close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY14977

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.10.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/02
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТИМУЛИРУЮЩЕГО ИЛИ
ИНГИБИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ВОДНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО
ЭКСТРАКТА НА РОСТ ТЕСТ-ШТАММА МИКРООРГАНИЗМА ДРОЖЖЕВОГО ИЛИ ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА
(21) Номер заявки: a 20081448
(22) 2008.11.14
(43) 2010.06.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
(72) Авторы: Дудчик Наталья Владимировна; Филонов Валерий Петрович;
Колядич Елена Сергеевна; Мельникова Людмила Александровна; Лилишенцева Анна Николаевна; Иващенко Наталья Ивановна (BY)
BY 14977 C1 2011.10.30
BY (11) 14977
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр гигиены" (BY)
(56) MAU J-L. et al. J Agric Food Chem. 2001. - V.49. - No. 1. - P.183-188.
RU 2240556 С2, 2004.
Микробиология. Методические рекомендации к лабораторным занятиям,
контроль самостоятельной работы студентов. - Минск, 2002. - 97 с.
(57)
Способ определения стимулирующего или ингибирующего действия водного растительного экстракта на рост тест-штамма микроорганизма - дрожжевого или плесневого
гриба, заключающийся в том, что культивируют тест-штамм микроорганизма при температуре 20-28 °С в жидкой питательной среде, в которую внесен растительный экстракт, а
также в жидкой питательной среде, в которую внесен экстрагент - вода, каждые 4 часа измеряя оптическую плотность суспензий тест-штамма при длине волны λ = 540 нм до достижения ее максимального значения, соответствующего наступлению стационарной
фазы роста тест-штамма, после чего рассчитывают отношение М оптической плотности
суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в питательной среде с растительным
экстрактом к оптической плотности суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в
питательной среде с экстрагентом, и при М равном единице судят о том, что растительный экстракт не оказывает стимулирующего или ингибирующего действия на рост тестштамма, при М больше единицы оказывает стимулирующее, а при М меньше единицы
оказывает ингибирующее действие на рост тест-штамма, при этом в качестве питательной
среды используют среду с pH 4,0-5,4, содержащую, г/л:
глюкоза
10,0±1,0
сахароза
10,0±1,0
натрий азотнокислый
3,0±0,5
калий фосфорнокислый однозамещенный
1,0±0,5
магний сернокислый семиводный
0,7±0,2
калий хлористый
0,5±0,2
железо сернокислое
0,02±0,005
BY 14977 C1 2011.10.30
пептон ферментативный
вода
5,0±0,5
остальное.
Изобретение относится к разделу гигиены питания, санитарной микробиологии и
фармакологии.
Известен способ оценки антимикробной активности растительных экстрактов in vitro с
использованием тест-культур бактерий, заключающийся в том, что в центр поверхности
засеянного тест-штаммами микроорганизмов питательного агара располагают диски из
стерильной фильтровальной бумаги, предварительно импрегнированные растительным
экстрактом, растирают поверхность питательного агара стеклянным шпателем, а затем
чашки с посевами микроорганизмов инкубируют в термостате. После инкубации с помощью кронциркуля измеряют диаметр зоны просветления и выражают в мм диаметр зоны
ингибирования роста микроорганизмов.
Однако способ-прототип обладает низкой воспроизводимостью и чувствительностью,
в связи с чем требуется длительное, до 24 часов, время проведения испытаний и не дает
возможность оценить стимулирующее воздействие растительных экстрактов на микроорганизмы.
Общими признаками для заявляемого способа и прототипа является то, что осуществляют параллельное внесение растительных экстрактов в питательную среду, содержащую
ранее определенную концентрацию тест-культуры дрожжевых или плесневых грибов, и
проводят их совместное культивирование с последующей обработкой полученных данных.
Задачей заявленного изобретения является повышение воспроизводимости и чувствительности способа. Поставленная задача достигается следующим образом.
Предложен способ определения стимулирующего или ингибирующего действия водного растительного экстракта на рост тест-штамма микроорганизма - дрожжевого или
плесневого гриба, при этом культивируют тест-штамм микроорганизма при температуре
20-28 °С в жидкой питательной среде, в которую внесен растительный экстракт, а также в
жидкой питательной среде, в которую внесен экстрагент - вода, каждые 4 часа измеряя
оптическую плотность суспензий тест-штамма при длине волны λ= 540 нм до достижения
ее максимального значения, соответствующего наступлению стационарной фазы роста
тест-штамма, после чего рассчитывают отношение M оптической плотности суспензии в
стационарной фазе роста тест-штамма в питательной среде с растительным экстрактом к
оптической плотности суспензии в стационарной фазе роста тест-штамма в питательной
среде с экстрагентом, и при M равном единице судят о том, что растительный экстракт не
оказывает стимулирующего или ингибирующего действия на рост тест-штамма, при M
больше единицы - оказывает стимулирующее, а при M меньше единицы - оказывает ингибирующее действие на рост тест-штамма, при этом в качестве питательной среды используют среду с pH 4,0-5,4, содержащую, г/л:
глюкоза
10±1,0
сахароза
10±1,0;
натрий азотнокислый
3 ± 0,5;
калий фосфорнокислый однозамещенный
1 ± 0,5;
магний сернокислый семиводный
0,7±0,2;
калий хлористый
0,5±0,2;
железо сернокислое
0,02±0,005;
пептон ферментативный
5±0,5
вода
остальное.
2
BY 14977 C1 2011.10.30
Мы исходили из того, что рост микроорганизмов на питательной среде имеет, как
правило, несколько фаз: лаг-фазу, выраженную фазу быстрого роста культуры (логарифмическую фазу), фазу замедления роста, стационарную фазу и фазу отмирания. Стационарная фаза роста характеризуется максимальным накоплением биомассы культуры.
Поэтому для оценки модулирующей активности водных экстрактов растений целесообразно выбрать стационарную фазу роста, а накопление биомассы оценивать по оптическим показателям в жидкой питательной среде. Для этой цели был оптимизирован состав
среды культивирования. Питательный состав должен быть сбалансирован таким образом,
чтобы обеспечить нормальное развитие тест-микроорганизма, но при этом не должен маскировать как ингибирующее, так и стимулирующее действие растительных экстрактов.
Кроме того, среда должна быть прозрачна, бесцветна (или слегка окрашена). Согласно
нашим исследованиям, такими свойствами обычно обладают синтетические или полусинтетические питательные среды.
Такой прием позволяет повысить чувствительность и воспроизводимость способа за
счет того, что осуществляется регистрация оптической плотности суспензии микроорганизма в стационарной фазе развития роста тест-штамма в питательной среде предложенного состава, содержащей и не содержащей испытуемого экстракта.
Пример выполнения.
Требуется определить действие экстрактов пряноароматических и лекарственных растений.
В качестве бактериальных тест-штаммов используют Candida albicans ATCC 10231,
полученный из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов, и Aspergillus
melleus БИМ F-55, полученный из Национальной коллекции непатогенных микроорганизмов (научая коллекция типовых и промышленно-ценных микроорганизмов) Института
микробиологии НАН Беларуси.
Используемые штаммы были типичными по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам. Для приготовления рабочих культур производят отсев бактериальных тест-штаммов на косяки мясопептонного агара, содержащего 0,1 % глюкозы и
0,2 % дрожжевого экстракта, и инкубируют в термостате при (24±1) °С в течение 18-24 ч.
Смывы с косяков производят стерильным 0,85 %-ным физиологическим раствором. Концентрацию клеток доводят до 105 КОЕ/см3, используют оптический стандарт мутности на
10 ед.
Состав среды культивирования, г/л: глюкоза 10±1,0; сахароза 10±1,0; натрий азотнокислый - 3±0,5; калий фосфорнокислый однозамещенный - 1±0,5; магний сернокислый
семиводный - 0,7±0,2; калий хлористый - 0,5±0,2; железо сернокислое - 0,02±±0,005; пептон ферментативный - 5±0,5, pH 4,0 - 5,4.
В пробирки объемом 50 см3 с 10 см3 среды культивирования указанного состава вносят 3 объемных % суспензии микроорганизмов с начальной концентрацией 105 КОЕ/см3.
Для оценки действия экстрактов в пробирки с питательной средой добавляют 5 объемных % водных экстрактов. Контролем служит питательная среда с внесенной суспензией
микроорганизмов с равным объемом воды вместо экстракта. Культивируют при оптимальной для данных микроорганизмов температуре 20-28 °С до достижения стационарной
фазы роста. Во время проведения эксперимента проводят измерения оптической плотности культуры. Пробы отбирают в количестве 2 см3 в начале опыта и через каждые 4 часа,
соблюдая правила асептики. Рост микроорганизмов оценивают оптически по плотности
клеточной культуры. Измерения проводят не менее чем в трех повторностях для каждого
экстракта на спектрофотоколориметре при длине волны λ = 540 нм, длина оптического
пути составляет 1 см.
Получены следующие результаты (таблица).
3
BY 14977 C1 2011.10.30
Результаты оценки модулирующего действия растительных экстрактов
на тест-штаммы
Экстракт
D1
D2
M
Действие
Candida albicans ATCC 10231
Экстракт 1
0,85
0,27
0,32
Ингибирующее
Экстракт 2
0,85
0,85
1,0
Не обладает ингибирующим
или стимулирующим действием
Экстракт 3
0,85
0,90
1,1
Стимулирующее
Aspergillus melleus БИМ F-55
Экстракт 1
0,72
0,40
0,55
Ингибирующее
Экстракт 2
0,72
0,84
1,2
Стимулирующее
Экстракт 3
0,72
0,72
1,0
Не обладает ингибирующим
или стимулирующим действием
Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа заключается
в количественной оценке действия растительных экстрактов на тест-штаммы грибов, в
более простой пробоподготовке, т.к. отсутствует стадия импрегнирования растительным
экстрактом стерильного бумажного диска, а также в исключении влияния скорости диффузии экстракта в агар на результаты определения.
Источники информации:
1. Mau, J. Antimicrobial effect of extracts from Chienese chive, chinnamon, and corni fructus // J. agric. Food Chem. 2001. - Vol. 49. - Nо. 1. - P. 183-188 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
90 Кб
Теги
by14977, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа