close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15108

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 15108
(13) C1
(19)
(46) 2011.12.30
(12)
(51) МПК
B 01J 20/26
A 61M 1/36
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
СОРБЕНТ ДЛЯ ИЗВЛЕЧЕНИЯ ИЗ БИОЛОГИЧЕСКИХ
ЖИДКОСТЕЙ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ЭНДОТОКСИНОВ
И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ
(21) Номер заявки: a 20090876
(22) 2009.06.15
(43) 2011.02.28
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научно-практический центр гематологии и трансфузиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь (BY)
(72) Авторы: Гапанович Владимир Николаевич; Бычко Галина Николаевна;
Расюк Елена Дмитриевна; Мельнова
Наталья Ивановна; Чехольский Анатолий Семенович; Самойленко Светлана
Геннадьевна; Голубович Владимир
Петрович; Поликарпова Валентина
Ивановна; Мартинович Вера Павловна; Кирковский Валерий Васильевич;
Старостин Александр Валерьянович
(BY)
BY 15108 C1 2011.12.30
(2006.01)
(2006.01)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научнопрактический центр гематологии и
трансфузиологии" Министерства здравоохранения Республики Беларусь (BY)
(56) JP 60-209525 A, 1985.
CN 101322933 A, 2008.
JP 2000-53583 A.
BY 8773 C1, 2006.
HANASAWA K. et al. Surgery, Gynecology & Obstetrics, 1989. - Vol. 168. P. 323-331.
US 5510242 A, 1996.
(57)
1. Сорбент для извлечения из биологических жидкостей бактериальных эндотоксинов,
представляющий собой полиакриламидный гель с иммобилизованным на нем полимиксином, в котором участок полимерной цепи с лигандом представлен формулой
NH2
O
C
CH2
CH n
CH2
CH
C
O
,
Полимиксин В
где n = 1-70 - число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации полимиксиновых лигандов, а число участков цепи с лигандом составляет 50-10000, при этом сорбент содержит полиакриламид, полимиксин и воду при следующем их соотношении, мас. %:
полиакриламид
5-10
полимиксин
0,1-0,5
вода
остальное.
BY 15108 C1 2011.12.30
2. Способ получения сорбента для извлечения из биологических жидкостей бактериальных эндотоксинов по п. 1, заключающийся в том, что к мономерам акриламиду и метиленбисакриламиду, растворенным в 2 %-ном растворе бикарбоната натрия, добавляют
ацилированный акрилоилхлоридом полимиксин, растворенный в 2 %-ном растворе бикарбоната натрия, к полученной смеси добавляют персульфат аммония и тетраметилендиамин, полученный гель измельчают и многократно промывают дистиллированной водой и
хлоридом натрия.
Изобретение относится к области биоорганической химии и медицины и может быть
использовано для избирательной сорбции бактериальных эндотоксинов и детоксикации
организма при лечении сепсисов, перитонитов и других заболеваний с синдромом интоксикации, а также для извлечения эндотоксинов из различных биологических жидкостей.
Пептидный антибиотик полимиксин инактивирует эндотоксины полилипосахаридной
природы, продуцируемые грамотрицательными бактериями. Однако его использование в
медицине ограничено из-за токсичного влияния на почки. Для уменьшения токсичных
эффектов было предложено использовать иммобилизацию полимиксина (полимиксин B,
полимиксин E/колистин и др.) на полимерные носители.
Известен сорбент, полученный ковалентной иммобилизацией полимиксина B на силохром, который предварительно был активирован введением альдегидных групп [1]. В
опытах in vitro была показана способность этого сорбента извлекать микробный токсин с
антигенными свойствами из плазмы и эритроцитов, что способствовало сохранению процентного состава популяции T-лимфоцитов, экспрессирующих на мембране рецепторы
типа FcR к иммуноноглобулинам IgM и IgA. Недостатком данного сорбента является его
низкая гемосовместимость и невозможность использования в непосредственных контактах с цельной кровью.
Наиболее близким к настоящему изобретению является сорбент, матрица которого
представляет собой полистирольные волокна, в которые были введены α-хлорацетамидометильные или сукцинилированные α-ацетамидометильные группы, необходимые для
иммобилизации полимиксина B [2]. Он был иммобилизован на эти волокна с использованием производных карбодиимида (дициклогексилкарбодиимида и 1-этил-3(3-диметиламинопропил)-карбодиимида) в качестве конденсирующих агентов или инкубированием с
α-хлорацетамидометильными волокнами при pH больше 7. В экспериментах с лабораторными животными (мышами, собаками) показано, что этот сорбент эффективен при лечении животных с бактериальным сепсисом. В дальнейшем авторы провели клинические
исследования сорбента при лечении различных интоксикаций и показали его эффективность относительно различных эндотоксемий у людей [3-4].
Недостатком сорбента на модифицированном полистирольном волокне является то,
что он создан в основном для лабораторных исследований и не находит широкого применения в клинической практике из-за сложности получения, невозможности стандартизации,
высокой стоимости. Полистирольная матрица из-за высокой гидрофобности не является
полностью биологически инертной.
Наиболее близким к заявляемому способу является способ получения сорбента для
избирательного выделения активатора плазминогена тканевого типа, заключающийся в
том, что к раствору гепарина добавляли раствор гидрокарбоната натрия при перемешивании и слабом нагревании при 30 °С [5]. В полученную смесь вносили акрилоилхлорид,
смесь энергично перемешивали при той же температуре, затем добавляли акриламид и
N,N'-метиленбисакриламид.
Полученную смесь перемешивали до полного растворения компонентов, а затем в нее
добавляли N,N,N,'N'-тетраметилендиамин и персульфат аммония и оставляли для полимеризации, которая происходила спустя 1,5-2 мин.
2
BY 15108 C1 2011.12.30
Известный способ не может быть принят в качестве прототипа, так как не имеет общих
признаков с заявляемым. Отличие состоит в различной химической структуре лигандов:
гепарин является полисахаридом, а полимиксин - полипептидом. Вследствие этого способ
иммобилизации лигандов на полимерной матрице также различен. В заявляемом сорбенте
полимиксин ковалентно иммобилизуют на матрице за счет образования амидной связи между
γ-аминогруппами диаминомасляной кислоты и карбоксилом полиакриламидной цепи.
Задачей изобретения является получение биологически активного сорбента для экстракорпоральной избирательной сорбции бактериальных липополисахаридов, подавляющего патологические проявления интоксикаций в биологических жидкостях, плазме и
цельной крови больных с различными типами бактериальных интоксикаций, исключение
нейро- и гепатотоксического действия.
Ковалентное селективное связывание молекул полимиксина позволяет исключить
возможность нейро- и гепатотоксического действия полимиксина.
Поставленная задача достигается за счет того, что сорбент для извлечения бактериальных
эндотоксинов представляет собой полиакриламидный гель с иммобилизованным на нем
поликсимином, в котором участок полимерной цепи с лигандом представлен формулой
NH2
O
C
CH2
CH n
CH2
CH
C
O
,
Полимиксин В
где n = 1-70 - число звеньев полиакриламидной цепи между центрами иммобилизации полимиксиновых лигандов, а число участков цепи с лигандом составляет 50-10000, при этом сорбент содержит полиакриламид, полимиксин и воду при следующем их соотношении, мас. %:
полиакриламид
5-10
полимиксин
0,1-0,5
вода
остальное.
Поставленная задача решается за счет того, что для получения сорбента для извлечения из биологических жидкостей бактериальных эндотоксинов к мономерам акриламиду и
метиленбисакриламиду, растворенным в 2 %-ном растворе бикарбоната натрия, добавляют
ацилированный акрилоилхлоридом полимиксин, растворенный в 2 %-ном растворе бикарбоната натрия, к полученной смеси добавляют персульфат аммония и тетраметилендиамин, полученный гель измельчают и многократно промывают дистиллированной водой и
хлоридом натрия.
Выбор полиакриламидной матрицы обусловлен ее стабильностью, биологической
инертностью, возможностью введения лиганда на стадии полимеризации. Для превращения полимиксина в мономер проводят его ацилирование акрилоилхлоридом, получая акрилоильное производное по γ-аминогруппам остатков диаминомасляной кислоты.
Способ получения сорбента приведен в примере.
Пример
0,100 г ацилированного полимиксина растворяют при перемешивании в 10 мл 2 %
раствора бикарбоната натрия, в раствор прибавляют каплями при перемешивании 0,12 мл
10 % раствора акрилоилхлорида в диоксане и перемешивают раствор магнитной мешалкой в течение 30 мин. Отдельно готовят раствор мономеров для получения полиакриламидного геля: в 40 мл 2 % раствора бикарбоната натрия последовательно вносят 4,5 г
акриламида, 0,5 г метиленбисакриламида. Объединяют полученный раствор с раствором
ацилированного полимиксина, прибавляют 0,18 г персульфата аммония и 0,12 мл тетраме3
BY 15108 C1 2011.12.30
тилендиамина. Все компоненты перемешивают и оставляют для полимеризации, которая
происходит спустя 3-5 мин. Полимеризованный гель оставляют на 30 мин, затем измельчают с использованием сита из нержавеющей стали с размером ячеек 3×3 мм, гранулы
промывают многократно дистиллированной водой (общий объем ~ 3 л), а затем 0,9 %
NaCl (общий объем ~ 1,5 л). Полноту отмывания контролируют измерением оптической
плотности промывных вод на спектрофотометре в области 300-380 нм. Отмытый сорбент
хранят в 0,9 % NaCl в холодильнике.
В полученном сорбенте полимиксин ковалентно иммобилизован на матрице за счет
образования амидной связи между γ-аминогруппами диаминомасляной кислоты и карбоксилом полиакриламидной цепи.
Контроль содержания полимиксина в полимеризованном геле проводят по стандартной методике кислотно-основного титрования.
1 мл отмытого геля помещают в пробирку для центрифугирования, добавляют 9 мл 0,1 н.
HCl, тщательно перемешивают в течение 5 мин и центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин.
В данной операции аминогруппы переводят в солевую форму.
Супернатант отделяют, гель промывают водой, добавляя в пробирку 10 мл, тщательно
взбалтывают и центрифугируют в тех же условиях. Операцию промывания и центрифугирования повторяют 3-4 раза до нейтральной реакции промывных вод.
К промытому гелю добавляют 2 мл 0,1 н. раствора NaOH и ~ 7 мл воды до 10 мл общего объема, все тщательно перемешивают.
Отбирают 2 мл надосадочной жидкости и титруют ее 0,02 н. HCl с метилоранжем.
Титрование повторяют два раза. Рассчитывают количество связавшегося NaOH, которое
эквивалентно количеству аминогрупп на геле. Данным контролем доказано, что все количество внесенного полимиксина присоединилось к полиакриламидному гелю.
Полученный сорбент соответствует требованиям ГОСТ 20790-93.
Данные по органолептическим, физико-химическим и биологическим показателям заявляемого сорбента приведены в таблице.
Основные свойства заявляемого сорбента
№
Значение показателя сорбента
Наименование показателей и ед. измерения
п/п
(соответствует норме)
1 Внешний вид
Полиакриламидный гидрогель, сформированный в виде волокон и гранул,
светло-серого цвета, без посторонних
включений, полностью покрытый раствором по всему объему модуля для
сорбции. Индивидуальная упаковка
внутри не должна иметь следов влаги
2 Водородный показатель (pH) раствора 0,9 %
От 5,0 до 7,0
хлорида натрия для инъекций, которым заполнен модуль для сорбции с биоспецифическим полиакриламидным гидрогелем
3 Потеря массы биоспецифического полиакриОт 83 до 93
ламидного гидрогеля при высушивании, %
4 Эндотоксинсвязывающая способность
0,5
биоспецифического полиакриламидного
гидрогеля (удельная сорбционная емкость),
мкг/мл, не менее
5 Испытание на стерильность
Стерильно
6 Испытание на пирогенность
Апирогенно
7 Объем биоспецифического полиакриламид- От 25 до 70 или другой в зависимости от
ного гидрогеля в модуле для сорбции, мл
объема используемого массообменника
4
BY 15108 C1 2011.12.30
Введение раствора сублетальной дозы эндотоксина экспериментальным животным
после его инкубации с сорбентом не оказывало влияния на организм кроликов, что подтверждалось стабильностью показателей артериального давления и свидетельствовало об
эффективной элиминации эндотоксина.
Таким образом, заявляемый способ получения сорбента, сутью которого является ковалентная иммобилизизация полимиксина на полиакриламидной матрице за счет образования амидной связи между γ-аминогруппами диаминомасляной кислоты и карбоксилом
полиакриламидной цепи, отличается простотой получения, обеспечивает невысокую стоимость получаемого сорбента. Используемая матрица является биологически инертной в
отличие от используемых ранее полистирольной и силохромной. Сорбент отличается высокой эндотоксинсвязывающей способностью, сорбирует из плазмы крови не менее
0,5 мг/мл геля эндотоксинов.
Источники информации:
1. Кулаев Д.В., Силантьева О.В., Лопухин Ю.М. Нарушения иммунитета и их коррекция
с применением полимиксинового сорбента при разлитом перитоните // Иммунология. 1993. - № 3. - С. 40-43.
2. Hanasawa К., Tani Т., Komada M. New approarch to endotoxic and septic shok by means
of polymyxin B immobilized fiber // Surgery, gynecoly and obstetrics. - 1989. - V. 168. - Nо. 1. P. 323-331.
3. Aoki H., Komada M., Tani T., Hanasawa K. Treatment of sepsis by extracorporeal elimination of endotoxin using polymyxin B-immobilized fiber // Am. J. Surg. - 1994. - Vol. 167. No. 4. - P. 412-417.
4. Komada M., Tani T., Maekawa K. et. al. Endotoxin eliminating therapy inpatients with
swwere sepsis-direct hemoperfusion using polymyxin B-immobilized fiber column // Nippon
Geka Gakkai Zasshi. - 1995. - Vol. 96. - No. 5. P. 277-285.
5. Патент РБ на изобретение 8773 "Биоафинный сорбент для избирательного выделения активатора плазминогена тканевого типа", МПК G 01N 30/48, опубл. 2005.09.30.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
97 Кб
Теги
by15108, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа