close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15197

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.12.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07K 14/35 (2006.01)
РЕКОМБИНАНТНАЯ КЛЕТКА MYCOBACTERIUM BOVIS
ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ ВАКЦИНЫ
С УЛУЧШЕННОЙ ЭФФЕКТИВНОСТЬЮ
(21) Номер заявки: a 20051121
(22) 2004.04.23
(31) 60/464,644 (32) 2003.04.23 (33) US
(85) 2005.11.23
(86) PCT/EP2004/004345, 2004.04.23
(87) WO 2004/094469, 2004.11.04
(43) 2006.04.30
(71) Заявитель: МАКС-ПЛАНК-ГЕЗЕЛЬШАФТ ЗУР ФЁРДЕРУНГ ДЕР
ВИССЕНШАФТЕН Е.В. (DE)
(72) Авторы: ГРОДЕ, Леандр; КАУФМАНН, Стефан, Г., Е.; РАУПАХ,
Бэрбель; ХЕСС, Юрген (DE)
BY 15197 C1 2011.12.30
BY (11) 15197
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: МАКС-ПЛАНКГЕЗЕЛЬШАФТ ЗУР ФЁРДЕРУНГ
ДЕР ВИССЕНШАФТЕН Е.В. (DE)
(56) RU 2197989 C2, 2003.
HESS J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci.
USA. - 1998. - V. 95. - No. 9. P. 5299-5304.
REYRAT J.M. et al. // Infect. Immun.,
1996. - V. 64. - No. 9. - P. 3934-3936.
CLEMENS D.L. et al. // J. Bacteriology,
1995. - V. 177. - No. 19. - P. 5644-5652.
(57)
1. Дефицитная по уреазе клетка Mycobacterium bovis для получения вакцины, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую слитый полипептид, включающий в себя, по меньшей мере, (а) один домен из полипептида, способный
вызывать иммунный ответ у млекопитающего, и (б) домен выхода из фаголизосом.
2. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что дефицит по уреазе получен инактивацией
последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующей, по меньшей мере, одну субъединицу клеточной уреазы.
3. Клетка по п. 2, отличающаяся тем, что инактивирована, по меньшей мере, последовательность, кодирующая C субъединицу клеточной уреазы.
4. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен выхода из фаголизосом представляет
собой домен выхода из фаголизосом Listeria.
5. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен выхода из фаголизосом кодируется
молекулой нуклеиновой кислоты, представляющей собой
(а) последовательность нуклеотидов, включающую нуклеотиды 211-1722 SEQ ID No:1,
(б) последовательность нуклеотидов, которая кодирует такую же аминокислотную последовательность, что и последовательность (а) или
(в) последовательность нуклеотидов, которая в жестких условиях гибридизуется с последовательностью (а) или (б).
6. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен способен вызывать иммунный ответ,
который представляет собой ответ МНС рестрицирующихся по классу I CD8 Т-клеток.
7. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен, способный вызывать иммунный ответ, представляет собой иммуногенный фрагмент полипептида из Mycobacterium.
8. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен, способный вызывать иммунный ответ, представляет собой антиген Mycobacterium, выбранный из Ag85B M.tuberculosis,
BY 15197 C1 2011.12.30
Ag85B M.bovis, Ag85A M.tuberculosis и ESAT-6 M.tuberculosis, либо его иммуногенный
фрагмент.
9. Клетка по п. 8, отличающаяся тем, что домен, способный вызывать иммунный ответ, представляет собой антиген Ag85B либо его иммуногенный фрагмент.
10. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что кодируемый слитый полипептид содержит
в своем начале сигнальную пептидную последовательность.
11. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что между доменом, вызывающим иммунный
ответ, и доменом выхода из фаголизосом расположен пептидный линкер.
12. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что рекомбинантная молекула нуклеиновой
кислоты операбельно связана с последовательностью, контролирующей ее экспрессию.
13. Клетка по п. 12, отличающаяся тем, что последовательность, контролирующая
экспрессию, активна в указанной клетке.
14. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что указанная рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты расположена в векторе.
15. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что домен из полипептида либо полипептид,
способный вызывать иммунный ответ, выбран из аутоантигена, опухолевого антигена, вирусного антигена, антигена паразита, бактериального антигена или его иммуногенного
фрагмента.
16. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что способна экспрессировать, по меньшей
мере, одну указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты.
17. Клетка по п. 16, отличающаяся тем, что способна секретировать полипептид, кодируемый указанной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты.
18. Клетка по п. 1, отличающаяся тем, что имеет внутриклеточную стабильность в
макрофаге, равную или меньше внутриклеточной стабильности нативной клетки Mycobacterium bovis.
19. Дефицитная по уреазе клетка Mycobacterium bovis для получения вакцины, содержащая, по меньшей мере, одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид либо полипептид выхода из фаголизосом.
20. Клетка по п. 19, отличающаяся тем, что дополнительно содержит, по меньшей
мере, одну рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид либо
полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего.
21. Клетка по п. 20, отличающаяся тем, что пептид либо полипептид, способный вызывать иммунный ответ, выбран из аутоантигена, опухолевого антигена, вирусного антигена, антигена паразита, бактериального антигена или его иммуногенного фрагмента.
22. Клетка по п. 19, отличающаяся тем, что способна экспрессировать, по меньшей
мере, одну указанную рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты.
23. Клетка по п. 22, отличающаяся тем, что способна секретировать полипептид, кодируемый указанной рекомбинантной молекулой нуклеиновой кислоты.
24. Клетка по п. 21, отличающаяся тем, что имеет внутриклеточную стабильность в
макрофаге, равную или меньше внутриклеточной стабильности нативной клетки Mycobacterium bovis.
25. Способ приготовления дефицитной по уреазе клетки Mycobacterium bovis по п. 1,
включающий стадии:
(i) получение дефицитной по уреазе клетки Mycobacterium bovis;
(ii) вставка в указанную клетку рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей слитый полипептид, который содержит, по меньшей мере, (а) один домен из
полипептида, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающего, и (б) домен выхода из фаголизосом.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что домен, способный вызывать иммунный
ответ у млекопитающего, выбирают из аутоантигена, опухолевого антигена, вирусного
антигена, антигена паразита, бактериального антигена или его иммуногенного фрагмента.
2
BY 15197 C1 2011.12.30
27. Способ приготовления дефицитной по уреазе клетки Mycobacterium bovis по п. 19,
включающий стадии:
(i) получение дефицитной по уреазе клетки Mycobacterium bovis;
(ii) вставка в указанную клетку Mycobacterium bovis рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид либо полипептид выхода из фаголизосом.
Настоящее изобретение касается новых рекомбинантных вакцин, обеспечивающих
защитный иммунитет в особенности против туберкулеза.
Туберкулез (ТВ), который вызывается микроорганизмом Mycobacterium tuberculosis,
остается существенной глобальной проблемой. Подсчитано, что каждый третий представитель мирового населения инфицирован M.tuberculosis (Kochi, 1991). Во многих странах
единственным способом контроля заболеваемости ТВ являлась вакцинация с использованием бациллы M.bovis Calmette-Guerin (BCG). Однако средняя общая эффективность вакцины BCG против ТВ составляет примерно 50 %, и значения ее сильно варьируют в
пределах от 0 до 80 % в разных конкретных случаях (Roche et al., 1995). Таким образом,
BCG должна быть улучшена, например посредством генной инженерии, с целью получения вакцины, позволяющей лучше контролировать заболеваемость ТВ (Murray et al., 1996;
Hess and Kaufmann, 1993). Такая широко распространенная опасность, как множественная
лекарственная устойчивость штаммов M.tuberculosis, дополнительно подчеркивает срочную необходимость в новых ТВ вакцинах (Grange, 1996).
M.tuberculosis относится к группе внутриклеточных бактерий, которые размножаются
внутри фагоцитарных вакуолей покоящихся макрофагов, таким образом, защита против
ТВ зависит от T-клеточного иммунитета (Kaufmann, 1993). Однако некоторые исследования, проведенные на мышах и человеке, показали, что Mycobacteria стимулируют антигенспецифичные CD4 и CD8 T клетки, несущие главный комплекс гистосовместимости
(MHC) класса II или класса I по рестрикции, соответственно (Kaufmann, 1993).
Важная роль CD8 T клеток, несущих MHC класса I по рестрикции, была убедительно
продемонстрирована посредством неудавшегося эксперимента по контролю экспериментального инфицирования микроорганизмами M.tuberculosis мышей, дефицитных по β2-микроглобулину (β2m) (Flynn et al., 1993). Поскольку эти мутантные мыши не имеют MHC
класса I, функциональные CD8 T клетки не могут развиваться. В отличие от инфекции
M.tuberculosis, β2m-дефицитные мыши способны усваивать определенные инфекционные
дозы вакцины на основе штамма BCG (Flynn et al., 1993; Ladel et al., 1995). Более того,
BCG вакцинация β2m-дефицитных мышей продлевала срок их выживания после последующего инфицирования M.tuberculosis, когда BCG-иммунизированные C57BL/6 демонстрировали устойчивость к ТВ (Flynn et al., 1993). Такая различная CD8 T-клеточная
зависимость между M.tuberculosis и BCG может быть объяснена следующим: антигены
M.tuberculosis имеют лучший доступ в цитоплазму, нежели антигены из BCG, что приводит
к более выраженной представленности MHC класса I (Hess and Kaufmann, 1993). Следовательно, более эффективный CD8 T-клеточный ответ генерируется M.tuberculosis. Данное
предположение было позже подтверждено повышенной представленностью MHC класса I
в случае не относящегося к делу антигена, овальбумина, совместной с M.tuberculosis, лучше
чем с BCG, инфекцией антиген-представляющих клеток (APC) (Mazzaccaro et al., 1996).
Секретируемые белки M.tuberculosis включают ценный источник антигенов для представления MHC класса I. Недавно ДНК вакцина, кодирующая секретируемый антиген
AgS85A, вызвала ответы CD8 T клеток, несущих MHC класса I по рестрикции у мышей,
которые могут способствовать защите от ТВ (Huygen et al., 1996). Вообще, накопленные
данные показывают, что иммунизация секретируемыми белковыми антигенами M.tuberculosis индуцирует некоторую защиту от ТВ у морских свинок и мышей (Horwitz et al.,
1995; Andersen, 1994). Следовательно, важной задачей на пути к разработке улучшенных
ТВ вакцин на основе BCG является увеличение доступности цитоплазмы инфицирован3
BY 15197 C1 2011.12.30
ных APC для секретируемых, BCG-специфичных антигенов. Последующая доставка пептидов, являющихся производными этих секретируемых белков, в последовательность событий представления MHC класса I может привести к усилению уже существующего
BCG-специфичного иммунного ответа, предупреждающего заболевание ТВ.
Высвобождение из фаголизосом L.monocytogenes представляет собой уникальный механизм усиления представления листериальных антигенов MHC класса I (Berche et al.,
1987; Portnoy et al., 1988). Листериолизин (Hly), порообразующий сульфгидрилактивируемый цитолизин, необходим для высвобождения микроорганизмов L.monocytogenes из фаголизосомальных вакуолей в цитозоль клетки хозяина (Gaillard et al., 1987; Portnoy et al.,
1988). Данная функция высвобождения была недавно передана штамму Bacillus subtilis и
ослабленному в своей вирулентности штамму Salmonella ssp. (Bielecki et al., 1991;
Gentschev et al., 1995; Hess and Kaufmann, 1997). Экспрессия Hly мутантным штаммом неспорообразующих B.subtilis или Salmonella ssp. приводила в результате к высвобождению
бактерий из фаголизосом в цитозоль J774 макрофаг-подобных клеток (Bielecki et al., 1991;
Gentschev et al., 1995; Hess and Kaufmann, 1997).
WO 99/101496 и Hess et al. (1998) описывают рекомбинантные штаммы Mycobacterium
bovis, которые секретируют биологически активные листериолизин-слитые белки. Было
показано, что данные штаммы M.bovis являются эффективными вакцинами против ТВ в
случае нескольких животных моделей.
В соответствии с настоящим изобретением, Hly был экспрессирован в дефицитных по
уреазе штаммах BCG. Эти дефицитные по уреазе штаммы BCG демонстрируют повышенную активность Hly в фагосомах и, в свою очередь, повышенную эффективность порообразования в мембранах эндосом, что свидетельствует об их превосходной эффективности
иммунной защиты. Кроме того, дефицитные по уреазе штаммы BCG-Hly вовлечены в
процессы апоптоза, которые могут также вносить свой вклад в наблюдаемое усиление
иммунной защиты. Таким образом, имеются широкие возможности по созданию вакцин
на основе дефицитных по уреазе штаммов BCG. Кроме того, было неожиданно обнаружено, что дефицитные по уреазе штаммы BCG являются более безопасными по сравнению с
родительскими штаммами BCG и, таким образом, могут применяться, в частности, для
вакцинации пациентов, страдающих иммунодефицитом.
Первым аспектом настоящего изобретения является бактериальная клетка, а именно
дефицитная по уреазе клетка Mycobacterium, содержащая рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, которая кодирует слитый полипептид, включающий (а) как минимум
один домен из полипептида, в котором данный полипептидный домен способен вызывать
иммунный ответ у млекопитающих, и (б) домен, ответственный за высвобождение из фаголизосом. Предпочтительно, чтобы клетка была способна экспрессировать молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся предметом настоящего изобретения. Более предпочтительно,
чтобы клетка была способна секретировать слитый полипептид и/или предоставлять его в
форме, пригодной для распознавания антигена MHC класса I по рестрикции.
Бактериальная клетка, являющаяся предметом настоящего изобретения, - это клетка,
дефицитная по уреазе, например, грамотрицательная либо грамположительная бактериальная клетка, предпочтительно клетка Mycobacterium. Дефицитность по уреазе может
быть достигнута посредством частичной либо полной инактивации одной или нескольких
клеточных молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих субъединицы уреазы, в частности
ureA, кодирующей A субъединицу уреазы, ureB, кодирующей B субъединицу уреазы,
и/или ureC, кодирующей C субъединицу уреазы. Последовательности ureA, ureB и ureC у
Mycobacteria, в частности у M.bovis и M.tuberculosis, а также кодируемые ими белки
описаны в работах Reyrat et al. (1995) и Clemens et al. (1995), которые включены в данное
описание во всей своей полноте путем отсылки.
Предпочтительно, когда дефицитный по уреазе бактериальный штамм получен посредством делеций и/или вставок одного либо нескольких нуклеотидов в последовательности
нуклеиновой кислоты, которые кодируют субъединицы уреазы, и/или в последовательно4
BY 15197 C1 2011.12.30
сти, контролирующей их экспрессию. Делеции и/или вставки могут быть получены в результате гомологичной рекомбинации, вставки транспозона либо применения других подходящих методов.
В рамках особо предпочтительного воплощения настоящего изобретения инактивирована последовательность ureC, например, посредством конструирования вектора-самоубийцы, включающего ген ureC, нарушенный с помощью селективного маркерного гена,
трансформации клетки мишени данным вектором и скринингом с целью отбора положительных по селективному маркеру клеток, имеющих негативный по уреазе фенотип, как
описано в Reyrat et al. (1995).
Клетка, являющаяся предметом настоящего изобретения, - это предпочтительно клетка M.bovis, клетка M.tuberculosis, в частности ослабленная в своей вирулентности клетка
M.tuberculosis, либо другая Mycobacteria, например, M.microti, M.smegmatis, M.canettii,
M.marinum или M.fortuitum, или Mycobacteria, как описано в Reyrat et al. (1995).
Клетка Mycobacterium, являющаяся предметом настоящего изобретения, содержит рекомбинантную молекулу нуклеиновой кислоты, например молекулу нуклеиновой кислоты
SEQ ID No.1. Данная молекула нуклеиновой кислоты включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид (нуклеотид 1-120), последовательность, кодирующую иммуногенный домен (нуклеотид 121-153), последовательность, кодирующую пептидный линкер
(нуклеотид 154-210), последовательность, кодирующую фаголизосомный домен (нуклеотид 211-1722), еще одну последовательность, кодирующую пептидный линкер (нуклеотид
1723-1800), и последовательность, кодирующую случайный пептид (нуклеотид 1801-1870).
Соответствующая аминокислотная последовательность представлена в SEQ ID No.2.
Нуклеиновая кислота содержит как минимум один иммуногенный домен из полипептида. Иммуногенный домен может быть выделен из организма рода Mycobacterium, предпочтительно из Mycobacterium tuberculosis или из Mycobacterium bovis. Этот домен имеет
длину как минимум 6 или предпочтительно как минимум 8 аминокислот. Иммуногенный
домен - это, предпочтительно, часть нативного полипептида Mycobacterium. Тем не менее,
в объем настоящего изобретения включен также модифицированный иммуногенный домен,
полученный из нативного иммуногенного домена посредством замены, делеции и/или
вставки одной либо нескольких аминокислот.
Иммуногенный домен, однако, не ограничивается антигеном Mycobacterium и может
быть выбран из числа аутоантигенов, раковых антигенов и антигенов патогена, таких как
вирусные антигены, антигены паразитов, антигены бактерий вообще и их иммуногенные
фрагменты. Специфические примеры подходящих раковых антигенов - это антигены рака
человека, такие как продукт гена супрессора опухоли p53 (Houbiers et al., 1993) и антигены дифференциации меланоцитов, например Melan-A/MART-1 и gp100 (van Elsas et al.,
1996). Специфические примеры подходящих вирусных антигенов - это антигены вируса,
опухоли человека, такие как антигены вируса папилломы человека, например антигены E6
и E7 (Bosch et al., 1991); антигены вируса гриппа, например нуклеопротеин вируса гриппа
(Matsui et al., 1995; Fu et al., 1997); или антигены ретровирусов, такие как HIV антигены,
например HIV-1 антигены p17, p24, RT и Env (Harrer et al., 1996; Haas et al., 1996). Конкретные примеры подходящих антигенов паразитов - это антигены Plasmodium, такие как
антиген печеночной стадии (LSA-1), белок круглого спорозоита (CS (circumsporozoite) или
аллельные варианты cp26 or cp29); тромбоспондин-связаный безымянный белок (TRAP),
треонин- и аспарагин- богатый белок спорозоита (STARP) Plasmodium falciparum (Aidoo
et al., 1995) и антигены Toxoplasma, такие как p30 из Toxoplasma gondii (Khan et al., 1991;
Bulowand Boothroyd, 1991). Конкретные примеры подходящих бактериальных антигенов это антигены Legionella, такие как Главный белок-помощник (Major secretary protein) из
Legionella pneumophila (Blander and Horwitz, 1991).
Иммуногенный домен способен вызывать иммунный ответ у млекопитающих. Данный
иммунный ответ может быть опосредован B клеточным иммунным ответом. Предпочтительно, тем не менее, если иммуногенный домен способен вызывать опосредованный
5
BY 15197 C1 2011.12.30
T клетками иммунный ответ, более предпочтительно CD8 T клеточный ответ MHC класса I
по рестрикции.
Домен, способный вызывать иммунный ответ, наиболее предпочтительно выбирается
из иммуногенных пептидов либо полипептидов из M.bovis или M.tuberculosis, или из их
иммуногенных фрагментов. Специфические примеры подходящих антигенов - это Ag85B
(p30) из M.tuberculosis (Harth et al., 1996), Ag85B (a-antigen) из BCG M.bovis (Matsuo
et al.,1988), Ag85A из M.tuberculosis (Huygen et al., 1996) и ESAT-6 из M.tuberculosis
(Sorensen et al., 1996, Harboe et al., 1996 and Andersen et al., 1995). Более предпочтительно,
когда иммуногенный домен получен из антигена Ag85B. Наиболее предпочтительно, когда иммуногенный домен содержит последовательность из аминокислот с 41 до 51 в последовательности SEQ ID No.2.
В соответствии с настоящим изобретением, рекомбинантная молекула нуклеиновой
кислоты также включает домен выхода из фаголизосом, то есть полипептидный домен,
который осуществляет высвобождение слитого полипептида из фаголизосом в цитозоль
клетки млекопитающего. Предпочтительно, когда домен выхода из фаголизосом является
доменом выхода из фаголизосом Listeria, который описан в US 5 733 151, который включен в данное описание во всей своей полноте путем отсылки. Более предпочтительно, когда домен выхода из фаголизосом выделен из организма L.monocytogenes. Наиболее
предпочтительно, когда домен выхода из фаголизосом кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, выбранной из: (a) последовательности нуклеотидов, включающей нуклеотиды 211-1722, как показано в SEQ ID No.1, (b) последовательности нуклеотидов, которая
кодирует ту же аминокислотную последовательность, что и последовательность из (a), и
(c) последовательности нуклеотидов, которая в жестких условиях гибридизуется с последовательностями из (a) или (b).
Помимо последовательности нуклеотидов, представленной как SEQ ID No.1, настоящее изобретение также включает в себя гибридизующиеся с ней последовательности нуклеиновых кислот. В рамках настоящего изобретения термин "гибридизация" используется,
как это определено в Sambrook et al. (Molecular Cloning. A laboratory manual, Cold Spring
Harbor Laboratory Press (1989), 1.101-1.104). В соответствии с настоящим изобретением,
термин "гибридизация" используется в том случае, когда положительный гибридизационный сигнал может все еще наблюдаться после отмывки в течение одного часа с использованием 1 X SSC и 0,1 % SDS при 55 °С, предпочтительно при 62 °С и более предпочтительно при 68 °С, и особенно в случае 1 часа в 0,2 X SSC и 0,1 % SDS при 55 °С,
предпочтительно при 62 °С и более предпочтительно при 68 °С. Последовательность, гибридизующаяся при таких условиях отмывки с последовательностью нуклеотидов, представленной как SEQ ID No.1, является последовательностью нуклеотидов, кодирующей
домен выхода из фаголизосом, предпочтительной для настоящего изобретения.
Последовательность нуклеотидов, кодирующая домен выхода из фаголизосом, как
описано выше, может быть прямо получена из организма Listeria либо из любого рекомбинантного источника, например рекомбинантных клеток E.coli, содержащих соответствующую молекулу нуклеиновой кислоты Listeria или ее вариант, как описано выше.
Предпочтительно, когда рекомбинантная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый полипептид, включает последовательность, кодирующую сигнальный пептид.
Более предпочтительно, когда сигнальная последовательность является сигнальной последовательностью активной в Mycobacteria, предпочтительно в M.bovis, например, нативной
сигнальной последовательностью M.bovis. Предпочтительным примером подходящей
сигнальной последовательности является последовательность нуклеотидов, кодирующая
сигнальный пептид Ag85B, которая представлена в SEQ ID No.1 с нуклеотида 1 по 120.
Кроме того, предпочтительно, чтобы пептидный линкер был введен между иммуногенным доменом и доменом выхода из фаголизосом. Предпочтительно, когда такой пептидный линкер имеет длину от 5 до 50 аминокислот. Более предпочтительно, когда
последовательность кодирует линкер, соответствующий показанному в SEQ ID No.1 с
6
BY 15197 C1 2011.12.30
нуклеотида 154 по 210, либо когда последовательность соответствует ей с учетом вырождения генетического кода.
Нуклеиновая кислота может быть расположена в рекомбинантном векторе. Предпочтительно, когда рекомбинантный вектор является прокариотическим вектором, то есть
вектором, содержащим необходимые элементы для репликации и/или интеграции в геном
в клетке прокариот. Предпочтительно, когда рекомбинантный вектор несет молекулу нуклеиновой кислоты, являющуюся предметом настоящего изобретения, действенно связанную
с последовательностью, контролирующей экспрессию. Предпочтительно, когда контролирующая экспрессию последовательность является контролирующей экспрессию последовательностью активной в Mycobacteria, в частности в M.bovis. Вектор может являться
внехромосомным вектором либо вектором, пригодным для интеграции в хромосому.
Примеры таких векторов хорошо известны профессионалам в данной области и, кроме
того, описаны в работах Sambrook et al.
Следующим аспектом настоящего изобретения являются дефицитные по уреазе клетки бактерий, например клетки Mycobacterium, предпочтительно клетки M.bovis, которые
содержат хотя бы одну молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид либо полипептид выхода из фаголизосом. Даже в том случае, когда пептид либо полипептид выхода
из фаголизосом не является слитым с антигеном, обнаруживается удивительное улучшение иммуногенных свойств.
Рекомбинантная бактериальная клетка, представленная в соответствии с данным дополнительным аспектом настоящего изобретения, может содержать как минимум один
дополнительный рекомбинант, например молекулу инородной нуклеиновой кислоты, кодирующую пептид либо полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающих. Такой дополнительный иммуногенный пептид либо полипептид может быть
отобран из числа антигенов Mycobacterium или, в широком смысле, из аутоантигенов,
опухолевых антигенов, антигенов патогенов и их иммуногенных фрагментов. Молекула
нуклеиновой кислоты, кодирующая дополнительный пептид либо полипептид, может
быть расположена в том же векторе, что и слитый ген. Однако она также может располагаться, к примеру, на другой плазмиде, независимо от слитого гена, или быть интегрированной в хромосому.
Было неожиданно обнаружено, что соответствующая настоящему изобретению клетка
Mycobacterium имеет такую внутриклеточную стабильность в зараженных клетках,
например макрофагах, которая одинакова или меньше, нежели внутриклеточная стабильность соответствующей нативной клетки Mycobacterium, не содержащей рекомбинантную
молекулу нуклеиновой кислоты.
Настоящее изобретение также касается фармацевтической композиции, содержащей в
качестве активного агента описанную выше клетку, не обязательно вместе с фармацевтически приемлемыми растворителями, носителями и адъювантами. Предпочтительно, когда композиция является живой вакциной, пригодной для введения млекопитающим,
предпочтительно человеку. Фактически выбранный способ вакцинации зависит от выбора
вакцинного вектора. Введение может осуществляться посредством введения единичной
дозы либо повторяющихся доз через определенные интервалы времени. Подходящая дозировка зависит от различных параметров, таких как вакцинный вектор сам по себе, или
способ введения. Может быть выбран способ введения через поверхность слизистой оболочки (например, глазной, интраназальный, оральный, желудочный, кишечный, ректальный, вагинальный или через мочевые пути) либо по парентеральному пути (например,
подкожно, внутрикожно, внутримышечно, внутривенно или внутрибрюшинно).
Кроме того, настоящее изобретение касается способа приготовления рекомбинантных
клеток бактерий, как описано выше. В соответствии с первым аспектом настоящего изобретения, данный способ включает такие стадии, как (i) получение дефицитной по уреазе
бактериальной клетки, в частности клетки Mycobacterium, (ii) вставка рекомбинантной
молекулы нуклеиновой кислоты в эту бактериальную клетку, причем данная молекула
7
BY 15197 C1 2011.12.30
нуклеиновой кислоты кодирует слитый полипептид, включающий в себя (а) как минимум
один домен из полипептида, в котором этот домен способен вызывать иммунный ответ в
клетках млекопитающих, и (б) домен выхода из фаголизосом, и (iii) культивирование клеток, полученных в соответствии со стадией (ii) при подходящих условиях. Предпочтительно, когда получена клетка, которая способна экспрессировать описанную молекулу
нуклеиновой кислоты. Более предпочтительно, когда клетка является клеткой M.bovis.
В соответствии со следующим аспектом настоящего изобретения, данный способ
включает в себя такие стадии, как (i) получение дефицитной по уреазе бактериальной
клетки, в частности клетки Mycobacterium, (ii) вставка рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты в эту бактериальную клетку, причем данная молекула нуклеиновой кислоты кодирует пептид либо полипептид выхода из фаголизосом, и (iii) культивирование
клеток, полученных в соответствии со стадией (ii) при подходящих условиях.
При желании, способ, являющийся предметом настоящего изобретения, включает в
себя вставку в бактериальную клетку как минимум одной дополнительной рекомбинантной молекулы нуклеиновой кислоты, причем данная молекула нуклеиновой кислоты кодирует пептид либо полипептид, способный вызывать иммунный ответ у млекопитающих.
Наконец, данное изобретение касается способа приготовления живой вакцины, содержащей разработанные рекомбинантные клетки в фармацевтически эффективном количестве
вместе с фармацевтически приемлемыми растворителями, носителями и/или адъювантами.
Благодаря высокой безопасности дефицитных по уреазе бактериальных клеток, которая была продемонстрирована на двух различных животных моделях (Пример 3), живая
вакцина, являющаяся объектом настоящего изобретения, может быть в отдельных случаях
пригодной для введения испытуемым с иммунодефицитом, например испытуемым, страдающим от инфекции, или субъектам, подверженным действию иммуносупрессорных препаратов. В особо предпочтительном воплощении, живая вакцина, являющаяся объектом
настоящего изобретения, используется как туберкулезная вакцина для испытуемых с иммунодефицитом.
В следующем предпочтительном воплощении, живая вакцина используется как опухолевая вакцина, например как вакцина против поверхностного рака мочевого пузыря. В
следующем еще более предпочтительном воплощении настоящего изобретения, живая
вакцина используется в области ветеринарии, например как вакцина против листериоза,
туберкулида или бычьего туберкулеза.
Настоящее изобретение будет далее проиллюстрировано нижеследующими фигурами
и списком последовательностей.
Фиг. 1: демонстрирует защитную способность rBCG ureC Hly в аэрозольной модели
мышечного туберкулеза. BALB/c мыши были внутривенно иммунизованы с использованием 1x106 CFU (koe) rBCG ureC Hly, BCG P ureC либо нативной BCG "Pasteur". Спустя
120 дней после вакцинации в организм животных было введено H37Rv (200 организм/легкие) посредством аэрозоля. Содержание бактерий в инфицированных органах
(селезенка и легкие) было оценено через 30, 60 и 90 дней после введения. Каждая точка
соответствует 10 животным.
Фиг. 2: демонстрирует число микроорганизмов в легких (Фиг. 2a) либо в селезенке
(Фиг. 2b). Ragl-/- мыши были инфицированы родительским штаммом BCG (дикий тип),
либо штаммом rBCG ureC Hly (urea-Hly). Содержание бактерий в инфицированном органе
было оценено через 30, 60 и 90 дней после инфекции.
Фиг. 3: демонстрирует коэффициент выживания SCID мышей, инфицированных с использованием BCG "Pasteur" и rBCG delta ureC Hly.
SEQ ID No.1: показывает последовательность нуклеотидов молекулы нуклеиновой
кислоты в соответствии с настоящим изобретением.
SEQ ID No.2: показывает соответствующую последовательность аминокислот молекулы нуклеиновой кислоты из SEQ ID No.1.
8
BY 15197 C1 2011.12.30
Пример 1. Получение дефицитных по уреазе штаммов BCG Hly и тесты на мышиной модели
1. Инактивация уреазной активности BCG delta ureC.
С целью увеличить защитную способность штамма BCG, содержащего белок Hly
(rBCG-Hly), уреазная активность была удалена.
Для получения дефицитного по уреазе мутанта, Reyrat et al. сконструировали векторсамоубийцу, включающий в себя ген ureC, нарушенный канамициновым маркером (ген aph).
Два микрограмма данного конструкта было линеаризовано с использованием Sac I рестриктазы и введено в M.bovis BCG путем электропорации. Устойчивые к канамицину трансформанты подверглись отбору на негативный по уреазе фенотип (cf. Reyrat et al, 1995).
2. Конструирование "челночного" mycobacterial E. coli экспрессионного вектора
pMV306:Hly.
Для передачи функции выхода из фагосомы (опосредованной Hly L.monocytogenes
EGD Sv 1/2a) BCG Pasteur (1173 P3) delta ureC был использован E. coli-mycobacterial "челночный вектор". Встраивающаяся в геном плазмида pMV306, предшественник вектора
pMV361, делает возможной стабильную хромосомную экспрессию Hly.
Выделенный из plLH-1 1,7-т.п.н. PstI фрагмент ДНК, кодирующий открытую рамку
считывания (ORF) hly-hlyA (E. coli pHly152-специфичный гемолизин A), был вставлен в
PstI сайт плазмиды pAT261. Полученный в результате слитый ген обеспечивал экспрессию секреторных белков, направляемых в супернатант посредством BCG-специфичного
сигнального пептида Ag85B. Данный конструкт был назван pAT261:Hly и его ДНК экспрессионная кассета XbaI-SalI, находящаяся под транскрипционным контролем hsp60 микобактериального промотора, была последовательно использована для вставки в
родительский вектор pMV306, приведшей к получению конструкта pMV306:Hly. Была
проанализирована последовательность ДНК hly-специфичных сайтов вставки в обеих микобактериальных экспрессионных плазмидах. Предположительно, зрелый Hly-слитый белок содержит 30 аминокислот на N конце и 52 аминокислоты в C-концевой части слитого
белка, которые частично совпадают с HlyA E. coli.
3. Защитная способность в рамках мышиной модели.
Экспрессионный вектор pMV306:Hly был трансформирован в дефицитный по уреазе
штамм BCG pasteur (BCG P ureC). Полученный в результате штамм был обозначен как
rBCG ureC Hly. Защитная способность этого дефицитного по уреазе штамма микобактерий, в сравнении с родительским BCG Pasteur и BCG Pasteur ureC, в случае модели мышечного туберкулеза показана на фиг. 1. Было неожиданно обнаружено, что rBCG ureC
Hly вызывал усиленную защиту уже в ранних временных точках (день 30 после инфекции), которая продолжалась в течение всего срока наблюдения (до дня 90).
Был предпринят следующий эксперимент по длительной защите с использованием
rBCG ureC Hly. BALB/c мыши были внутривенно вакцинированы с использованием rBCG
ureC Hly, rBCG-Hly или родительского BCG и обработаны с использованием аэрозоля на
120 день после вакцинации M. tuberculosis H37Rv. RBCG-Hly и родительские BCG вызывали соизмеримую по эффективности защиту против M. tuberculosis H37Rv к дню 90. В
отличие от них, rBCG ureC Hly вызывал усиленную защиту уже в ранних временных точках, начиная со дня 30 после инфекции. Более того, данная усиленная защита длилась в
течение всего периода наблюдения и показывала уменьшение содержания M. tuberculosis
H37Rv в легких на 90 день после инфекции в более чем 2 log CFU (кое), в сравнении с нативными мышами, и в более чем 1 log CFU (koe) по сравнению с мышами, вакцинированными родительским BCG.
Похожие результаты были получены после заражения клиническим изолятом
M. tuberculosis Beijing. BALB/c мыши были внутривенно иммунизированы с использованием rBCG ureC Hly, BCG-Hly или родительского BCG и обработаны с помощью аэрозоля
на 120 день после вакцинации M. tuberculosis Beijing. Вакцинация с использованием BCG
9
BY 15197 C1 2011.12.30
ureC Hly вызывала усиленную защиту против M. tuberculosis Beijing уже в ранних временных точках (день 30), которая продолжалась в течение всего срока наблюдения до дня 90
после инфекции. В сравнении с вакцинацией родительским BCG, вакцинация с использованием rBCG ureC Hly вела к уменьшению содержания M. tuberculosis Beijing в легких в 1
log CFU (кое).
Пример 2. Длительная защита против M. tuberculosis H37Rv в морских свинках
Поскольку мыши являются относительно устойчивыми к инфекции M. tuberculosis,
морские свинки, как более восприимчивая животная модель, были использованы для проверки на вакцинационную способность rBCG ureC Hly. Морские свинки были подкожно
иммунизированы с использованием соответствующего вакцинного штамма микобактерий,
rBCG ureC Hly или родительского BCG, и привес, также как и CFU, наблюдался после
введения M. tuberculosis H37Rv. Морские свинки, иммунизированные с использованием
rBCG ureC Hly, показывали одинаковый привес с теми животными, которые были вакцинированы родительским штаммом BCG вплоть до дня 120, в то время как невакцинированные животные страдали от ТВ, о чем свидетельствовало падение привеса тела.
Визуальная проверка легких и селезенки перед анализом CFU показала, что туберкулы
на поверхности обоих органов, взятых у BCG-иммунизированных морских свинок, были
намного больше по размеру и более многочисленны чем те, что были взяты у BCG ureC
Hly- вакцинированных животных.
Пример 3. Оценка безопасности BCG ureC Hlv
Мыши Rag 1-/-, дефицитные по T- и B-клеткам, были инфицированы 106 микроорганизмами родительского штамма BCG (дикий тип) или штамма rBCG ureC Hly. Наблюдалось присутствие микроорганизмов в легких и селезенке. Значительно уменьшенное CFU
rBCG ureC Hly были отмечены в легких (фиг. 2a). В селезенке слегка уменьшенные значения CFU были отмечены после инфекции rBCG ureC Hly в сравнении с инфекцией родительским BCG (фиг. 2b).
Далее, безопасность BCG ureC Hly была протестирована на иммунодефицитных SCID
мышах. Для этой цели SCID мыши были внутривенно привиты с использованием 107-108
микроорганизмов rBCG ureC Hly или родительского штамма BCG. В то время как SCID
мыши, привитые родительским штаммом, умирали в срок до 25 после инъекции, мыши,
привитые rBCG ureC Hly, выживали до 150 дня после инъекции (фиг. 3).
Данные эксперименты продемонстрировали, что BCG ureC Hly является более безопасной по сравнению с родительским штаммом BCG.
Источники информации:
1. Aidoo, M., Lalvani, A., Allsopp, C.E.M. et al. (1995), Identification of conserved antigenic components for a cytotoxic T lymphocyte-inducing vaccine against malaria, The Lancet 345:
1003.
2. Andersen, P. (1994), Effective vaccination of mice against Mycobacterium tuberculosis
infection with a soluble mixture of secreted Mycobacterial protein, Infect. Immun. 62: 25362544.
3. Andersen, P., Andersen, A.B., Sorensen, A.L. and Nagai, S. (1995), Recall of long-lived
immunity to Mycobacterium tuberculosis infection in mice, J. Immunol. 154: 3359.
4. Berche, P., Gaillard, J.L, and Sansonetti, P.J. (1987), Intracellular growth of
L.monocytogenes as a prerequisite for in vivo induction of T cell-mediated immunity, J. Immunol. 138: 2266-2276.
5. Bielecki, J., Youngman, P., Connelly, P., and Portnoy, D.A. (1990), Bacillus subtilus expressing a hemolysin gene from Listeria monocytogenes can grow in mammalian cells, Nature
354: 175-176.
6. Blander, S.J. and Horwitz, M.A. (1991), Vaccination with a major secretory protein of
Legionella induces humoral and cell-mediated immune responses and protective immunity
10
BY 15197 C1 2011.12.30
across different serogroups of Legionella pneumophila and different species of Legionella, J.
Immunol. 147: 285.
7. Bosch, F.X., Durst, M., Schwarz, E., Boukamp, P., Fusenig, N.E. and zur Hausen, H.
(1991), The early genes E6 and E7 of cancer associated human papilloma viruses as targets of
tumor suppression, Behring Inst. Mitt. 108.
8. Bulow, R. and Boothroyd, J.C. (1991), Protection of mice from fatal Toxoplasma gondii
infection by immunization with p30 antigen in liposomes, J. Immunol. 147: 3496.
9. Clemens, D.L., and Horwitz, M.A. (1996), The Mycobacterium tuberculosis phagosome
interacts with early endosomes and is accessible to exogenously administered transferrin, J. Exp.
Med. 184: 1349-1355.
10. Clemens, D.L., Lee B.Y., Horwitz, M.A. (1995), Purification, characterization, and
genetic analysis of Mycobacterium tuberculosis urease, a potentially critical determinant of
host-pathogen interaction. J. Bacteriol. 1995 177: 5644-5652.
11. Darji, A., Chakraborty, T., Wehland, J., and Weiss, S. (1996), Listeriolysin generates a
route for the presentation of exogenous antigens by major histocompatibility complex class I,
Eur. J. Immunol. 25: 2967-2971.
12. Domann, E., and Chakraborty, T. (1989), Nucleotide sequence of the listeriolysin gene
from a Listeria monocytogenes serotype 1/2a strain, Nucleic Acids Res. 17: 6406.
13. Flesch, I., Hess, J.H., Oswald, IP., and Kaufmann, S.H.E. (1994), Growth inhibition of
Mycobacterium bovis by IFN-y stimulated macrophages: regulation by endogenous tumor necrosis factor-a and by IL-10, Int. Immunol. 6: 693-700.
14. Flynn, J.L., Goldstein, M.M., Triebold, K.J., Koller, B., and Bloom, B.R. (1992), Major
histocompatibility complex class 1-restricted T cells are required for resistance to Mycobacterium tuberculosis infection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 12013-12017.
15. Fu, T.M., Friedman, A., Ulmer, J.B., Liu, M.A. and Donnelly, J.J. (1997), Protective cellular immunity: cytotoxic T-Iymphocyte responses against dominant and recessive epitopes of
influenza virus nucleoprotein induced DNA immunization, J. Virol. 71: 2715.
16. Gaillard, J.L., Berche, P., Mounier, J., Richard, S., and Sansonetti, P.J. (1987), In vitro
model of penetration and intracellular growth of Listeria monocytogenes in the human enterocyte- Iike cell line Caco-2, Infect. Immun. 55: 2822-2829.
17. Gentschev, I., Sokolovic, Z., Mollenkopf, H.-J., Hess, J., Kaufmann, S.H.E., Kuhn, M.,
Krohne, G.F., and Goebel, W. (1995), Salmonella secreting active listeriolysin changes its intracellular localization, Infect. Immun. 63: 4202-4205.
18. Grange, J.M. (1996), Epidemiological aspects of drug resistance, in Mycobacteria and
human disease, Arnold, London, pp. 124-125.
19. Haas, G., Plikat, U., Debre, P., Lucchiari, M., Katlama, C., Dudoit, Y., Bonduelle, O.,
Bauer, M. Ihlenfeldt, H.G., Jung, G., Maier, B., Meyerhans, A. and Autran, B. (1996), Dynamics of
viral variants in HIV-1 Nef and specific cytotoxic T lymphocytes in vivo, J. Immunol. 157: 4212.
20. Harboe, M., Oettinger, T., Wiker, H.G. et al. (1996), Evidence for occurrence of the
ESAT-6 protein in Mycobacterium tuberculosis and virulent Mycobacterium bovis and for its
absence in Mycobacterium bovis BCG, Infect. Immun. 64: 16.
21. Harrer, T., Harrer, E., Kalams, S.A., Barbosa, P., Trocha, A., Johnson, R.P., Elbeik, T.,
Feinberg, M.B., Buchbinder, S.P. and Walker, B.D. (1996), Cytotoxic T lymphocytes in asymptomatic long-term nonprogressing HIV-1 infection. Breadth and specificity of the response and
relation to in vivo viral quasispecies in a person with prolonged infection and low viral load, J.
Immunol. 156: 2616.
22. Harth, G., Lee, B.-Y., Wang. J., Clemens, D.L., and Horwitz, M.A. (1996), Novel insights into the genetics, biochemistry, and immunocytochemistry of the 30-kilodalton major extracellular protein of Mycobacterium tuberculosis, Infect. Immun. 64: 3038-3047.
23. Hess, J., Wels, W., Vogel, M., and Goebel, W. (1986), Nucleotide sequence of plasmidencoded hemolysin determinant and its comparison with a corresponding chromosomal hemolysin sequence, FEMS Lett. 34: 1-11.
11
BY 15197 C1 2011.12.30
24. Hess, J., and Kaufmann, S.H.E. (1993), Vaccination strategies against intracellular microbes, FEMS Microbiol. Immunol. 7: 95-103.
25. Hess, J., Gentschev, I., Miko, D., Welzel, M., Ladel, C., Goebel, W., and Kaufmann,
S.H.E. (1996), Superior efficacy of secreted over somatic p60 or listeriolysin antigen display in
recombinant Salmonella vaccine induced protection against listeriosis, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 93: 1458-1463.
26. Hess, J., and Kaufmann, S.H.E. (1997), Principles of cell-mediated immunity underlying
vaccination strategies against intracellular pathogens, in Host Response to Intracellular Pathogens, S.H.E. Kaufmann (ed), R.G. Landes Co., Austin, pp. 75-90.
27. Hess J., Miko D., Catic A., Lehmensiek V., Russell DG., Kaufmann SH., (1998), Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin strains secreting listeriolysin of Listeria monocytogenes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95(9): 5299-304.
28. Horwitz, M.A., Lee, B.-W. E., Dillon, B.J., and Harth, G. (1995), Protective immunity
against tuberculosis induced by vaccination with major extracellular proteins of Mycobacterium
tuberculosis, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 1530-1534.
29. Houbiers, J.G.A., Nijman, H.W., van der Burg, S.H., Drijfhout, J.W., Kenemans, P., van
de Velde, C.J.H., Brand, A., Momburg, F., Kast, W.M. and Melief, C.J.M. (1993), In vitro induction of human cytotoxic T lymphocyte responses against peptides of mutant and wild-type
p53, Eur. J. Immunol. 23: 2072.
30. Huygen, K., Content, J., Denis, O., Montgomery, D.L., Yawman, A.M., Deck, R.R.,
DeWitt, C.M., Orme, I.M., Baldwin, S., D'Souza, C., Drowart, A., Lozes, E., Vandenbussche, P.,
Van Vooren, J.-P., Liu, M.A., and Ulmer, J.B. (1996), Immunogenicity and protective efficacy
of a tuberculosis DMA vaccine, Nat. Med. 2: 893-898.
31. Kaufmann, S.H.E. (1993), Immunity to intracellular bacteria, Annu. Rev. Immunol. 11:
129-163.
32. Khan, I.A., Ely, K.H. and Kasper, L.H. (1991), A purified parasite antigen (p30) mediates
CD8 T cell immunity against fatal Toxoplasma gondii infection in mice, J. Immunol. 147: 3501.
33. King, C.H., Mundayoor, S., Crawford, J.T. and Shinnik, T.M. (1993), Expression of contact-dependent cytolytic activity by Mycobacterium tuberculosis and isolation of the genomic
locus that encodes the activity, Infect. Immun. 61: 2708-2712.
34. Kochi, A. (1991), The global tuberculosis situation and the new control strategy of the
World Health Organization, Tubercle 72: 1-6.
35. Ladel, C.H., Daugelat, S., and Kaufmann, S.H.E. (1995), Immune response to Mycobacterium bovis bacille Calmette Guerin infection in major histocompatibility complex class I- and
II-deficient knock-out mice: contribution of CD4 and CD8 T cells to acquired resistance, Eur. J.
Immunol. 25: 377-384.
36. Laemmli, U.K. (1970), Cleavage of structural proteins during the assembly of the head
of bacteriophage T4, Nature 227: 680-685.
37. Langermann, S., Palaszynski, S.R., Burlein, J.E., Koenig, S., Hanson, M.S., Briles, D.E.,
and Stover, C.K. (1994), Protective humoral response against pneumococcal infection in mice
elicited by recombinant Bacille Calmette-Guerin vaccines expressing pneumococcal surface protein A., J. Exp. Med. 180: 2277-2286.
38. Matsui, M., Moots, R.J., Warburton, R.J., Peace-Brewer, A., Tussey, L.G., Quinn, D.G.,
McMichael, A.J. and J.A. Frelinger (1995), Genetic evidence for differences between intracellular peptides of influenza A matrix peptide-specific CTL recognition, J. Immunol. 154: 1088.
39. Matsuo, K., Yamaguchi, R., Yamazaki, A., Tasaka, H., Terasaka, K., and Yamada, T.
(1990), Cloning and expression of the Mycobacterium bovis BCG gene for extracellular alpha
antigen, J. Bacteriol. 170: 3847-3854.
40. Mazzaccaro, R.Z., Gedde, M., Jensen, E.R., Van Santen, H.M., Ploegh H.L., Rock, K.L.,
and Bloom, B.R. (1996), Major histocompatibility class I presentation of soluble antigen facilitated by Mycobacterium tuberculosis infection, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 11786-11791.
12
BY 15197 C1 2011.12.30
41. McDonough, K.A., Kress, Y., and Bloom, B.R. (1993), Pathogenesis of tuberculosis: Interaction of Mycobacterium tuberculosis with macrophages, Infect. Immun. 61: 2763-2773.
42. Murray, P.J., Aldovini, A., and Young, R.A. (1996), Manipulation and potentiation of
anti-mycobacterial immunity using recombinant bacilli Calmette-Guerin strains that secrete cytokines, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 934-939.
43. Nato, F., Reich, K., Lhopital, S., Rouye, S., Geoffrey, C., Mazie, J.C., and Cossart, P.
(1991), Production and characterization of neutralizing and non-neutralizing monoclonal antibodies against listeriolysin O., Infect. Immun. 59: 4641-4646.
44. Portnoy, D.A., Jacks, P.S., and Hinrichs, D.J. (1988), Role of hemolysin for the intracellular growth of Listeria monocytogenes, J. Exp. Med. 167: 1459-1471.
45. Reyrat J.M., Berthet F.X., Gicquel B., (1995), The urease locus of Mycobacterium tuberculosis and its utilization for the demonstration of allelic exchange in Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guerin. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92(19): 8768-72.
46. Roche, P.W., Triccas, J.A., and Winter, N. (1995), BCG vaccination against tuberculosis: past disappointments and future hopes, Trends Microbiol. 3: 397-401.
47. Russell, D.G. (1995), Mycobacterium and Leishmania: stowaways in the endosomal
network. Trends in Cell Biology 5: 125-128.
48. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989), Molecular cloning: a laboratory
manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.
49. Schoel, B., Welzel, M., and Kaufmann, S.H.E. (1994), Hydrophobic interaction chromatography for the purification of cytolytic bacterial toxins, J. ChromatographyA 667: 131-139.
50. Sorensen, A.L., Nagai, S., Houen, G., Andersen, P. and Andersen, A.B. (1995), Purification and characterization of a low-molecular-mass-T-cell antigen secreted by Mycobacterium
tuberculosis, Infect. Immun. 63: 1710.
51. Stover, C.K., Bansal, G.P., Hanson, M.S. Burlein, J.E., Palaszynski, S.R., Young, J.F.,
Koenig, S., Young, D.B., Sadziene, A., Barbour, A.G. (1993), Protective immunity elicited by
recombinant Bacille Calmette Guerin (BCG) expressing outer surface protein A (OspA) lipoprotein: A candidate Iyme disease vaccine, J. Exp. Med. 178: 197-209.
52. Stover, C.K., de la Cruz, V.F., Fuerst, T.R., Burlein, J.E., Benson, LA, Bennett, L.T.,
Bansal, G.P., Young, J.F., Lee, M.H., Hatfull, G.F., Snapper, S.B., Barletta, R.G., Jacobs, W.R., Jr.,
and Bloom, B.R. (1991), Newuse of BCG for recombinant vaccines, Nature 351: 456-460.
53. Sturgill-Koszycki, S., Schlesinger, P.H., Chakraborty, P., Haddix, P.L., Collins, H.L,
Fok, A.K., Alien, R.D., Gluck, S.L, Heuser, J. and Russell, D.G. (1994), Lack of acidification in
Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase, Science
263: 678-681.
54. Towbin, H., Staehelin, T., and Gordon, J. (1979), Electrophoretic transfer of proteins
from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 76: 4350-4354.
55. Tsuchiya, S., Kobayashi, Y., Goto, Y., Okumura, H., Nakae, S., Koirno, T., and Tada, K.
(1982), Induction of maturation in cultured human monocytic leukemia cells by a phorbol
diester, CancerRes. 42: 1530-1536.
56. Tweten, R.K. (1995), Pore-forming toxins of gram-positive bacteria, in Virulence Mechanisms of Bacterial Pathogens, J.A. Roth et al. (ed), American Society for Microbiology, Washington, D.C., pp. 207-228.
57. van Elsas, A., van der Burg, S.H., van der Minne, C.E., Borghi, M., Mourer, J.S., Melief,
C.J.M. and Schrier, P.I. (1996), Peptide-pulsed dendritic cells induce tumoricidal cytotoxic T
lymphocytes from healthy donors against stably HLA-A*0201-binding peptides from MelanA/MART-I self antigen, Eur. J. Immunol. 26: 1683.
13
BY 15197 C1 2011.12.30
SEQUENCE LISTING
14
BY 15197 C1 2011.12.30
15
BY 15197 C1 2011.12.30
16
BY 15197 C1 2011.12.30
17
BY 15197 C1 2011.12.30
Фиг. 1
18
BY 15197 C1 2011.12.30
Фиг. 2A
Фиг. 2B
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
19
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
416 Кб
Теги
патент, by15197
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа