диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота и способа диагностики гиподерматоза крупного рогатого скота, позволяющего выявлять инвазированных животных
на начальных этапах развития заболевания.
Источники информации:
1. Степанова Е.А. Особенности эпизоотической ситуации и сравнительная эффективность препаратов при гиподерматозе крупного рогатого скота / Е.А.Степанова,
М.В.Якубовский, Т.Я.Мясцова, С.И.Лавор, Н.Н.Угначева // Ветеринарная медицина Беларуси. - 2006. - № 3. - С. 17-23.
2. Непоклонов А.А. Оздоровление стад крупного рогатого скота от гиподерматоза /
А.А.Непоклонов // Ветеринария. - 2002. - № 10. - С. 3-6.
3. Фишелевич М.А. Распространение оводов, паразитирующих на крупном рогатом
скоте и лошадях в Белоруской CCP / М.А.Фишелевич // Труды ВНИИВС, 1962. - С. 44-47.
4. Степанова Е.А. Новые способы диагностики и профилактики гиподерматоза крупного рогатого скота / Е.А.Степанова, М.В.Якубовский, Т.Я.Мясцова // Сборник статей
Международной научно-практической конференции, Воронеж, 22-23 июня 2006 года. Воронеж: Научная книга, 2006. - С. 377-380.
5. Маврин Н.А. Антигены из личинок Hypoderma lineatum для иммуноферментного
анализа
/
Н.А.Маврин,
А.А.Непоклонов,
В.С.Богданова,
А.Д.Забережный,
Т.В.Гребенникова // Ветеринария. - 2007. - № 9. - С. 11-14.
6. Степанова Е.А. Иммунодиагностика, эпизоотология и ранняя профилактика гиподерматоза крупного рогатого скота: Автореф. дис… канд. вет. наук: 03.00.19 /
Е.А.Степанова. - Минск, 2004. - С. 5-6 (прототип).
8
BY 14385 C1 2011.06.30
7. Ямов В. Ранняя диагностика гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью реакции непрямой гемагглютинации / В.Ямов, В.Потемкин, H.Калинина // Научно-технический бюл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии. - Тюмень, 1976. - Вып. 7. С. 44-50 (прототип).
8. Калинина Н.Г. Динамика иммунобиологических реакций при гиподерматозе крупного рогатого скота / Н.Г.Калинина // Научно-технический бюл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии. - Тюмень, 1978. - Вып. 14. - С. 62-71.
9. Практикум по вирусологии / Под редакцией В.М.Жавненко. - Мн.: ДизайнПРО,
1998. - С 102.
10. Ямов В. Ранняя диагностика гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью
реакции непрямой гемагглютинации / В.Ямов, В.Потемкин, H.Калинина // Научнотехнический бюл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии. - Тюмень, 1976. Вып. 7. - С. 45-46.
11. Ямов В. Ранняя диагностика гиподерматоза крупного рогатого скота с помощью
реакции непрямой гемагглютинации / В.Ямов, В.Потемкин, Н.Калинина // Научнотехнический бюл. ВНИИ ветеринарной энтомологии и арахнологии. - Тюмень, 1976. Вып. 7. - С. 46-47.
12. Степанова Е.А. Иммунодиагностика, эпизоотология и ранняя профилактика гиподерматоза крупного рогатого скота: Автореф. дис… канд. вет. наук: 03.00.19 /
Е.А.Степанова. - Минск, 2004. - С. 8.
13. Маврин Н.А. Антигены из личинок Hypoderma lineatum для иммуноферментного
анализа
/
Н.А.Маврин,
А.А.Непоклонов,
В.С.Богданова,
А.Д.Забережный,
Т.В.Гребенникова // Ветеринария. - 2007. - № 9. - С. 11-14 (прототип).
14. Маврин Н.А. Антигены из личинок Hypoderma lineatum для иммуноферментного
анализа
/
Н.А.Маврин,
А.А.Непоклонов,
В.С.Богданова,
А.Д.Забережный,
Т.В.Гребенникова // Ветеринария. - 2007. - № 9. - С. 12.
15. Грунин К.Я. Подкожный овод (Hypodermatidae). Фауна СССР / К.Я.Грунин. - M.,
1962. - 237 с.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
9
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
137 Кб
Теги
by14385, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа