close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14796

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.10.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 9/50
(2006.01)
СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ФИБРИНОГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ И
КАЗЕИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ
ПРОТЕИНАЗ ТОКСИГЕННОГО ШТАММА CORYNEBACTERIUM
DIPHTHERIAE PW-8
(21) Номер заявки: a 20090422
(22) 2009.03.20
(43) 2010.10.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии
и микробиологии" (BY)
(72) Авторы: Никандров Виталий Николаевич; Пыжова Нелли Семеновна
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное учреждение "Республиканский
научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии" (BY)
(56) НИКАНДРОВ В.Н. и др. Доклады
Национальной академии наук Беларуси. - 2007. - Т. 51. - № 3. - С. 92-97.
RU 2182598 C2, 2002.
US 6031087 A, 2000.
BY 14796 C1 2011.10.30
BY (11) 14796
(13) C1
(19)
ПЫЖОВА Н.С. и др. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы международной конференции. Минск, 2004. - С.100-102.
НИКАНДРОВ В.Н. и др. Проблемы
инфекционной патологии XXI века.
Материалы юбилейной конференции,
посвященной 80-летию НИИЭМ. Минск, 2004. - С. 177-191.
Никандров В.Н. и др. Современные
проблемы инфекционной патологии
человека (вирусология, микробиология, иммунология, эпидемиология и
клиника). Материалы II научнопрактической конференции. - Минск,
2001. - С. 318-338.
(57)
Способ ингибирования фибриногенолитической и казеинолитической активности внутриклеточных протеиназ в разрушенных путем замораживания-оттаивания или обработкой
ультразвуком клетках токсикогенного штамма Corynebacterium diphtheriae PW-8, отличающийся тем, что к разрушенным клеткам добавляют гидрохинон до концентрации
10-3-10-2 М.
Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии, в частности к ингибированию активности внутриклеточных протеиназ токсигенного штамма коринебактерии дифтерии.
Для целей медицинской биотехнологии и разработки рациональной химиотерапии дифтерии громадное значение имеет раскрытие путей направленной регуляции токсиногенеза.
Из источников научной литературы известно, что в оптимальных для токсиногенеза условиях производственный высокотоксигенный штамм PW-8 Corynebacterium diphtheriae
проявляет активность внутриклеточных протеиназ, свойства которых, судя по ингибиторному анализу, резко отличаются от протеиназ, образующихся в нетоксигенных штаммах
этого микроорганизма либо в неоптимальных для токсиногенеза условиях [1, 2].
BY 14796 C1 2011.10.30
Это создает возможности для использования данной особенности организации внутриклеточного метаболизма токсигенных штаммов для направленной регуляции токсиногенеза в целях биотехнологии и перспективы разработки химиотерапевтических средств
нового поколения при дифтерийной инфекции.
Известен способ ингибирования активности внутриклеточных протеиназ токсигенного
штамма коринебактерии дифтерии путем добавления к взвеси разрушенных (многократным замораживанием-оттаиванием либо ультразвуковой дезинтеграцией) клеток бульонной культуры коринебактерии дифтерии штамм PW-8 раствора нитротетразолиевого
синего в концентрации 10-3 М с последующим определением протеолитической активности по лизису фибриногена (или казеина) в тонком слое агарового геля [2]. При этом достигается полное (100 %) ингибирование активности внутриклеточных протеиназ
токсигенного штамма.
Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому.
Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является ингибирование протеолитической активности разрушенных клеток бульонной культуры коринебактерии
дифтерии при добавлении к взвеси этих клеток химического соединения.
Однако применяемый для ингибирования протеолитической активности внутриклеточных протеиназ токсигенного штамма нитротетразолиевый синий в равной степени ингибирует и активность внутриклеточных протеиназ нетоксигенных штаммов
коринебактерии дифтерии, например штамма 4895. Т.е. ингибиторное действие нитротетразолиевого синего по отношению к токсигенному штамму неизбирательно.
Задачей заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего ингибировать протеолитическую активность внутриклеточных протеиназ избирательно токсигенного штамма Corynebacterium diphtheriae.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования фибриногенолитической и казеинолитической активности внутриклеточных протеиназ в разрушенных путем замораживания-оттаивания или обработкой ультразвуком клетках
токсигенного штамма Corynebacterium diphtheriae PW-8, при этом к разрушенным клеткам
добавляют гидрохинон в концентрации 10-3-10-2 М.
Использование гидрохинона позволяет избирательно ингибировать активность внутриклеточных протеиназ только токсигенного штамма коринебактерии дифтерии.
Изобретение иллюстрируется примерами.
Пример 1.
Используют 4 образца (№ 1, 2, 3, 4) взвеси разрушенных (многократным замораживанием-оттаиванием либо ультразвуковой дезинтеграцией) клеток коринебактерии дифтерии: 2 образца - № 1 и № 2 токсигенного штамма PW-8 и 2 образца - № 3 и № 4
нетоксигенного штамма 4895, выращенных на бульоне Лингуда без сыворотки крови, как
подробно описано в [2].
К образцам № 1 и № 3 добавляют раствор гидрохинона в конечной концентрации
-2
10 М, а к образцам № 2 и № 4 - равный объем изотонического раствора хлорида натрия,
образцы перемешивают.
Аликвоты всех 4-х образцов наносят на фибриноген-агаровые пластины (концентрация
фибриногена составляла 10 г/л, агар-агара - 10 г/л), приготовленные на 0,01 М фосфатном
буфере pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl.
Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 °С в течение 24 ч. Зоны лизиса
визуализируют обработкой фибриноген-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой.
Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса фибриногена [2].
Площадь зон (в мм2) расщепления фибриногена в образцах составила (n = 3): в № 1 - 0;
в № 2 - 162 ± 10; в № 3 - 117 ± 14; в № 4 - 156 ± 18.
Следовательно, протеолитическая активность внутриклеточных протеиназ высокотоксигенного штамма подавлялась на 100 %, тогда как нетоксигенного - лишь на 25 %.
2
BY 14796 C1 2011.10.30
Пример 2.
Используют 4 образца (№ 1, 2, 3, 4) взвеси разрушенных (многократным замораживанием-оттаиванием либо ультразвуковой дезинтеграцией) клеток коринебактерии дифтерии: 2 образца - № 1 и № 2 токсигенного штамма PW-8 и 2 образца - № 3 и № 4
нетоксигенного штамма 4895, выращенных на бульоне Лингуда без сыворотки крови, как
подробно описано в [2].
К образцам № 1 и № 3 добавляют раствор гидрохинона в конечной концентрации
10-3 М, а к образцам № 2 и № 4 - равный объем изотонического раствора хлорида натрия,
образцы перемешивают.
Аликвоты всех 4-х образцов наносят на казеин-агаровые пластины (концентрация казеина составляла 10 г/л, агар-агара - 10 г/л), приготовленные на 0,01 М фосфатном буфере
pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl.
Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 °С в течение 24 ч. Зоны лизиса
визуализируют обработкой казеин-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой.
Протеолитическую активность учитывали по площади зон лизиса казеина [2].
Площадь зон (в мм2) расщепления казеина в образцах составила (n = 3): в № 1 - 0; в № 2 90 ± 12; в № 3 - 90 ± 8; в № 4 - 105 ± 11.
Следовательно, протеолитическая активность внутриклеточных перотеиназ высокотоксигенного штамма подавлялась на 100 %, тогда как нетоксигенного - лишь на 14 %.
В неоптимальных для токсиногенеза условиях (добавление в бульон Лингуда сыворотки крови) ингибирования протеиназ токсигенного штамма гидрохиноном не проявляется.
В концентрации 10-4М гидрохинон не вызывает полного ингибирования протеиназ токсикогенного штамма.
Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ
позволяет избирательно подавлять активность внутриклеточных протеиназ токсигенного
штамма коринебактерий дифтерии, использовать доступный и более дешевый ингибитор.
Данный способ может найти применение для направленной регуляции токсиногенеза в
целях биотехнологии и перспективы разработки химиотерапевтических средств нового
поколения при дифтерийной инфекции.
Источники информации:
1. Пыжова Н.С., Никандров В.Н. Особенности расщепления белков внутриклеточными
протеиназами Corynebacterium diphtheriae в оптимальных и неоптимальных для токсиногенеза условиях. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии
клетки. Международная конференция. Тез. докл. - Минск, 2007. - С. 62-63.
2. Никандров В.Н., Пыжова Н.С., Шапчиц Н.С. Расщепление белков внутриклеточными
протеиназами Corynebacteium diphtheriae: влияние группоспецифических ингибиторов и
перехватчиков активных форм кислорода // Доклады НАН Беларуси. - 2007. - Т. 51. - № 3. С. 92-97.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
79 Кб
Теги
патент, by14796
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа