close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15050

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.10.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 9/38
C 12N 1/20
C 12R 1/06
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ β-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ
(21) Номер заявки: a 20091062
(22) 2009.07.14
(43) 2011.02.28
(71) Заявитель: Государственное научное
учреждение "Институт микробиологии Национальной академии наук
Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Сапунова Леонида Ивановна; Тамкович Ирина Олеговна;
Лобанок Анатолий Георгиевич; Костеневич Александр Александрович
(BY)
(73) Патентообладатель: Государственное научное учреждение "Институт
микробиологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
BY 15050 C1 2011.10.30
BY (11) 15050
(13) C1
(19)
(56) САПУНОВА Л.И. и др. Современное
состояние и перспективы развития
микробиологии и биотехнологии. Материалы VI Международной научной
конференции. Т.1. - Минск. - 2008. С. 171-173.
SU 1082812 A, 1984.
RU 2141521 C1, 1999.
RU 2313572 C2, 2007.
SU 1509402 A1, 1989.
NAKAGAWA T. et al. Appl Microbiol
Biotechnol., 2006. - V. 72. - P. 720-725.
KARASOVA-LIPOVOVA P. et al. Enzyme and Microbial Technology. - 2003. V. 33. - No. 6. - P. 836-844.
(57)
Способ получения внеклеточной β-галактозидазы, включающий глубинное культивирование бактериального штамма-продуцента и последующее отделение культуральной
жидкости, содержащей β-галактозидазу, от бактериальной биомассы, отличающийся тем,
что в качестве бактериального штамма-продуцента используют штамм Arthrobacter sulfonivorans БИМ В-499-Д, выращенный на питательной среде, содержащей лактозу, а глубинное культивирование проводят при температуре 27-29 °С и исходном pH 6,5 на
питательной среде следующего состава, мас. %:
лактоза
1,25-1,75
пептон
0,75-1,00
дрожжевой экстракт
0,075-0,100
MgSO4·7H2O
0,25-0,30
K2HPO4
0,25-0,30
вода
остальное.
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, предназначено для получения фермента, применяемого в пищевой промышленности для производства безлактозных диетических продуктов питания из цельного молока или отходов его переработки,
глюкозо-галактозного сиропа, в фармацевтической промышленности - в качестве ферментативно активной субстанции для производства лекарственных средств, корректирующих
лактазную недостаточность, в сельском хозяйстве - для производства кормов и кормовых
BY 15050 C1 2011.10.30
добавок и касается способа получения β-галактозидазы уникальной для прокариот внеклеточной локализации.
Известно, что синтез β-галактозидазы является широко распространенным свойством
про- и эукариотических микроорганизмов различной таксономической принадлежности.
Причем ферменты эукариот являются, как правило, внеклеточными, а прокариот - внутриклеточными или ассоциированными с поверхностью клеток. Кроме того, первые предпочтительно гидролизуют специфический субстрат в условиях высокой (pH 2,5-5,0), а
вторые - низкой (pH 6,0-8,0) кислотности среды.
В литературе указывается на способность отдельных представителей прокариот продуцировать секретируемые формы β-галактозидазы [1-4]. Основными недостатками
штаммов-продуцентов являются либо невысокие уровни синтеза β-галактозидаз, либо их
низкая удельная активность, либо очевидная клеточносвязанная, а не, как указывается,
внеклеточная локализация синтезируемых ферментных белков, либо все перечисленное
одновременно. Это усложняет процесс выделения и очистки фермента, делая процесс
длительным, материало- и энергозатратным.
Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ получения β-галактозидазы с использованием бактерий Bacillus sp. MTCC 3088 [5, 6].
Максимальная величина ферментативной активности, варьирующая в пределах 519 ед/мл, выявляется в бесклеточном фильтрате 12-суточной культуры, когда рост штамма-продуцента полностью завершен и происходит лизис клеток. Максимальная удельная
активность β-галактозидазы к этому времени составляет 1,23 ед/мг белка.
К недостаткам указанного способа следует отнести:
наличие в питательной среде для глубинного культивирования продуцента большого
количества (2,05 %) органических источников азота, что удорожает процесс получения
фермента и усложняет его очистку;
использование большого количества посевного материала (5 об. %), высокий температурный режим культивирования (37 °C) и необходимость существенного (6-кратного, с 2
до 12 сут.) продления сроков культивирования бактерий после завершения их роста с целью секреции β-галактозидазы в культуральную жидкость, что делает процесс энергоемким и экономически малопривлекательным;
низкую удельную активность β-галактозидазы в фильтрате культуральной жидкости
бактерий (1,23 ед/мг белка), что свидетельствует о высокой концентрации балластных
белков и обусловливает сложность дальнейшей очистки ферментного белка;
использование в качестве штамма-продуцента β-галактозидазы спорообразующих
бактерий рода Bacillus, что в условиях выпуска современными микробиологическими
производствами широкого спектра продукции требует соблюдения особенно тщательного
режима стерилизации технологического оборудования и помещений.
Задачей изобретения является разработка способа получения внеклеточной β-галактозидазы бактериального происхождения, характеризующейся высокой общей и удельной
активностью, а также упрощение и удешевление процесса.
Поставленная задача реализуется путем приготовления на содержащих лактозу средах
физиологически активного посевного материала штамма неспорообразующих бактерий
Arthrobacter sulfonivorans ЛФ-ГАЛ - продуцента β-галактозидазы, его глубинного выращивания в ферментационной емкости с питательной средой, содержащей источники углеродного, азотного и минерального питания, с перемешиванием при pH 6,5 и температуре
27-29 °C в течение не более 3 сут.
Штамм-продуцент β-галактозидазы Arthrobacter sulfonivorans ЛФ-ГАЛ хранится в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ "Институт микробиологии
HAH Беларуси" под номером БИМ В-499-Д.
Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами.
2
BY 15050 C1 2011.10.30
Пример 1.
Бактерии Arthrobacter sulfonivorans ЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) культивируют в колбах
Эрленмейера объемом 250 мл с 50 мл питательной среды на качалке (150-180 об/мин) при
температуре 27-29 °C в течение 4 сут. (в прототипе - 37 °C, 12 сут.).
Питательная среда содержит (в %): лактозу - 3,0; пептон - 1,0; дрожжевой экстракт 0,5; K2HP4 - 0,3; MgSO4·7H2O - 0,2; исходный pH - 6,5.
В качестве посевного материала используют 2 об. % суспензии бактериальной культуры (5 об. % в прототипе), полученной на пептонно-дрожжевом агаре (в %: пептон - 1,0;
дрожжевой экстракт - 0,5; глюкоза - 0,5; NaCl - 0,5; агар-агар - 1,5) при pH 7,2-7,4 и температуре 24-26 °C в течение 3 сут.
По окончании процесса культивирования клетки бактерий отделяют центрифугированием (5000-6000 об/мин, 15 мин), и в бесклеточном фильтрате культуральной жидкости
определяют количество белка и активность β-галактозидазы.
За единицу β-галактозидазной активности принимают количество фермента, гидролизующего при 40 °C и pH 7,0 за 1 мин 1 мкмоль о-нитрофенил-β-D-галактопиранозида с
образованием 1 мкмоля 4-нитрофенола. Активность β-галактозидазы выражают в ед/мл
фильтрата культуральной жидкости (ед/мл) или в ед/мг белка (удельная активность).
Активность β-галактозидазы бесклеточного фильтрата культуральной жидкости бактерий составляет 24,7 ед/мл или 138,0 ед/мг белка.
Пример 2.
Штамм ЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) бактерий Arthrobacter sulfonivorans выращивают в
описанных в примере 1 условиях на питательной среде следующего состава (в %): лактоза 1,0; пептон - 0,75; дрожжевой экстракт - 0,2; MgSO4·7H2O - 0,20; K2HPO4 - 0,3, за исключением того, что в качестве посевного материала используют 2 об. % суспензии клеток
бактерий, полученных на жидкой среде указанного выше состава при 27-29 °C в течение
18-24 ч.
Активность внеклеточной β-галактозидазы по окончании культивирования штаммапродуцента составляет 32,4 ед/мл или 143,6 ед/мг белка.
Пример 3.
Бактерии Arthrobacter sulfonivorans ЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) выращивают в колбах
Эрленмейера объемом 750 мл со 150 мл питательной среды следующего состава (в %):
лактоза - 1,5; пептон - 1,0; дрожжевой экстракт - 0,1; MgSO4⋅7H2O - 0,25; K2HPO4 - 0,3,
при исходном pH 6,5 на качалке со скоростью вращения платформы 250 об/мин при температуре 27-29 °C в течение 2 сут. В качестве посевного материала используют 2 об. %
суспензии клеток бактерий, выращенных в жидкой среде вышеуказанного состава при 2729 °C в течение 3 сут.
По окончании культивирования штамма-продуцента активность внеклеточной β-галактозидазы составляет 41,8 ед/мл или 148,5 ед/мг белка.
Пример 4.
Для выращивания бактерий Arthrobacter sulfonivorans ЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) используют среду, содержащую (в %): лактозу - 1,25; пептон - 0,75; дрожжевой экстракт 0,075; MgSO4-7H2O - 0,3; K2HPO4 - 0,25. Условия получения посевного материала и физико-химические условия культивирования аналогичны указанным в примере 3.
β-Галактозидазная активность в фильтрате культуральной жидкости достигает максимума ко вторым суткам роста бактерий и составляет 38,3 ед/мл или 146,1 ед/мг белка.
Пример 5.
Бактерии Arthrobacter sulfonivorans ЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д) выращивают на качалке
(250-280 об/мин) в колбах Эрленмейера объемом 2000 мл, содержащих 300 мл питательной среды приведенного в примере 3 состава с исходным значением pH 6,5, при температуре 27-29 °C в течение 2 сут. В качестве посевного материала используют 2 об. %
3
BY 15050 C1 2011.10.30
суспензии клеток бактерий, полученных в жидкой среде с 0,1 % лактозы при 24-26 °C в
течение 18 ч.
По окончании культивирования штамма-продуцента активность внеклеточной β-галактозидазы составляет 43,6 ед/мл фильтрата культуральной жидкости или 160,6 ед/мг
белка.
Как следует из сравнительных данных, приведенных в таблице, предлагаемый способ
получения внеклеточной β-галактозидазы по сравнению со способом-прототипом сокращает длительность процесса в 4-6 раз (с 12-ти до 2-3-х сут) и обеспечивает повышенный в
1,3-8,7 раза уровень синтеза ферментного белка и в 112,2-130,6 раза - более высокую его
удельную активность.
Сравнительная характеристика синтеза внеклеточной β-галактозидазы
бактериями Arthrobacter sulfonivorans ЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д)
и Bacillus sp. MTCC 3088 (прототип)
КолиАктивность
Содержачество Длительβ-галактозидазы
ние оргапосев- ность Температура
Штамм-продуцент
нического ед/мл
ного культи- культивироисточника культуβ-галактозидазы
мате- вировавания, °C
ед/мг белка
азота в
ральной
риала, ния, сут.
среде, % жидкости
%
Arthrobacter sul0,825fonivorans ЛФ-ГАЛ
2
2-3
27-29
24,7-43,6 138,0-160,6
1,100
(БИМ В-499-Д)
Bacillus sp. MTCC
5
12
37
2,05
5,0-19,0
1,23
3088 (прототип)
Таким образом, заявляемый способ получения β-галактозидазы бактериального происхождения превосходит известные аналоги по таким важнейшим показателям как бесспорно внеклеточная локализация фермента, продуцируемого неспорообразующими
бактериями Arthrobacter sulfonivorans ЛФ-ГАЛ (БИМ В-499-Д); увеличенный в 1,3-8,7 раз
уровень синтеза ферментного белка; повышенная в 112,2-130,6 раза его удельная активность; пониженное в 1,9-2,5 раза содержание органических источников азота в среде и в
2,5 раза - количество посевного материала; сокращенный в 4-6 раз период реализации
способа при пониженной на 8-10 °C температуре. Использование предлагаемого способа
обеспечивает по сравнению с прототипом упрощение процесса получения препарата
β-галактозидазы высокой степени очистки, сокращение его длительности, что ведет к существенному снижению материало-, трудо- и энергозатрат, удешевлению производства
фермента и повышению его рентабельности.
Источники информации:
1. Amaretti A., Bernardi Т., Tamburini E., Zanoni S., Lomma M., Matteuzzi D., Rossi M.
Kinetics and metabolism of Bifidobacterium adolescentis MB 239 growing on glucose, galactose, lactose, and galactooligosaccharides // Appl. Environ. Microbiol. - 2007. - V. 73. - No. 11. P. 2637-3644.
2. Sörensen H.P., Porsgaard Т.К., Kahn R.A., Stougaard P., Mortensen K.K., Johnsen M.G.
Secreted β-galactosidase from a Flavobacterium sp. isolated from a low-temperature environment // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2006. - V. 70. - P. 548-557.
4
BY 15050 C1 2011.10.30
3. Javorsky P., Lee S.F., Gibbins A.M.V., Forsberg C.W. Extracellular β-galactosidase activity of a Fibrobacter succinogenes S85 mutant able to catabo- lize lactose // Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - V. 56. - No. 12. - P. 3657-3663.
4. Сапунова Л.И., Костеневич А.А., Тамкович И.О., Лобанок А.Г. Поиск продуцентов
β-галактозидазы среди бактерий. Матер. VI Междунар. науч. конф. "Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии". - Минск 1-5 июня 2008. Минск: Изд. И.П. Логвинов, 2008. T. 1. - С. 171-173.
5. Sani R.K., Chakraborti S., Sobti R.C., Patnaik P.R., Banerjee U.C. Characterization and
some reaction-engineering aspects of thermostable extracellular β-galactosidase from a new Bacillus species // Folia Microbiol. - 1999. - V. 44. - No. 4. - P. 367-371 (прототип).
6. Chakraborti S., Sani R.K., Banerjee U.C., Sobti R.C. Purification and characterization of a
novel β-galactosidase from Bacillus sp. MTCC 3088 // J. Industrial Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 24. - P. 58-63 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
96 Кб
Теги
патент, by15050
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа