close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14592

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/42
G 01N 30/02
(2006.01)
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ
ТИАМИНМОНОФОСФАТАЗЫ
(21) Номер заявки: a 20080876
(22) 2008.06.30
(43) 2010.02.28
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Научно-производственный
центр "Институт фармакологии и
биохимии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Макарчиков Александр
Федорович; Русина Ирина Михайловна; Шляхтун Алексей Генрихович; Лучко Татьяна Александровна;
Макар Елена Антоновна (BY)
BY 14592 C1 2011.08.30
BY (11) 14592
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Научно-производственный центр "Институт фармакологии и
биохимии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) KIESSLING K.-H. et al. // Biochim. Biophys. Acta. - 1960. - Vol. 43. - No. 2. - P.
335-336.
LAFORENZA U. et al. // J. Neurochem. 1988. - Vol. 51. - No. 3. - P. 730-735.
BUCSICS A. et al. // Journal of Neuroscience Methods. - 1988. - Vol. 24. - No. 2. P. 155-162.
LU J. et al. // Clinical Chemistry. - 2008. Vol. 54. - No. 5. - P. 901-906.
LYNCH P.L.M. et al.// J. Chromatogr. A. 2000. - Vol. 881. - P. 267-284.
(57)
Способ определения активности тиаминмонофосфатазы путем определения скорости
тиаминмонофосфатазной реакции, отличающийся тем, что после остановки тиаминмонофосфатазной реакции осуществляют дериватизацию образовавшихся тиаминмонофосфата и тиамина, определяют количество полученных тиохроммонофосфата и тиохрома с
помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии в 50 мМ Na-фосфатном буфере
с pH 8,0, содержащем 2,5 % тетрагидрофурана, на колонке Zorbax SB-C18 3 × 100 мм с
протекторным картриджем 4,6 × 12,5 мм при температуре 25 °С и скорости потока
1 мл⋅мин-1 и рассчитывают скорость тиаминмонофосфатазной реакции.
Изобретение относится к разработке способов определения активности ферментов и
может быть использовано для определения содержания и исследования кинетических
свойств тиаминмонофосфатазы (ТМФаза) в биологических объектах.
Тиаминмонофосфат (ТМФ) обнаружен в различных объектах живой природы. В процессе метаболизма в тканях млекопитающих ТМФ подвергается дефосфорилированию
мембранно-связанными фосфатазами в соответствии с реакцией ТМФ → тиамин + неорганический фосфат (Pi).
Известны способы регистрации ТМФазной активности по количеству продукта реакции - Pi (Kiessling, Tilander//Biochim. Biophys. Acta, 1960: 43, 335-336; Ogawa, Sakai//Ann.
NY Acad. Sci., 1982: 378, 188-214; Laforenza et al.//J. Neurochem., 1988: 51, 730-735).
BY 14592 C1 2011.08.30
Недостатком данных способов является низкий предел обнаружения Pi (10-20 нмоль),
вследствие чего они непригодны для измерений активности ТМФазы при концентрациях
субстрата менее 50 мкМ.
Задача заявляемого изобретения состоит в разработке способа определения ТМФазной
активности, позволяющего проводить измерения ферментативной активности при концентрациях субстрата, близких к физиологическим (порядка 5-10 мкМ).
Указанная задача решается за счет применения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для разделения и оценки содержания в реакционной смеси субстрата ТМФ - и второго продукта реакции - тиамина.
Способ осуществляют следующим образом:
1) составляют смесь для проведения ТМФазной реакции, внося в пробирку 0,05 мл
буферного раствора, 0,05 мл 50 мМ MgCl2, раствор ТМФ и дистиллированную H2O до
общего объема 0,49 мл. Смесь прогревают в термостате при 37 °С в течение 3 мин. Реакцию начинают, добавляя 0,01 мл исследуемого образца (гомогенат ткани), и проводят 60120 мин при 37 °С. Контрольную пробу готовят аналогичным образом, за исключением
того, что исследуемый образец вносят в реакционную смесь непосредственно перед остановкой реакции;
2) реакцию останавливают, внося в пробирку 0,05 мл 55 %-ной трихлоруксусной кислотой (ТХУ). Осадок удаляют центрифугированием;
3) в чистую пробирку отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости и экстрагируют ТХУ
диэтиловым эфиром (0,6 мл). Экстракцию повторяют 3 раза;
4) проводят дериватизацию, добавляя к 0,05 мл обработанной диэтиловым эфиром
пробы 0,031 мл окислителя (4,3 мМ K3[Fe(CN)6] в 12,5 % растворе NaOH) и встряхивая
смесь 30 сек;
5) разделяют образовавшиеся тиохроммонофосфат (ТхМФ) и тиохром методом
ВЭЖХ, рассчитывают относительные площади пиков (в %) и выражают активность
ТМФазы в выбранных единицах (мкМ⋅мин-1).
Изобретение иллюстрируется примерами.
Пример 1
Разделение стандартной смеси ТМФ и тиамина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с
предколоночной дериватизацией. Разделение осуществляют в хроматографе Agilent 1200 с
флуоресцентным детектором на колонке Zorbax SB-C18 3 × 100 мм с протекторным картриджем 4,6 × 12,5 мм при температуре 25 °С и скорости потока 1 мл·мин-1. Мобильная фаза: 50 мМ Na-фосфатный буфер, pH 8,0, содержащий 2,5 % тетрагидрофурана. Настройки
детектора: длина волны возбуждения - 365 нм, эмиссии - 465 нм. Продолжительность разделения 5 мин. Перед инжекцией в хроматограф пробы окисляют с целью превращения
ТМФ и тиамина соответственно в ТхМФ и тиохром (дериватизация). Для этого к 0,05 мл
стандартной смеси добавляют 0,031 мл раствора, содержащего 4,3 мМ K3[Fe(CN)6] в
12,5 % NaOH, и встряхивают в течение 30 сек. Затем раствор разбавляют 0,05 M Naфосфатным буфером с pH 7,2 (0,9 мл) и нейтрализуют до pH ≈ 8,0, добавляя 0,035 мл 1 M
HCl. Степень нейтрализации контролируют с помощью индикаторной бумажки.
При разделении в указанных условиях среднее время удерживания ТхМФ составляет
0,95 мин, тиохрома - 3,82 мин (фиг. 1).
Как следует из таблицы, стандартное отклонение, являющееся критерием воспроизводимости, при определении ТМФ составляет 6,461, при определении тиамина -1,058. Точность метода, характеризуемая процентным отношением ошибки к среднему значению
определяемой величины, равна 1,91 % для ТМФ и 0,37 % - для тиамина.
Данная хроматографическая система позволяет регистрировать < 50 фмоль ТхМФ и
тиохрома в вводимой в хроматограф пробе, что соответствует концентрациям ТМФ и тиамина в исходном растворе < 50 нМ.
2
BY 14592 C1 2011.08.30
Таблица
Определение
Площадь пика,
ТхМФ
Тиохром
1
2
188,5
163,3
195,6
165,3
Ошибка
Среднее Стандартное
среднего
значение отклонение
3
значения
201,4
195,2
6,461
3,730
164,9
164,5
1,058
0,611
Точность, %
1,91
0,37
Пример 2
Определение pH-оптимума ТМФазной активности в гомогенате печени крысы. Гомогенат готовили, измельчая навеску печени в стеклянном гомогенизаторе в 4-х объемах 50
мМ трис-HCl буфера с pH 7,3, содержащего 0,15 M KCl и 0,2 мМ ЭДТА. Реакционная
смесь для определения ТМФазной активности состояла из 50 мМ буферного раствора, 5
мМ MgCl2, 100 мкМ ТМФ и 0,01 мл аликвоты гомогената в объеме 0,5 мл.
Реакцию осуществляли в течение 57 мин при 37 °С и останавливали добавлением 0,05 мл
55 %-ной ТХУ. Осадок удаляли центрифугированием, отбирали 0,2 мл надосадочной
жидкости и экстрагировали ТХУ диэтиловым эфиром (0,6 мл), повторяя экстракцию 3 раза. В контрольные пробы гомогенат вносили непосредственно перед остановкой реакции.
Дериватизацию и разделение субстрата и продукта реакции проводили, как описано в
примере 1.
Расчет скорости реакции проводят следующим образом.
Дано:
условия проведения реакции - 50 мМ трис-HCl буфер с pH 9,0, 5 мМ MgCl2, 100 мкМ
ТМФ; время проведения реакции - 57 мин.
Результаты измерений: площадь пика ТхМФ в контрольной пробе - Si(K) = 340,2,
площадь пика тиохрома в контрольной пробе - S2(K) = 1,0; площадь пика ТхМФ в опытной пробе - Si(O) = 348,6; площадь пика тиохрома в опытной пробе - S2(O) = 26,7
Вычисления:
1) находят долю тиохрома в контрольной пробе: S2(K)/(S2(K) + S1(K)) = 1,0/(1,0 +
+ 340,2) = 0,003;
2) находят долю тиохрома в опытной пробе: S2(O)/(S2(O) + S1(O)) = 26,7/(26,7 +
+ 348,6) = 0,071;
3) находят разность долей тиохрома в опытной и контрольной пробах: 0,0710,003 = 0,068;
4) находят концентрацию образовавшегося в реакции тиамина, умножая разность долей
тиохрома на исходную концентрацию ТМФ в реакционной смеси: 0,068 × 100 = 6,8 мкМ;
5) находят скорость реакции (активность) путем деления концентрации образовавшегося в реакции тиамина на время реакции: 6,8/57 = 0,120 мкМ⋅мин-1.
Зависимость ТМФазной активности гомогената печени крысы от pH изображена на
фиг. 2.
Пример 3
Определение константы Михаэлиса (Kм) фермента гидролиза ТМФ в гомогенате печени крысы при pH 9,0. Гомогенат получали, как описано в примере 2. Для измерений
начальной скорости ТМФазной реакции готовили серию пробирок с реакционной смесью
объемом 0,5 мл, содержащей 50 мМ трис-HCl буфер с pH 9,0, 5 мМ MgCl2 и возрастающие
от 7 до 1300 мкМ концентрации ТМФ. Реакцию начинали добавлением 0,01 мл гомогената
и проводили в течение 120 мин. Реакцию останавливали, внося по 0,05 мл 55 %-ной ТХУ.
Осадок удаляли центрифугированием, отбирали 0,2 мл надосадочной жидкости и экстрагировали ТХУ диэтиловым эфиром (0,6 мл), повторяя экстракцию 3 раза. В контрольные
пробы гомогенат вносили непосредственно перед остановкой реакции. Дериватизацию и
разделение субстрата и продукта реакции проводили, как описано в примере 1. Результа-
3
BY 14592 C1 2011.08.30
ты представлены в координатах Хейнса на фиг. 3, из которой видно, что при pH 9,0 значение Kм ТМФазы гомогената печени крысы составляет 473 мкМ.
Таким образом, предложенный способ отличается высокой чувствительностью (< 50
фмоль ТхМФ и тиохрома в пробе), точностью (1,91 % при определении ТМФ и 0,37 % при
определении тиамина) и позволяет проводить измерения ТМФазной активности в биологических образцах при концентрациях субстрата ниже 50 мкМ.
Предложенный способ может использоваться в медико-биологических исследованиях
для определения ТМФазной активности, идентификации и изучения свойств ферментов,
осуществляющих гидролиз ТМФ в биологических объектах.
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
137 Кб
Теги
by14592, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа