close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15244

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2011.12.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/68
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИДА ПОДОРЛИКА
(21) Номер заявки: a 20090802
(22) 2009.06.02
(43) 2011.02.28
(71) Заявители: Государственное научно-производственное объединение
"Научно-практический центр Национальной академии наук Беларуси
по биоресурсам"; Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Аксенова Елена Анатольевна; Шимкевич Андрей Михайлович; Домбровский Валерий Чеславович; Никифоров Михаил Ефимович; Давыденко Олег Георгиевич
(BY)
BY 15244 C1 2011.12.30
BY (11) 15244
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатели: Государственное
научно-производственное объединение "Научно-практический центр
Национальной академии наук Беларуси по биоресурсам"; Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) АКСЕНОВА Е.А. и др. Изучение и
охрана большого и малого подорликов
в Северной Евразии: Материалы V
международной конференции по хищным птицам Северной Евразии. - Иваново, 2008. - С. 18-25.
VÄLI Ü.J. et al. // Ornithol. - 2004. V. 145. - P. 256-263.
HELBIG A.J. et al. // Molecular Rhylogenetics and Evolution. - 2005. - V. 35. P. 147-164.
(57)
Способ определения вида подорлика, заключающийся в том, что выделяют митохондриальную ДНК исследуемого подорлика и проводят ПЦР-ПДРФ анализ, в котором используют прямой праймер 5'CAC CCT CAC TCG TTT CTT C3' и обратный праймер 5'CGT
ATG CAA ATA GGA AGT ATC3', полученные ампликоны обрабатывают эндонуклеазой
AluI и при детекции фрагмента длиной 317 п.о. вид подорлика определяют как Aquila
pomarina, а при детекции фрагментов длиной 203 и 114 п.о. - как Aquila clanga.
Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в популяционных исследованиях редких биологических видов.
Известны способы генетических популяционных исследований, где в качестве генетических маркеров используют морфологические (фенотипические) признаки [1]. Однако
количество информативных маркеров этого типа ограничено. Кроме того, морфологические признаки могут иметь сложный характер наследования и часто зависят от условий
внешней среды.
Развитие молекулярно-генетических методов анализа, основанных на полимеразной
цепной реакции (ПЦР), позволило разработать новые маркерные системы, обеспечивающие определение генотипов биологических организмов непосредственно на уровне генетического материала клетки (на уровне ДНК), сократить время анализа и повысить его
точность.
BY 15244 C1 2011.12.30
Большой и малый подорлики являются близкородственными видами, дивергенция
которых произошла около 1 млн. лет назад. В Беларуси ареалы обоих видов полностью
перекрываются. Морфологически эти виды очень сходны и, по мнению многих исследователей, различение малого и большого подорлика в полевых условиях представляет
большую сложность, а иногда практически невозможно. Диагностические признаки малого и большого подорликов до сих пор являются предметом научных дискуссий [2]. В
настоящее время в зоне перекрывания ареалов малого и большого подорликов, в Польше,
Белоруссии и Прибалтике, отмечается высокая частота образования смешанных пар и появление гибридных птиц [3]. Применение молекулярно-генетических методов для видовой
диагностики позволяет избежать субъективных подходов и упрощает процедуру определения фенотипически близких видов.
Исследователями используется несколько маркерных участков для филогенетических
и популяционных исследований рода Aquila. Проводится сравнительное изучение как всей
последовательности митохондриального генома, так и его различных районов: генов цитохрома b, субъединиц NADH дегидрогеназы, цитохром-оксидантного комплекса, генов
тРНК, а также гипервариабельного района I Д-петли (CR) и псевдовариабельного района
ΨCR [4]. Для популяционных исследований также используются маркерные районы генома ядра, включающие в себя такие гены, как RAG-1 кодирующий район белка активатора рекомбинации, третий интрон гена лактат дегидрогеназы LDH, интроны гена
аденилаткиназы, 7-й интрон гена b-фибриногена [5]. Молекулярно-генетический идентификационный анализ позволяет исследовать особые участки ДНК, строго специфичные
для каждого индивидуума. В основном изучается первичная последовательность всех вышеперечисленных генов, что требует существенных затрат и соответствующего оборудования.
Наиболее близким по технической сущности является способ оценки генетического
потенциала КРС путем ДНК-тестирования (ПЦР-ПДРФ метод) генотипов животных по
RsaI-маркеру гена пролактина и AluI-маркеру гена гормона роста и выявлении сопряженных генотипов по локусам пролактина и гормона роста, определяющих повышенное или
пониженное содержание жира и белка в молоке, согласно разработанному перечню генотипов. Способ позволяет осуществлять подбор пар в селекционной работе по улучшению
молочных пород [6].
Задача изобретения - создание эффективного и недорогого способа идентификации
таких родственных биологических видов, какими являются Aguila clanga и Aguila pomarina.
Поставленная задача решается предлагаемым способом видовой идентификации
большого подорлика Aguila clanga и малого подорлика Aguila pomarina, путем ПЦР-ПДРФ
анализа района гена цитохрома b (cytb) митохондриальной ДНК.
ПЦР-ПДРФ анализ района гена цитохрома b (cytb) митохондриальной ДНК, предусматривающий выделение ДНК исследуемого организма, проведение полимеразной цепной реакции с использованием праймеров к данному локусу: прямой CytbF 5'CAC CCT
CAC TCG TTT CTT C3' и обратный CytbR 5'CGT ATG CAA ATA GGA AGT ATC3' с последующей эндонуклеазной обработкой ферментом AluI (Fermentas, Литва). Видовую
принадлежность исследуемых организмов определяют путем сравнения полиморфизма
длин рестрикционных фрагменов. Фрагмент амплификации длиной 317 п.о. содержал сайт
узнавания эндонуклеазой AluI у вида Aquila clanga, и детектировались фрагменты длиной
203 и 114 п.о. Тогда как для вида Aquila pomarina после эндонуклеазной обработки AluI
сохранялся фрагмент длиной 317 п.о. (фиг. 1).
Способ осуществляют следующим образом.
Способ основан на ПЦР с последующим рестрикционным анализом продуктов амплификации (метод ПЦР-ПДРФ) и включает в себя выделение ДНК из образцов биологи-
2
BY 15244 C1 2011.12.30
ческого материала, ПЦР-ПДРФ анализ, предусматривающий амплификацию локуса геномной ДНК митохондрий при помощи разработанных ДНК-праймеров.
Реакционная смесь для амплификации объемом 15 мкл содержала: 1x ПЦР-буфер
фирмы Дилат (г. Москва); по 0,25 mM каждого из dNTP; 2,5 mM MgCl2; по 5 pmol/µl прямого и обратного праймеров, 1 U Taq ДНК-полимеразы (Диалат), 1 мкл ДНК. Полимеразная цепная реакция проводилась на амплификаторах GeneAmp PCR System 2700 (Applied
Biosystems) и MyCycler (BIORAD). Амплификация проводилась при следующих условиях:
предварительная денатурация 94° - 3 мин, затем 35 циклов: 94° - 20 сек, 58° - 20 сек, 72° 40 сек и заключительная элонгация при 72° - 4 мин. После ПЦР-реакции полученные ампликоны подвергались обработке эндонуклеазой AluI при 37 °С в течение 16 часов. Разделение ПЦР-ПДРФ фрагментов проводили в 6 %-ном полиакриламидном геле в 1x TBE
буфере, окрашивали в растворе этидиум бромида, затем полученную электрофореграмму
фотографировали цифровой камерой Nikon 2100 в УФ-свете.
Пример выполнения способа.
Предложенный способ был применен для видовой идентификации образцов крови и
перьев подорликов, собранных у гнезд в течение гнездового сезона 2007 г. в Беларуси [7].
Первоначально, для проверки разработанного маркера, выборочно мы проанализировали
образцы, взятые нами для анализа в 2006 году и типированные с помощью ПЦР-ПДРФ
анализа гипервариабельного района Д-петли.
Результаты анализа по двум районам мт ДНК совпали, дальнейшую работу мы проводили на новых образцах 2007 года. Полученные результаты показали, что предложенные
способы дополняют друг друга и позволяют проводить более корректную видовую дифференциацию большого подорлика Aguila clanga и малого подорлика Aguila pomarina.
Источники информации:
1. Seibold I. et al. Eagles studies. - Berlin, London & Paris, 1996. - P. 1-15.
2. Домбровский В.Ч. // Орнитология. - 2007. - Т.33. - С. 29-41.
3. Väli Ü.J. et al. // Ornithol. - 2004. - V. 145. - Р. 256-263.
4. Väli Ü.J. // Molecular Ecology. - 2002. - V. 11. - P. 2189-2194.
5. Helbig A.J. et al. // Molecular Phylogenetics and Evolution. - 2005. - V. 35. - P. 147-164.
6. Заявка на патент РФ 2006119781/13. Способ определения генетического потенциала
крупного рогатого скота по качеству молока. 2006.06.06.
7. Аксенова Е.А. и др. Изучение и охрана большого и малого подорликов в Северной
Евразии: Материалы V международной конференции по хищным птицам Северной Евразии. - Иваново, 2008. - С. 18-25.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
238 Кб
Теги
патент, by15244
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа