close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15017

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.10.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 7/00
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЗОГЕННОСТИ
ЗАКВАСОЧНЫХ БАКТЕРИЙ
(21) Номер заявки: a 20090296
(22) 2009.03.03
(43) 2010.10.30
(71) Заявитель: Учреждение Белорусского государственного университета
"Научно-исследовательский институт физико-химических проблем"
(BY)
(72) Авторы: Скорб Екатерина Владимировна; Свиридов Дмитрий Вадимович; Райский Андрей Петрович;
Белясова Наталья Александровна
(BY)
(73) Патентообладатель: Учреждение Белорусского государственного университета "Научно-исследовательский институт физико-химических
проблем" (BY)
BY 15017 C1 2011.10.30
BY (11) 15017
(13) C1
(19)
(56) McKAY L.L. et al. Applied Microbiology. 1973. - V. 25. - No. 4. - P. 682-684.
SU 1291602 A1, 1987.
SU 721487, 1980.
SU 1458387 A1, 1989.
HUGGINS A.R. et al. Applied and Environmental Microbiology, 1977. - V. 33. No. 1. - P. 184-191.
МУК 4.2.1884-04. Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных
водных объектов, [http://www.gostrf.com/
Basesdoc/ 45/45900/index.htm].
СКОРБ Е.В. и др. Доклады Национальной академии наук Беларуси. - 2007. Т. 51. - № 3. - С. 62-66.
SU 940520 A, 1984.
SU 1578189 A1, 1990.
EP 115547 A1, 1984.
(57)
Способ определения лизогенности заквасочных бактерий, используемых для получения молочнокислых продуктов, включающий культивирование бактерий, облучение УФсветом бактериальной суспензии с последующим ее высевом, инкубирование посева в
присутствии чувствительной тест-культуры в течение суток и выявление негативных колоний, отличающийся тем, что облучение УФ-светом осуществляют в присутствии дисперсного диоксида титана - анатаза или смеси анатаза с рутилом, внесенного в количестве
6,7 мг/мл бактериальной суспензии с титром 107 КОЕ/мл, в течение 2 минут.
Изобретение относится к области микробиологии и технологии производства ферментированных молочных продуктов и может быть использовано для установления лизогенного состояния заквасочных бактерий (лизогенности).
Лизогенные заквасочные бактерии (т.е. содержащие в своих геномах ДНК умеренных
фагов) представляют серьезную угрозу для технологических процессов получения ферментированных молочных продуктов, поскольку при изменениях условий окружающей
среды и биологического статуса клетки (резкие колебания температуры, кислотности,
накопление продуктов метаболизма в культуральной жидкости, появление токсикантов,
голодание и др.) может происходить индуцирование профагов к литическому циклу (вы-
BY 15017 C1 2011.10.30
ходу зрелых вирусов из клетки), следствием чего является фаголизис - явление массовой
гибели заквасочных бактерий, сопровождающееся нарушением процесса ферментации
молока. Особенно опасно использование лизогенных бактерий в составе многокомпонентных заквасок, поскольку, если в составе таких заквасок окажутся лизогенные бактерии и нелизогенные, но чувствительные к фагу, обусловившему лизогению, произойдет
фаголизис [1-3].
В связи с этим необходимо проводить тщательную проверку заквасочных бактерий на
присутствие в их клетках профагов. Используемые в настоящее время методы, предполагающие воздействие на бактерии какими-либо агентами физической или химической природы (термообработка, ультрафиолетовое (УФ) облучение, воздействие химических
веществ [1-4]), дают неоднозначные результаты, в том числе вследствие широкого распространения вариантов бактерий, в клетках которых присутствуют дефектные профаги, а
также штаммов с устойчивым состоянием лизогении.
В качестве прототипа [3] выбран метод определения лизогенности бактерий, предполагающий использование УФ-излучения для того, чтобы добиться выхода зрелых бактериофагов из клеток, что позволило бы определить лизогенность бактерий по негативным
колониям фагов на газонах чувствительных культур. К недостаткам прототипа следует
отнести: 1) невозможность выявления лизогенных бактерий во всех случаях; 2) большая
длительность УФ-облучения (2 часа и более [3]), следствием чего является низкая производительность процесса определения.
Задача изобретения - разработка способа определения лизогенности заквасочных бактерий за счет фотокаталитической индукции профагов к литическому циклу для достижения высокой достоверности определения при одновременном повышении экспрессности
за счет снижения времени облучения.
Поставленная задача достигается тем, что в способе определения лизогенности заквасочных бактерий, используемых для получения молочно кислых продуктов, включающем
культивирование бактерий, облучение УФ-светом бактериальной суспензии с последующим ее высевом, инкубирование посевов в присутствии чувствительной тест-культуры в
течение суток и выявление негативных колоний, облучение проводят в присутствии дисперсного диоксида титана - анатаз или смесь анатаза с рутилом, внесенного в количестве
6,7 мг/мл бактериальной суспензии с титром 107 КОЕ/мл, в течение 2 минут.
Процедура индукции профагов к литическому циклу под действием УФ-облучения в
присутствии диоксид-титанового фотокатализатора включает следующие основные стадии:
1) получение суточных культур лизогенных бактерий общепринятыми методами [5];
2) разведение культур лизогенных бактерий стерильным физиологическим раствором и
добавление к полученной суспензии дисперсного диоксид-титанового фотокатализатора;
3) облучение перемешиваемой суспензии УФ-светом;
4) высев облученной культуры стандартным двухслойным методом [6] с последующим инкубированием посевов в течение суток;
5) подсчет числа негативных колоний и определение концентрации бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл суспензии с учетом разведения.
Пример 1.
Лизогенные молочнокислые бактерии Lactococcus lactis 411 (исходная концентрация
1,2 × 109 КОЕ/мл) культивировали сутки при 30 °С в жидкой пептонно-дрожжевой среде
M17, содержащей 0,5 % глюкозы, и непосредственно перед анализом разводили до титра
107 КОЕ/мл стерильным 0,15 M раствором NaCl. После добавления дисперсного ТiO2 в
количестве 20 мг на 3 мл суспензии последняя подвергалась УФ-облучению (линия 240 нм
ртутной лампы высокого давления интенсивностью 15 мВт⋅см-2) в течение 2 минут. Для
регистрации негативных колоний фагов проводили высев методом агаровых слоев: нижний
2
BY 15017 C1 2011.10.30
слой представлял собой агаризованную (1,0 %) среду M17, содержащую глюкозу (0,5 %),
CaCl2 (5 мМоль/л) и глицин (0,75 %); верхний слой отличался от нижнего меньшим содержанием агар-агара (0,4 %) и включал 0,1 мл облученной суспензии и 0,2 мл чувствительной
тест-культуры. Концентрация бляшкообразующих единиц, определенная после инкубирования посева в течение суток, составила 2,3 × 102 БОЕ/мл.
Пример 2.
Анализ на лизогенность молочнокислых бактерий L. lactis 411 проводился так же, как
в примере 1, но вместо чувствительного к используемому УФ-облучению диоксида титана
в клеточную суспензию вводили нефоточувствительный дисперсный SiO2 в той же концентрации. Присутствия бляшкообразующих единиц после УФ-облучения продолжительностью 2 минут не обнаружено.
Пример 3.
Анализ на лизогенность молочнокислых бактерий L. lactis 411 проводился так же, как
в примере 1, но вместо чувствительного к используемому УФ-облучению диоксида титана
в клеточную суспензию вводили нефоточувствительный дисперсный SiO2 в той же
концентрации. Концентрация бляшкообразующих единиц, определенная после УФ-облучения в течение 2 часов (т.е. в тех же условиях, что и в случае прототипа), составила
1,2 × 101 БОЕ/мл.
Пример 4.
Анализ на лизогенность молочнокислых бактерий L. lactis 415 (исходная концентрация 1,4 × 109 КОЕ/мл), проводился так же, как в примере 1. Концентрация бляшкообразующих единиц, определенная после УФ-облучения в течение 2 мин, составила
1,1 × 102 БОЕ/мл.
Пример 5.
Определение лизогенности молочнокислых бактерий L. lactis 415 проводилось так же,
как в примере 4, но вместо чувствительного к используемому УФ-облучению диоксида
титана в клеточную суспензию вводили нефоточувствительный дисперсный SiO2 в той же
концентрации. Присутствия бляшкообразующих единиц после УФ-облучения продолжительностью 2 минут не обнаружено.
Пример 6.
Определение лизогеннности молочнокислых бактерий L. lactis 415 проводилось так
же, как в примере 5. Присутствия бляшкообразующих единиц после УФ-облучения продолжительностью 2 часа (т.е. в тех же условиях, что и в случае прототипа) не обнаружено.
Важным достоинством заявляемого способа определения лизогенности заквасочных
бактерий является то, что он позволяет исключить возможность ошибочного невыявления
лизогенных бактерий (как в случае бактерий L. lactis 415, факт лизогенности которых, в
отличие от заявляемого метода, не может быть выявлен с помощью метода-прототипа) и
тем самым надежно предупредить негативные последствия использования штаммов лизогенных заквасочных бактерий в процессах ферментации при изготовлении кисломолочных продуктов. Существенно также, что время УФ-облучения при выполнении анализа на
лизогенность снижается в 60 раз по сравнению с прототипом.
Источники информации:
1. Martin M.C., Ladero V., Alvarez M.A. // J. Verbr. Lebensm. - 2006 - V. 1. - No. 2. - P. 121-124.
2. Chopin A., Bolotin A., Sorokin A., Ehrlich S., Chopin M. // Nucl. Acids Res. - 2001. V.29. - No. 3 - P. 644-651.
3
BY 15017 C1 2011.10.30
3. McKay L.L., Baldin K.A. // J. Appl. Microbiol. -1973. - V.25. - No. 4. - P. 682-684 (прототип).
4. Meister, K.A. Ledford R.A. // J. Food Protect. - 1979. - V. 42. - No. 5. - P. 396-400.
5. Методы общей бактериологии. В 3 т. / Под ред. Ф.Герхардта и др. - М.: Мир, 19831984.
6. Lillehaug, D. // J. Appl. Microbiol. - 1997. - V. 83. - No. 4 - P. 85-90.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
81 Кб
Теги
by15017, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа