close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14736

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 14736
(13) C1
(19)
(46) 2011.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
C 12N 15/70 (2006.01)
C 12N 15/78 (2006.01)
(54) ЧЕЛНОЧНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ
В БАКТЕРИЯХ РОДА PSEUDOMONAS ИЛИ ESCHERICHIA COLI И
СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ
BY 14736 C1 2011.08.30
(21) Номер заявки: a 20090639
(22) 2007.12.10
(62) a 20071525, 2007.12.10
(43) 2009.10.30
(71) Заявитель: Белорусский государственный университет (BY)
(72) Авторы: Василенко Светлана Леонидовна; Хамза Фади Джауд; Титок
Марина Алексеевна (BY)
(73) Патентообладатель: Белорусский государственный университет (BY)
(56) PRIDMORE R.D. Gene. - 1987. - V. 56. No. 2-3. - P. 309-312.
BY 7537 C1, 2005.
OLEKHNOVICH I.N. et al. Gene. - 1994. V. 140. - No. 1. - P. 63-65.
NAKANO Y. et al. Gene. - 1996. - V.
169. - No. 1. - P. 139-140.
ITOH N. et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2003. - V.61. - No. 3. - P. 240-246.
(57)
1. Челночный вектор pKMmob размером 4822 п.н. для молекулярного клонирования в
бактериях рода Pseudomonas или Escherichia coli, содержащий rep-ген и oriV-сайт плазмиды pBS267 группы несовместимости Р-9, ColE1-репликон плазмиды pMB1ori, маркер канамицинрезистентности, полилинкер с единичными сайтами для клонирования EcoR I,
Apo I, Kpn I, Acc65 I, Xba I, Sal I, Hinc II, Acc I, BspM I, Sph I, Hind III, расположенный в
lacZα-гене, позволяющий осуществлять встраивание чужеродного фрагмента ДНК размером около 8000 п.н., вызывая инактивацию lacZα-гена, и mob-сайт, обеспечивающий перенос вектора путем конъюгации.
2. Способ конструирования челночного вектора по п. 1, заключающийся в том, что
ДНК плазмиды pK18mob гидролизуют рестриктазой VspI, обрабатывают фрагментом
Кленова и соединяют ДНК-лигазой с амплифицированной в полимеразной цепной реакции последовательностью rep-области плазмиды pBS267 размером 1088 п.н., обработанной фрагментом Кленова.
Фиг. 1
BY 14736 C1 2011.08.30
Предлагаемое техническое решение относится к химии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в биотехнологии для клонирования чужеродных молекул
ДНК в системе грамотрицательных бактерий рода Pseudomonas - E. coli.
Для молекулярного клонирования в бактериях рода Pseudomonas создано два типа
челночных векторов. Все они способны поддерживаться в бактериях E. coli (за счет repобластей плазмид pBR322, pUC19, p15, pMZ7 или pMK16) и отличаются типом репликона, обеспечивающего наследование в клетках Pseudomonas [1-10].
Первый тип векторов создан на основе плазмиды RSF1010 группы несовместимости
Р-4 [1-7]. Несмотря на присутствие репликона широкого круга хозяев, некоторые из них
не способны передаваться и наследоваться в клетках бактерий Pseudomonas [4-6]. Кроме
того, все они характеризуются большими размерами (от 11,6 до 16,9 т.п.н.), что осложняет
работу с ними при постановке экспериментов in vitro, особенно со встроенными фрагментами чужеродной ДНК значительного размера. Для введения данного типа векторов в
клетки бактерий Pseudomonas в основном применялся метод конъюгации с использованием мобилизующей плазмиды группы несовместимости IncP-1, которая передается совместно с векторными молекулами в клетки реципиентов и затрудняет дальнейший анализ
трансконъюгантного потомства. Недостатком всех векторов данного типа является принцип отбора вставок чужеродных фрагментов ДНК, основанный на инактивации маркеров
антибиотикорезистентности. Многие сайты, пригодные для клонирования, не могут быть использованы, поскольку не обеспечивают получение конструкций с искомым фенотипом.
Второй тип челночных векторов создан на основе репликонов узкого круга хозяев [810]. Основным недостатком этих векторных систем является способность их наследоваться только в одном виде псевдомонад. Например, вектор pJH1 размером 4,87 т.п.н., содержащий rep-область плазмиды pRO1614, имеет удобную систему отбора вставок
(инактивация lacZ-гена), но способен наследоваться только в бактериях P. putida, в клетки
которых может вводиться путем трансформации или электропорации (не содержит mobсайта) [9].
Задачей изобретения является создание челночного вектора для молекулярного клонирования в бактериях рода Pseudomonas и E. coli, позволяющего клонировать в указанных организмах фрагменты чужеродной ДНК, размером более 8 т.п.н., и содержащего
систему, позволяющую вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в
клетках E. coli.
Технический результат состоит в конструировании челночного вектора, содержащего
ColE1-репликон, обеспечивающий наследование в бактериях E. coli, и rep-областъ плазмиды широкого круга хозяев pBS267 группы несовместимости Р-9, обеспечивающей поддержание в клетках бактерий рода Pseudomоnas.
Поставленная задача решается тем, что с помощью генно-инженерных манипуляций
конструируют вектор для молекулярного клонирования, способный эффективно вводиться и стабильно поддерживаться в бактериях рода Pseudomonas и E. coli.
Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем,
что в функционально незначимую область вектора pK18mob (размером 3793 п.н.), содержащего ColE1-репликон, маркер канамицинрезистентности, а также полилинкер с единичными сайтами для клонирования, была осуществлена вставка rep-области плазмиды
pBS267 группы несовместимости Р-9, обеспечивающая поддержание векторных молекул в
широком круге бактерий рода Pseudomonas. Сущность изобретения поясняется на фиг. 1.
На фиг. 1 представлена схема молекулярно-генетической организации предлагаемого
вектора для молекулярного клонирования pKMmob.
Предлагаемый вектор pKMmob (4822 п.н.) содержит репликон плазмиды широкого
круга хозяев pBS267 (rep-ген и oriV-сайт) группы несовместимости Р-9, позволяющий им
поддерживаться в бактериях Pseudomonas (P. putida, P. mendocina, P. aeruginosa, P. stutzeri,
P. chlororaphis, P. marginata, P. aureofaciens, P. pseudoalcaligenes, P. caryophylli, P. fluo2
BY 14736 C1 2011.08.30
rescens, P. palleroni, P. aurantiaca), ColE1-репликон (pMB1ori), обеспечивающий наследование в бактериях E. coli, маркер канамицинрезистентности (KmR), полилинкер (MCS) с
единичными сайтами для клонирования: EcoR I, Apo I, Kpn I, Acc651, Xba I, Sal I, Hinc II,
Acc I, BspM I, Sph I, Hind III, расположенный непосредственно в lacZα-гене, что позволяет
осуществлять встраивание чужеродных фрагментов ДНК, вызывая инактивацию lacZαгена, легко диагностируемое в клетках E. coli по образованию неокрашенных колоний на
селективной среде, содержащей IPTG и X-Gal, и могут эффективно вводиться в клетки
бактерий E. coli и Pseudomonas путем трансформации, электропорации или конъюгации с
использованием мобилизующего штамма E. coli BW19851, содержащего tra-гены плазмиды широкого круга хозяев RP4 в составе бактериальной хромосомы.
Пример 1.
В качестве базовой конструкции, обеспечивающей наследование вектора в системе E.
coli, используют многокопийную плазмиду pK18mob (размером 3793 п.н.) [12], содержащую ColE1-репликон, маркер канамицинрезистентности (KmR), полилинкер (MCS) с единичными сайтами для клонирования: EcoR I, Apo I, Kpn I, Acc65 I, Xba I, Sal I, Hinc II, Acc
I, BspM I, Sph I, Hind III, расположенный непосредственно в lacZα-гене, что позволяет
осуществлять встраивание чужеродных фрагментов ДНК, вызывая инактивацию lacZαгена, легко диагностируемое в клетках E. coli по образованию неокрашенных колоний на
селективной среде, содержащей IPTG и X-GaI, и могут эффективно вводиться в клетки
бактерий E. coli и Pseudomonas путем трансформации (электропорации) или конъюгации с
использованием мобилизующего штамма E. coli BW19851, содержащего tra-гены плазмиды широкого круга хозяев RP4 в составе бактериальной хромосомы.
В качестве rep-области, обеспечивающей наследование вектора pKMmob в бактериях
Pseudomonas, используют фрагмент плазмиды pBS267 [13] размером 1088 п.н., содержащий rep-ген и oriV-сайт инициации вегетативной репликации.
В полимеразной цепной реакции с использованием набора «Takara» (Япония) амплифицируют rep-область плазмиды pBS267 размером 1088 п.н. с помощью праймеров, содержащих на 5'-концах сайты узнавания для SalI рестриктазы, fRep-ori-SalI (5'-ACG CGT
CGA CAA CGT GAT GCG TAA TCG TG-3') и rRep-ori-SalI: (5'-ACG CGT CGA CCC TCA
GTT ACC GTG GG-3') при режиме амплификации: 94 °С - 5 мин (1 цикл); 94 °С - 30 с,
50 °С - 30 с, 68 °С - 1,5 мин (30 циклов); 68 °С - 10 мин (1 цикл). Продукт амплификации
встраивают в вектор, предназначенный для клонирования продуктов амплификации
pGEM-T Easy. Встроенную последовательность ДНК вырезают из вектора pGEM-T Easy с
помощью рестриктазы SalI с последующей обработкой фрагментом Кленова и лигируют с
вектором pK18mob, предварительно обработанным сначала рестриктазой VspI, а затем
фрагментом Кленова. Рестриктаза VspI узнает два сайта в векторе pK18mob в функционально незначимой области, обеспечивая образование делеции размером 59 п.н. Лигированной смесью трансформируют бактерии P. putida КТ2442, осуществляя отбор
плазмидсодержащих бактерий на среде с канамицином. Из отобранных клонов выделяют
плазмидную ДНК [14], которой трансформируют бактерии E. coli BW19851 [15], содержащие tra-гены плазмиды широкого круга хозяев RP4 в составе бактериальной хромосомы, из которых также выделяют плазмидную ДНК и на основании рестрикционного
анализа отбирают искомую векторную конструкцию. Отобранную таким образом конструкцию называют вектор pKMmob.
Размер вектора pKMmob составляет 4822 п.н. В состав вектора pKMmob входит:
ColE1-репликон, rep-область плазмиды pBS267, полилинкер размером 56 п.н., несущий
11 единичных сайтов для молекулярного клонирования, расположенный в lacZα-гене, что
позволяет вести селекцию вставки на среде, содержащей IPTG и X-Gal, маркер устойчивости к канамицину, выражающийся в бактериях рода Pseudomonas и E. coli, и mob-сайт,
позволяющий осуществлять конъюгационный перенос вектора с использованием мобилизующего штамма E. coli BW19851, содержащего tra-гены плазмиды RP4 в составе бакте3
BY 14736 C1 2011.08.30
риальной хромосомы. Полученный вектор пригоден для молекулярного клонирования в
клетках E. coli и в бактериях рода Pseudomonas. Емкость вектора более 8,0 т.п.н. Спектр
хозяев: E. coli и бактерии рода Pseudomonas (P. putida, P. mendocina, P. aeruginosa, P. stutzeri, P. chlororaphis, P. marginata, P. aureofaciens, P. pseudoalcaligenes, P. caryophylli, P. fluorescens, P. palleroni, P. aurantiaca).
Пример 2.
При введении вектора pKMmob в клетки E. coli путем трансформации частота возникновения трансформантов составляла 106 клеток на 1 мкг ДНК, а в бактерии рода Pseudomonas (использовали метод электропорации [16]) - от 103 до 107 клеток на 1 мкг ДНК. При
введении вектора pKMmob в клетки бактерий рода Pseudomonas методом конъюгации частота переноса составила: 7,7×10-2 для P. putida KT2442, 9,2×10-2 для P. putida M2, 4,9×10-4
для P. mendocina РМ46, 5,7×10-6 для P. aeruginosa ML4600, 1,1×10-4 для P. mendocina В972,
1,4×10-2 для P. stutzeri B975, 2,6×10-2 для P. chlororaphis B1246, 5,4×10-5 для
P. chlororaphis B1391, 1,4×10-2 для P. marginata TB, 1,4×10-1 для P. aureofaciens, 3,7×10-1 для
P. pseudoalcaligenes B1295, 1,8×10-1 для P. caryophylli В1296, 2,1×10-1 для P. fluorescens
В894, 1,5×10-2 для P. palleroni B1328, 1,6×10-2для P. auranitaca B14.
Пример 3.
Изучение стабильности наследования вектора pKMmob в неселективных условиях в
клетках бактерий рода Pseudomonas свидетельствует о том, что после 20 генераций в бактериальной популяции с концентрацией 109 клеток в миллилитре число плазмидсодержащих бактерий составляло для P. putida КТ2442 - 3,4×108 кл/мл, для P. putida M2 2,5×108 кл/мл, для P. mendocina РМ46 - 3,4×106 кл/мл, для P. mendocina B972 - 3,1×106
кл/мл, для P. aeruginosa ML4600 - 5,2×106 кл/мл, для P. stutzeri B975 - 3,2×105 кл/мл, для
P. chlororaphis В1246 - 4,5×107 кл/мл, для P. chlororaphis B1391 - 5,6×108 кл/мл, для P. marginata ТВ - 8,3×106 кл/мл, для P. aureofaciens - 5,2×106 кл/мл, для P. pseudoalcaligenes
В1295 - 4,3×106 кл/мл, для P. caryophylli В1296 - 2,0×106 кл/мл, для P. fluorescens B894 2,0×106 кл/мл, для P. Palleroni B1328 - 7,4×106 кл/мл, для P. aurantiaca B14 - 3,5×108 кл/мл.
Пример 4.
Клонирование фрагмента хромосомной ДНК бактерий E. coli XL-1 Blue в клетках
E. coli и бактериях рода Pseudomonas. Хромосомную ДНК бактерий штамма E. coli XL-1
Blue, обработанную рестриктазой KpnI, лигировали с вектором pKMmob, предварительно
линеаризированным по сайту KpnI. Лигированной смесью трансформировали клетки
E. coli XL-1 Blue. Селекцию вели на среде, содержащей X-Gal, IPTG, канамицин в конечной концентрации 25 мкг/мл. Полученные конструкции со вставками размером 3,8 т.п.н. и
8,3 т.п.н. сохраняли структурную стабильность при наследовании в клетках E. coli и бактериях рода Pseudomonas (проверено в штаммах P. putida КТ2442, P. mendocina РМ46,
P. aeruginosa ML4600, P. chlororaphis B1391, P. marginata TB, P. aureofaciens В1393). При
этом частота мобилизации векторной конструкции, несущей вставки разного размера, соответствовала частоте мобилизации исходного вектора pKMmob.
Пример 5.
Изменение стабильности наследования вектора pKMmob. Обработка 0,8 M раствором
гидроксиламина плазмидной ДНК вектора pKMmob в течение 30 мин позволила отобрать
варианты вектора, стабильность наследования которых составила 98-100 % (проверено в
бактериях P. marginata ТВ, P. putida КТ2442, P. mendocina РМ46, P. pseudoalcaligenes
В1295, P. chlororaphis B1391).
Таким образом, получен челночный вектор для молекулярного клонирования фрагментов чужеродной ДНК размером более 8 т.п.н в бактериях рода Pseudomonas и E. coli,
позволяющий вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в клетках E.
coli. Введение векторной конструкции pKMmob может осуществляться методом трансформации (электропорации) и конъюгации.
4
BY 14736 C1 2011.08.30
Источники информации:
1. BARTH Р.Т. et al. Plenum Publ. Co. - 1981. - P. 439-448.
2. BAGDASARIAN M. et al. Gene. - 1981. - V. 16. - No. 1-3. - P. 237-247.
3. GAUTIER F. et al. MoI. Gen. Genet. - 1980. - V. 178. - No. 2. - P. 375-380.
4. WOOD D.O. et al. J. Bacteriol. - 1981. - V. 145. - No. 3. - P. 1448-1451.
5. BAGDASARIAN M. Elsevier/North Holland, Amsterdam, 1979. - P. 411- 422.
6. TSYGANKOV Yu.D. et al. Plasmid. - 1985. - V. 14. - No. 2. - P. 118-125.
7. ЦЫГАНКОВ Ю.Д. и др. Генетика. - 1986. - № 11. - С. 2606-2619.
8. BOVIN R. et al. Curr. Microbiol. - 1994. - V. 28. - No. 1. - P. 41-47.
9. LEE B.U. et al. J. Microbiol. - 2006. - V. 44. - No. 6. - P. 671-673.
10. OLEKHNOVICH LN. et al. Gene. - 1994. - V. 140. - No. 1. - P. 63-65.
11. PRIDMORE R.D. Gene. - 1987. - V. 56. - No. 2-3. - P. 309-312.
12. SCHFER A.et al. Gene. - 1994. - V. 145. - P. 69-73.
13. ЕСИКОВА Т.З. и др. Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. - 1990. - № 4. - С. 25-28.
14. BIRNBOIM H.L. et al. Nucl. Acids. Res. - 1979. - V. 7. - No. 6. - P. 1513-23.
15. МАНИАТИС Т. и др. - М.: Мир, 1984. - 480 с.
16. DENNIS J.J. et al. Humana Press Inc. - 1995. - P. 125-132.
Сиквенс клонированного участка rep-области плазмиды pBS267
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
837 Кб
Теги
by14736, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа