close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14662

код для вставкиСкачать
BY 14662 C1 2011.08.30
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 14662
(13) C1
(19)
(46) 2011.08.30
(12)
(51) МПК
C 07D 307/30
A 61P 37/04
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
(2006.01)
(2006.01)
7,9-ДИОКСО-10-ОКСА-11-МЕТИЛ-13-АЗА-1-ГОМОПРОСТ-8(12)-ЕН,
ОБЛАДАЮЩИЙ ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ
(21) Номер заявки: a 20100407
(22) 2010.03.16
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Голубева Марина Брониславовна; Кузьмицкий Болеслав
Брониславович; Лахвич Федор
Адамович; Любин Геннадий Семенович; Пашковский Феликс Сигизмундович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) ПАШКОВСКИЙ Ф.С. и др. // Весцi Нацыянальнай акадэмii навук Беларусi.
Сер. хiм. навук. - 2009. - № 2. - С. 57-62.
ЛЮБИН Г.С. и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2007. - Т. 41,
№ 11. - С. 11-18.
BY 10155 C1, 2007.
BY 8987 C1, 2007.
US 4239778, 1980.
US 6417228 B1, 2002.
(57)
7,9-Диоксо-10-окса-11-метил-13-аза-1-гомопрост-8(12)-ен формулы
O
O
,
BY 14662 C1 2011.08.30
O
N
H
H3C
обладающий иммуностимулирующей активностью.
Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к новому веществу - синтетическому аналогу простагландина B1 со структурной формулой (I), которое может быть использовано в качестве иммуностимулятора в фармации и медицине.
O
O
(I)
O
N
H
H3C
Химическое наименование заявляемого соединения: 7,9-диоксо-10-окса-11-метил-13аза-1-гомопрост-8(12)-ен.
BY 14662 C1 2011.08.30
Молекулярная формула: C20H35NO3.
Молекулярная масса: 337 г/моль.
Известно соединение, которое относится к ряду 13-азапростаноидов и обладает высокой иммуностимулирующей активностью [1], но не является структурным аналогом соединения (I).
Задача изобретения - новый синтетический аналог простагландина B1, обладающий
фармакологически реальной иммуностимулирующей активностью.
Поставленная задача решается заявляемым соединением - 7,9-диоксо-10-окса-11метил-13-аза-1-гомопрост-8(12)-еном (I), который характеризуется наличием кетогрупп в
положениях 7 и 9, атома кислорода в положении 10, метильной группы в положении 11,
NH-группы в положении 13, удлинением α-цепи на одно метиленовое звено, а также отсутствием терминальной карбоксифункции в α-цепи, транс-13(14)-двойной связи и 15гидроксигруппы в ω-цепи.
Способ получения заявляемого соединения приведен на схеме 1 и подтверждается
примером его выполнения.
Схема 1.
O
O
O
HOC(O)(CH2)6CH3,
Et3N/ДЦГК/ДМАП
O
O
O
O
H3C
(III)
H3C
CH2N2/Et2O
(II)
MeO
O
O
O
+
O
O
O
H3C
OMe
(V)
H3C
(IV)
1) H2N(CH2)6CH3, 80-100°C,
2)хроматографическое разделение
региоизомеров
O
O
O
N
H
H3C
(I)
Пример.
Способ получения заявляемого соединения.
Стадия 1. Получение 3-каприлоил-5-метилтетроновой кислоты (III).
К 1,03 г (9 ммоль) 5-метилтетроновой кислоты (II) в безводном хлористом метилене
(0 °С) при перемешивании приливают 1,38 мл (9,9 ммоль) триэтиламина. К образовавшемуся
раствору
триэтиламмонийной
соли
последовательно
добавляют
42
BY 14662 C1 2011.08.30
(диметиламино)пиридин (0,36 г, 2,97 ммоль), 1,56 мл (9,9 ммоль) каприловой кислоты и,
наконец, по порциям - дициклогексилкарбодиимид (2,22 г, 10,8 ммоль). Охлаждение убирают и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 15 ч. Выпавшую
дициклогексилмочевину отфильтровывают и промывают этилацетатом. Объединенные
фильтраты упаривают. К остатку добавляют 80 мл диэтилового эфира, 25 мл 1,5 н. HCl и
полученную смесь встряхивают в делительной воронке. После отделения водного слоя
органическую фазу промывают 1,5 н. HCl (20 мл) и водой (20 мл), сушат MgSO4. После
выпаривания растворителя продукт реакции очищают на колонке с силикагелем (гексан эфир, градиентное элюирование) и перекристаллизовывают. Выход 81 %. Т. пл. 39-41 °С
(эфир).
ИК-спектр (KBr), ν, см-1: 1475, 1595 пл., 1620 (макс.), 1675, 1685 пл., 1760.
Спектр ЯМР 1H (CDCl3), δ м.д., (J, Гц): 0,90 т (3H, CH3, J 6,5), 1,18-1,46 м (8H, 4CH2),
1,53 д (3Н, CHCH3, J 7,0), 1,71 квинтет [2Н, C(O)CH2CH2, J 7,5], 2,92 т [2Н, C(O)CH2, J
7,5], 4,80 м (1H, CHCH3), 9,38 ушир. сигнал (1H, OH енола).
Масс-спектр: 240 (M+). Вычислено для C13H20O4. Мол. мас. 240,30 г/моль.
Стадия 2. Получение смеси региоизомерных метиловых енольных эфиров (IV и V).
К раствору 0,48 г (2 ммоль) β-трикарбонильного соединения (III) в 10 мл диэтилового
эфира при перемешивании по порциям добавляют эфирный раствор диазометана, полученный при обработке N-нитрозометилмочевины 40 %-ным водным раствором щелочи.
По окончании выделения пузырьков газа и обесцвечивания реакционной смеси последнюю выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель упаривают в
вакууме, получив в остатке 0,51 г смеси региоизомерных енольных эфиров (IV, V), которые без очистки и разделения вводят в стадию 3.
Стадия 3. Синтез 7,9-диоксо-10-окса-11-метил-13-аза-1-гомопрост-8(12)-ена (I).
К 0,51 г смеси енольных эфиров (IV, V) приливают 5 мл (33,3 ммоль) гептиламина.
Реакционную смесь выдерживают при 80-100 °С до окончания реакции (контроль методом тонкослойной хроматографии). К охлажденной реакционной смеси добавляют 50 мл
хлороформа, 50 мл 1,5 н. соляной кислоты и полученную смесь встряхивают в делительной воронке. После отделения водного слоя органическую фазу промывают 1,5 н. HCl (25 мл)
и водой (50 мл), сушат сульфатом натрия. После выпаривания растворителя продукты реакции разделяют на колонке с силикагелем (элюент - эфир-петролейный эфир, градиентное элюирование). Целевое соединение (I) (0,17 г) выделяют в виде маслообразного
вещества желтого цвета. Выход 25 % в расчете на β-трикарбонильное соединение (III).
ИК-спектр (пленка), ν, см-1: 1465, 1495, 1595, 1640 (макс.), 1740.
Спектр ЯМР 1H (CDCl3), δ м.д, (J, Гц): 0,87 т + 0,89 т (6Н, 2CH3 α- и ω-цепей, J 7,0),
1,20-1,41 м (16Н, 8CH2), 1,57 д (3Н, CH3CH, J 6,5), 1,61 квинтет (2H, CH2, J 7,5), 1,68 квинтет (2Н, CH2, J 7,5), 2,87 т [2Н, C(O)CH2, J 7,5], 3,27 секстет (1H, J 7,0), 3,35 секстет (1H, J
7,0), 5,01 к (1H, CHCH3, J 6,5), 9,73 ушир. сигнал (1H, NH).
Спектр ЯМР 13C (CDCl3), δ м.д: 14,04 (CH3), 14,12 (CH3), 19,02 (CH3), 22,54 (CH2),
22,66 (CH2), 24,22 (CH2), 26,57 (CH2), 28,81 (CH2), 29,23 (CH2), 29,34 (CH2), 30,01 (CH2),
31,57 (CH2), 31,76 (CH2), 39,65 (CH2), 45,01 (CH2), 71,07 (CH), 94,44 (Счетв), 170,24 (Счетв),
176,86 (Счетв), 199,91 (Счетв).
Масс-спектр: 337 (M+). Вычислено для C20H35NO3. Мол. мас. 337,5 г/моль.
Иммунофармакологическая активность заявляемого соединения испытана экспериментально с использованием комплекса стандартных методик, которые позволяют оценить иммунотропный эффект изучаемого вещества и идентифицировать то звено
иммунитета, на которое действует данное вещество [2]. Результаты испытания в опытных
и контрольных группах животных обработаны, сравнены и оценены статистически с использованием параметрического метода и критерия t Стьюдента и представлены в табл. 1-3.
Результаты испытаний, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что заявляемое соединение в дозах 2,5-5,0 мкг/кг внутрь активирует B-клеточное (гуморальное) зве3
BY 14662 C1 2011.08.30
но иммунитета как у высокореагирующих на антиген эритроцитов барана (ЭБ) мышей линии CBA, так и у слабореагирующих на тот антиген мышей линии C57Bl/6. Минимальная
экспериментальная терапевтическая доза заявляемого соединения составляет 2,5 мкг/кг
внутрь (в желудок). Стимулирующий эффект соединения достигает максимума при введении в дозе 5 мкг/кг в индуктивную фазу иммуногенеза. Дальнейшее увеличение тестируемой дозы заявляемого соединения приводит к ослаблению эффекта, но стимулирующий
вектор действия его на иммунную систему в реальном диапазоне фармакологических доз
не претерпевает реверсию на супрессивный, что отличает заявляемое соединение от известных химических иммуномодуляторов. В табл. 1 представлены также данные, показывающие, что заявляемое соединение активирует T-клеточноопосредованный иммунный
ответ в реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ). Индекс РГЗТ (5
мкг/кг) увеличивается на 50 % по сравнению с иммунизированным контролем, если вещество вводится одновременно с сенсибилизирующей дозой антигена.
В табл. 2 представлены результаты испытания влияния заявляемого соединения на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в опытах на мышах ICR ex vivo in
vitro. Очевидно, что заявляемое соединение в дозах 2,5-5 мкг/кг усиливает спонтанную и
хемотаксическую (направленную) миграцию перитонеальных макрофагов. С увеличением
дозы соединения жизнеспособность макрофагов оптимизируется с 91 % в контрольных
сериях до 94 % после введения соединения в дозе 5 мкг/кг.
Таким образом, заявляемое соединение активирует формирование клона антигенспецифической субпопуляции регуляторных Т-лимфоцитов и клона антигенспецифических
B-лимфоцитов, образование которых протекает под влиянием Т-хелперов, а также усиливает спонтанную и хемотаксическую миграцию фагоцитирующих перитонеальных макрофагов, что свидетельствует о влиянии соединения не только на специфический, но и на
неспецифический иммунитет.
В табл. 3 представлены результаты испытания иммунотерапевтической эффективности заявляемого соединения в условиях моделирования иммунодефицита у мышей-самок
линии CBA. После введения животным циклофосфамида (10 мг/кг п/к ежедневно в течение 3 дней) угнетаются все показатели гуморального иммунного ответа. Очевидно, что
следствием коррекции индуцированного иммунодефицита под влиянием соединения (I) (5
мкг/кг в/ж однократно) является восстановление относительного и абсолютного количества АОК на 85 % по сравнению с "нелеченным" контролем. Показано, что в случае
острого облучения мышей в дозе 30 сГр имеет место супрессия всех показателей Вклеточного звена иммунитета. Восстановление относительного и абсолютного содержания АОК в селезенке под влиянием заявляемого соединения достигает 170-180 %, селезеночного индекса - на 52 % по сравнению с облученными животными, и эти показатели
практически выходят на уровень показателей у нормометрических животных.
Исследование токсичности заявляемого соединения (I) проводили на мышах ICR [3].
Испытываемые дозы подбирались так, что каждая последующая отличается от предыдущей в 1,5 раза, причем каждую дозу вводили только одному животному. Для мышей ICR
выбрана следующая шкала доз заявляемого соединения: 750, 1130, 1690, 2540, 3810, 5000
мг/кг. Поскольку ни одна из введенных доз, включая максимальную по техническим возможностям, не вызвала гибели мышей при введении внутрибрюшинно, предварительная
оценка токсичности заявляемого соединения позволяет заключить, что оно относится к V
классу практически нетоксичных коммерческих продуктов [4].
4
BY 14662 C1 2011.08.30
5
Таблица 1
Влияние соединения (I) (7,9-диоксо-10-окса-11-метил-13-азапростаноида) на гуморальный (B-клеточный) иммунный
ответ у высокореагирующих мышей CBA и низкореагирующих мышей C57Bl/6 на антиген и T-клеточный иммунный
ответ у мышей-гибридов CC57xF1, иммунизированных ЭБ (М ± m, n = 6)
Биомодель - линия CBA
Биомодель - линия C57Bl/6
Показатель
Контроль
2,5 мкг/кг
5,0 мкг/кг
Контроль
2,5 мкг/кг
5,0 мкг/кг
6
Число AOK на 10
668,1 ± 62,7*
748,3 ± 36,2*
362,6 ± 23,6***
299,8 ± 21,4
270,6 ± 26,0
284,1 ± 26,5
спленоцитов
(123)
(150)
(34)
Число AOK на
65,1 ± 15,5*
69,7±6,8**
25,2 ± 2,5
31,2 ± 2,6**
29,8 ± 3,5
20,9 ± 2,1
селезенку ×103
(118)
(134)
(20)
(49)
Относительный
коэффициент се4,6 ± 0,4
4,3 ± 0,2
4,2 ± 0,3
4,2 ± 0,3
4,0 ± 0,4
4,4 ± 0,4
лезенки
Титр гемагглюти3,67 ± 0,33
5,00 ± 0,37**
4,67 ± 0,23***
3,33 ± 0,33
3,80 ± 0,37
3,80 ± 0,45
нинов
(10)
(50)
(23)
Реакция ГЗТ
46,7±2,1*
31,2 ± 1,5
38,4 ± 1,7*** (23)
(50)
Примечание: здесь и в табл. 2, 3 в скобках - эффект в % к иммунизированному контролю; * p < 0,001, ** p < 0,01, *** p < 0,05 по
сравнению с контролем.
Таблица 2
Влияние соединения (I) на жизнеспособность и подвижность перитонеальных макрофагов мышей ICR
в опытах ex vivo in vitro (M ± m, n = 7)
Влияние соединения, введенного однократно внутрь, мкг/кг
Показатель фагоцитарной активности
Контроль
2,5
5,0
Жизнеспособность ПМБ, %
91,0 ± 2,5
93,0 ± 1,8
94,0 ± 1,6
Спонтанная двигательная активность, ко22,9 ± 1,5*
25,6 ± 1,4*
12,2 ± 0,96
личество клеток
(88)
(110)
Направленная миграция (хемотаксис), ко48,8 ± 2,7*
26,2 ± 1,5
24,4 ± 1,9
личество клеток
(86)
* р < 0,001 по сравнению с контролем.
Таблица 3
BY 14662 C1 2011.08.30
6
Иммунотерапевтическая эффективность соединения (I) в дозе 5 мкг/кг в/ж однократно в условиях
индуцированных иммунодефицитов у мышей-самок линии CBA (M ± m, n = 7)
Циклофосфамид, 10 мг/кг × 3
Облучение γ-квантами, 30 сГр однократно
Показатель
Контроль
Соединение (I)
Контроль
Соединение (I)
890,0 ± 41,0
587,5 ± 51,0
Число АОК на 106
880,0 ± 40,0*
503,6 ± 37,0*
480,0 ± 16,4*
186,0 ± 19,0*
спленоцитов
(85)
(170)*
(46)
(68)
Число АОК на селе92,0 ± 3,8
94,6 ± 9,8
92,2 ± 10,0*
54,3 ± 6,8*
зенку × 103
50,0 ± 3,0**
18,7 ± 3,3*
(85)
(180)
(46)
(80)
4,7 ± 0,3
4,6 ± 0,2
Относительный коэф4,6 ± 0,3
3,5 ± 0,3***
4,0 ± 0,3***
2,3 ± 0,2**
фициент селезенки
(12)
(82)
(15)
(50)
3,60 ± 0,24
5,60 ± 0,24
3,65 ± 0,20**
2,60 ± 0,20
Титр гемагглютининов
2,50 ± 0,22**
2,16 ± 0,30*
(47)
(20)
(31)
(60)
* p < 0,001, ** p < 0,01, *** p < 0,05 по сравнению с контролем: первая строка - нормометрический контроль, вторая иммунодефицитный.
BY 14662 C1 2011.08.30
Источники информации:
1. Патент РБ 10155, МПК6 C 07D 307/00, A 61P 37/00, 2007.
2. Методические указания по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ: Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых
фармакологических веществ. - M., 2000. - С. 257-263.
3. Deichmann В.W., Le Blanc TJ. // Industr. Hyg. Toxicol. - 1943. - V. 25, N 9.- P. 415.
4. Hodge H., Sterner J. Clinical Toxicology of Commercial Products. Acute Poisoning / Ed.
IV. - Baltimore, 1975. - 427 p.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
114 Кб
Теги
by14662, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа