close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15394

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.02.28
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/577 (2006.01)
C 07K 14/435 (2006.01)
C 07K 16/18 (2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ
В БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ЧЕЛОВЕКА РАСТВОРИМОГО
РЕЦЕПТОРА ИНТЕРЛЕЙКИНА-8 ВТОРОГО ТИПА
(21) Номер заявки: a 20091015
(22) 2009.07.07
(43) 2011.02.28
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр гематологии и
трансфузиологии" Министерства
здравоохранения Республики Беларусь (BY)
(72) Авторы: Акалович Светлана Тадеушевна; Котлинский Константин
Вячеславович; Котлинская Юлия
Владимировна; Дорошенко Татьяна
Михайловна; Войтенок Николай
Николаевич (BY)
BY 15394 C1 2012.02.28
BY (11) 15394
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр гематологии и
трансфузиологии"
Министерства
здравоохранения Республики Беларусь
(BY)
(56) HSIEH S.-C. et al. Rheumatology. - 2008. No.47. - P. 150-157.
ГУМЕННИКОВА Ю.В. Сборник работ 62-й научной конференции студентов и аспирантов Белгосуниверситета. - Минск, 2005. - С. 87-89.
(57)
Способ определения концентрации в биологической жидкости человека растворимого
рецептора интерлейкина-8 второго типа CXCR2, заключающийся в том, что образец биологической жидкости объемом Vисх концентрируют, разводят фосфатно-солевым буфером, после чего проводят конкурентный иммуноферментный анализ разведенного
образца, при этом инкубируют разведенный образец с синтетическим пептидом MEDFNMESDSFEDFWKGEDLC, аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности
N-конца рецептора CXCR2 человека от
аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20 и дополнительно содержит
модифицированный биотином по SH-группе остаток цистеина на C-конце, и моноклональными мышиными антителами A, специфичными к N-концевой части рецептора
CXCR2, проводят реакцию с тетраметилбензидином, измеряют оптическую плотность
продукта реакции, по предварительно построенной калибровочной кривой вычисляют соответствующую данной оптической плотности концентрацию синтетического пептида,
используемого в качестве стандарта, и определяют концентрацию C растворимого рецептора CXCR2 в биологической жидкости по формуле:
C = 2abVконц/Vисх,
где a - концентрация синтетического пептида, используемого в качестве стандарта;
b - степень разведения концентрированного образца биологической жидкости, взятого
для конкурентного иммуноферментного анализа;
Vконц - объем концентрированного образца биологической жидкости,
BY 15394 C1 2012.02.28
причем в качестве стандарта используют синтетический пептид MEDFNMESDSFEDFWKGEDLC,
аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности N-конца рецептора CXCR2 человека от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20 и содержит остаток цистеина на C-конце.
Изобретение относится к области молекулярной иммунологии и может служить основой для создания нового диагностикума для количественного определения растворимого рецептора интерлейкина-8 второго типа CXCR2 (pCXCR2) в биологической
жидкости человека, который отщепляется с поверхности нейтрофильных лейкоцитов
при их активации, что может служить маркером вовлечения нейтрофильных лейкоцитов
в патологические или физиологические процессы.
Нейтрофильные лейкоциты (НЛ) крови играют центральную роль в антибактериальной защите организма. Антибактериальная функция НЛ связана с их миграцией из кровотока в ткани под действием специализированных хемотактических белков, α-хемокинов.
Интерлейкин-8 (ИЛ-8) является основным хемотактическим фактором для НЛ при воспалении [1]. Свое действие ИЛ-8 оказывает через мембранные рецепторы CXCR1 и CXCR2,
принадлежащие к "серпентиновому" семейству рецепторов, связанных с G-белками.
CXCR1 и CXCR2 имеют размер пептидных цепей около 40 кДа, содержат семь трансмембранных петель, внеклеточный N-концевой домен, участвующий в связывании лиганда, и
внутриклеточный C-концевой участок, ответственный за передачу сигнала внутрь клетки
[1, 2]. CXCR1 связывает с высокой аффинностью только ИЛ-8, а CXCR2 реагирует на все
основные α-хемокины, ИЛ-8, NAP-2, GRO, ENA-78 и GCP-2 [1]. Изменение количества
рецепторов на поверхности клеток является эффективным способом регуляции их способности отвечать на лиганды. Показано, что воспалительные факторы, такие как фактор
некроза опухолей-α (ФНО) и бактериальный липополисахарид, подавляют экспрессию
рецепторов ИЛ-8 и реакцию НЛ на ИЛ-8 [3, 4, 5]. Нами ранее показано, что протеолиз с
участием клеточно-связанных металлопротеаз является основным механизмом подавления экспрессии рецепторов ИЛ-8 на НЛ под влиянием фагоцитарных стимулов [6]. Кроме
того, опубликованы работы, в которых показано, что падение экспрессии CXCR2 на НЛ
под действием ФНО сопровождается образованием 40 кДа гликозилированной растворимой формы CXCR2 [7, 8].
Известен способ определения pCXCR2, основанный на использовании вестернблоттинга и иммуно-слот-блот анализа, с помощью которых Asagoe К. и другие впервые
описали высвобождение pCXCR2 в супернатант при активации нейтрофилов [4]. Для выявления pCXCR2 нейтрофилы человека преинкубировали с поликлональными кроличьими анти-CXCR2 антителами и затем активировали в присутствии ФНО, полученный
супернатант анализировали в вестерн-блоттинге. Отличие в количестве выявляемых на
нитроцеллюлозной мембране кроличьих антител по сравнению супернатантом неактивированных клеток было идентифицировано как выявление продукта протеолитического
отщепления рецептора CXCR2 с поверхности клетки. В иммуно-слот-блот анализе авторам удалось показать, что количество выявляемых поликлональных кроличьих антиCXCR2 антител в супернатанте активированных ФНО нейтрофилов вдвое выше по сравнению с контрольными клетками.
Недостатком описанного способа определения pCXCR2 является как отсутствие результатов взаимодействия контрольных неспецифических кроличьих антител (изотипконтроль) в обоих вариантах определения, так и отсутствие прямого доказательства выявления pCXCR2 на нитроцеллюлозной мембране. Вывод о наличии продукта отщепления
CXCR2 делается на основании определения кроличьих антител и нет никаких данных о
массе выделяемой молекулы pCXCR2. Более того, в данном сообщении использовались
поликлональные кроличьи антитела, полученные к экстраклеточным доменам рецептора
2
BY 15394 C1 2012.02.28
CXCR2 человека, что не позволяет точно идентифицировать, какой именно из экстраклеточных доменов переходит в растворимую форму.
Наиболее чувствительным способом определения растворимых белков является тестсистема с использованием моноклональных антител, специфичных к определяемому белку, на основе принципа конкурентного радиоиммунного или иммуноферментного анализа
[9]. Эти тест-системы основаны на конкуренции определяемого белка и его меченого аналога за центры связывания с иммобилизованными твердофазными антителами.
Недостатком радиоиммунного анализа является необходимость введения радиоактивного йода в состав лиганда. Если в составе лиганда присутствуют аминокислотные остатки триптофан и метионин, то при мечении радиоактивным йодом возможно их окисление
и последующие разрушение лиганда [10]. В составе pCXCR2 содержится два остатка метионина и один остаток триптофана, что делает невозможным использование радиоактивного йода для мечения синтетических аналогов pCXCR2.
Наиболее близким к заявляемому является способ определения pCXCR2, предложенный S.-C. Hsieh и другими [11]. Для определения pCXCR2 в супернатанте НЛ использовали "сэндвич" вариант иммуноферментного анализа (ИФА), основанного на использовании
моноклональных мышиных антител (E-2, Santa Cruz Biotechnology), распознающих аминокислотную последовательность 1-19 N-конца рецептора CXCR2 человека, и кроличьих
поликлональных антител (АВсаm), специфичных к фрагменту 18-39 аминокислотной последовательности N-конца рецептора CXCR2 человека. Представленные результаты определения pCXCR2 свидетельствуют о наличии достоверного уменьшения количества
выявляемого pCXCR2 в супернатанте при активации ИЛ-8 НЛ, выделенных из крови
больных системной красной волчанкой, по сравнению с НЛ здоровых доноров.
Недостатком известного способа является длительность выполнения и невысокие
функциональные возможности, так как он применим только для количественного определения в супернатанте клеток с высокой концентрацией pCXCR2.
Известный способ не может быть принят в качестве прототипа, так как не имеет общих признаков с заявляемым.
Анализ опубликованных данных показал, что на сегодняшний день не описан способ
прямого определения pCXCR2, применимый для биологических жидкостей организма.
Задача заявляемого изобретения заключается в расширении возможностей способа
определения pCXCR2, включающего определение pCXCR2 в образцах биологических
жидкостей человека, повышении точности за счет исключения влияния на определение
pCXCR2 низкомолекулярных примесей и сокращении времени его проведения.
Поставленная задача достигается за счет того, что образец биологической жидкости
объемом Vисх концентрируют, разводят фосфатно-солевым буфером, после чего проводят
конкурентный иммуноферментный анализ разведенного образца, при этом инкубируют разведенный образец с синтетическим пептидом MEDFNMESDSFEDFWKGEDLC, аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности Nконца рецептора CXCR2 человека от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного
остатка 20 и дополнительно содержит модифицированный биотином по SH-группе остаток
цистеина на С-конце, и моноклональными мышиными антителами А, специфичными к Nконцевой части рецептора CXCR2, проводят реакцию с тетраметилбензидином, измеряют
оптическую плотность продукта реакции, по предварительно построенной калибровочной
кривой вычисляют соответствующую данной оптической плотности концентрацию синтетического пептида, используемого в качестве стандарта, и определяют концентрацию С
растворимого рецептора CXCR2 в биологической жидкости по формуле:
C = 2abVконц/Vисх,
где a - концентрация синтетического пептида, используемого в качестве стандарта;
b - степень разведения концентрированного образца биологической жидкости, взятого
для конкурентного иммуноферментного анализа;
3
BY 15394 C1 2012.02.28
Vконц - объем концентрированного образца биологической жидкости,
причем в качестве стандарта используют синтетический пептид MEDFNMESDSFEDFWKGEDLC, аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности
N-конца рецептора CXCR2 человека от
аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20 и содержит остаток цистеина
на C-конце.
Сущность определения концентрации данного вещества в образце биологической
жидкости (например, в моче) состоит в следующем.
Образец мочи (500 мкл), предварительно отцентрифугированной (400 g, 10 мин), помещают в концентратор Микрокон-10 (Millipore), характеризующийся способностью концентрировать белки с молекулярной массой от 10 Да и выше, и центрифугируют при
10000 g в течение 30-35 мин. Для перевода концентрата белковой фракции в ФСБ, необходимый для дальнейшего анализа образца, в концентратор дважды добавляют по 450500 мкл ФСБ и дважды центрифугируют при 10000 g в течение 30-35 мин. Для сбора
сконцентрированного раствора белка вставку концентратора с мембраной вставляют в новую пробирку вверх мембраной и центрифугируют при 1000 g в течение 1-2 мин. Объем
полученного концентрата должен составлять 25-100 мкл. Концентрат мочи можно хранить
при -20 °C, повторное замораживание/оттаивание нежелательно. Для определения концентрации pCXCR2 подготовленный концентрат мочи проверяли в разработанном и заявляемом нами конкурентном иммуноферментном анализе (кИФА), основанном на принципе
конкуренции немеченого синтетического пептида, содержащего 20 аминокислотных
остатков, идентичных аминокислотной последовательности N-конца рецептора CXCR2
человека от аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20, и аминокислотный остаток цистеина на C-конце (MEDFNMESDSFEDFWKGEDLC, 1-20-C), с модифицированным биотином производным этого же синтетического пептида (1-20-C-биотин) за
специфические MKA А, иммобилизованные на твердой фазе. Для выполнения кИФА полистирольные 96-луночные планшеты для ИФА ("Costar") заполняют по 100 мкл на лунку
0,1 M карбонатным буфером, pH 9,6, содержащим 3 мкг/мл MKA А, и инкубируют 12-18 ч
при + 4 °C или в течение 2 ч при + 37 °C. После трехкратной отмывки (здесь и далее по
200 мкл на лунку) ФСБ, содержащим 0,05 % Твин-20 (ФСБ-Тв), в лунки вносят в качестве
стандарта двукратные разведения пептида 1-20-С (от 200 до 3,1 нг/мл) в 50 мкл ФСБ-Тв,
содержащем 0,5 % бычьего сывороточного альбумина (ФСБ-Тв-БСА), разведения (1:6,
1:10, 1:18 или другое) опытных образцов в 50 мкл ФСБ-Тв-БСА, и в две контрольные лунки вносят 50 мкл ФСБ-Тв-БСА. После инкубации в течение 15 мин при встряхивании при
18-20 °C во все лунки вносят по 50 мкл ФСБ-Тв-БСА, содержащего биотинилированный
пептид 1-20-С-биотин, и инкубируют в течение 35 мин в том же режиме (биотинилированный пептид 1-20-C-биотин используют в минимальном разведении, достаточном для
достижения в контрольных лунках 2 единиц оптической плотности в течение 15-30 мин
при инкубации с субстратным буфером с тетраметилбензидином). После трехкратной отмывки лунки планшета инкубируют со 100 мкл раствора конъюгата авидин-пероксидазы
(1:2000, "Zymed") в ФСБ-Тв-БСА в течение 30 мин при встряхивании при 18-20 °C, четыре раза промывают лунки ФСБ-Тв и проявляют ферментативную реакцию, заполняя лунки
микропланшет субстратным буфером с тетраметилбензидином. После инкубации в течение 10 мин в темноте реакцию останавливают 5 % раствором серной кислоты. Учет результатов проводят на многоканальном спектрофотометре для микропланшет (например,
"ELISA Processor") при длине волны 450 нм. После построения калибровочной кривой
по измеренной оптической плотности (ОП) определяют концентрацию pCXCR2 в анализируемом концентрате мочи. На чертеже представлена калибровочная кривая кИ-ФА по
приведенному примеру. Концентрацию в исходном образце мочи рассчитывают по формуле, предложенной нами:
С = 2abVконц/Vисх,
4
BY 15394 C1 2012.02.28
где a - концентрация синтетического пептида, используемого в качестве стандарта;
b - степень разведения концентрированного образца биологической жидкости, взятого
для конкурентного иммуноферментного анализа;
Vконц - объем концентрированного образца биологической жидкости,
причем в качестве стандарта используют синтетический пептид MEDFNMESDSFEDFWKGEDLC, аминокислотная последовательность которого идентична аминокислотной последовательности
N-конца рецептора CXCR2 человека от
аминокислотного остатка 1 до аминокислотного остатка 20 и содержит остаток цистеина
на C-конце.
Чувствительность кИФА составляет 1,5 нг/мл. Чувствительность метода определения
pCXCR2 при вышеописанном исполнении составляет 5 нг/мл мочи. В случае очень низкого содержания pCXCR2 (< 5нг/мл) в тестируемом образце необходимо внести следующие
изменения в этапы выполнения: на один концентратор нанести больший объем мочи
(например, 2 раза по 500 мкл), объем концентрата уменьшить до 20-30 мкл, увеличив время концентрирования образца, и уменьшить разведение полученного концентрата до 1:21:3. Все внесенные изменения учитывают при расчете концентрации pCXCR2 в исходном
образце.
Предложенный способ позволил определить концентрацию pCXCR2 в образцах мочи
здоровых доноров (20 доноров крови, 10 мужчин и 10 женщин, средний возраст
39,3 ± 11 лет (здесь и далее указано среднее значение ± стандартное отклонение). Показано, что в норме у взрослого человека (старше 18 лет) концентрация pCXCR2 в моче составляет 29,7 ± 7,8 нг/мл (n = 20, минимальное значение 16,5 нг/мл, максимальное - 42,3
нг/мл). Проведенное нами предварительное изучение уровней pCXCR2 в моче больных с
острым послеоперационным перитонитом позволило выявить значимое отличие концентрации pCXCR2 от наблюдаемой у здоровых доноров [7]. Полученные данные указывают
на возможную диагностическую и прогностическую значимость определения pCXCR2
при различных патологических состояниях и перспективность дальнейших исследований.
В образце биологической жидкости с высоким содержанием растворимого рецептора
этап концентрирования исключают.
Для определения pCXCR2 в образцах плазмы крови или других средах с высоким содержанием тотального белка этап концентрирования заявляемого способа заменяется на
этап иммуноаффинной сорбции с использованием MKA A, ковалентно связанных с CNBrсефарозой, с последующей элюцией сорбированного антигена и анализа элюата в вышеописанном кИФА.
Заявляемый способ определения pCXCR2 иллюстрируется следующим примером.
Пример.
Донор крови А.И.В., мужчина, 44 года, дата сдачи крови и анализ мочи 29.12.08.
Образец мочи (500 мкл) поместили в концентратор Микрокон-10 и центрифугировали
при 10000 g в течение 30 мин. Для перевода полученного концентрата в ФСБ в концентратор дважды добавили по 450 мкл ФСБ и дважды центрифугировали при 10000 g в течение
30 мин. Для сбора сконцентрированного раствора белка вставку концентратора с мембраной вставили в новую пробирку вверх мембраной и центрифугировали при 1000 g в течение 1 мин, как описано выше. Объем концентрата составил 102 мкл. Концентрат
анализировали в кИФА согласно заявляемому способу. Относительно полученных значений оптической плотности (ОП) в лунках со стандартом построили калибровочную кривую, представленную на чертеже. В дуплете лунок с образцом исследуемого концентрата
мочи значение ОП составило 1,232 единицы, что по калибровочной кривой соответствует
9,113 нг/мл. Подставив все необходимые значения в указанную выше формулу (a = 9,113;
b = 10; Vконц = 0,102 мл, Vисх = 0,5 мл), получаем значение концентрации pCXCR2 в исходном образце мочи 37,0 нг/мл, что соответствует диапазону концентраций pCXCR2 в
моче здоровых доноров. Оставшийся концентрат хранили при -20 °C. Повторное опреде5
BY 15394 C1 2012.02.28
ление концентрации 30.12.08 в том же концентрате позволило выявить 37,0 нг/мл
pCXCR2.
Источники информации:
1. Baggiolini M. Chemokines in pathology and medicine // J. Intern. Med. - 2001. - Vol. 250. P. 91-104.
2. Chuntharapai A. et al. Neutralizing monoclonal antibodies to human IL-8 receptor A map
to the NH2-terminal region of the receptor // J. Immunol. - 1994. - Vol. 152. - P. 1783-1789.
3. Tikhonov I. et al. Down-regulation of CXCRl and CXCR2 expression on human neutrophils upon activation of whole blood by S. aureus is mediated by TNF-α // Clin. Exp. Immunol. 2001. - Vol. 125. - P. 414 - 422.
4. Asagoe K. et al. Down-regulation of CXCR2 expression on human polymorphonuclear
leukocytes by TNF-alpha // J. Immunol. - 1998. - Vol. 160. - P. 4518-4525.
5. Khandaker M.H. et al. Metalloproteinases are involved in lipopolysaccharide- and tumor
necrosis factor-alpha-mediated regulation of CXCRl and CXCR2 chemokine receptor expression
// Blood. - 1999. - Vol. 93. - P. 2173-2185.
6. Doroshenko T. et al. Phagocytosing neutrophils down-regulate the expression of chemokine receptors CXCR1 and CXCR2 // Blood. - 2002. - Vol. 100. - P. 2668-2672.
7. Акалович С.Т. и др. Выявление и иммунохимическая характеристика растворимой
формы рецептора CXCR2 интерлейкина-8 человека // Доклады НАН Беларуси. - 2008. Т. 52. - С. 87-92.
8. Котлинский К.В. и др. Биохимическая характеристика растворимой формы рецептора CXCR2 интерлейкина-8 человека // Известия НАН Беларуси. - 2009. - T. 2. - С. 85-89.
9. Samuel G. et al. Solid-phase radioimmunoassay for human placental lactogen in serum //
Clin Chem. - 1983. - Vol. 29. - P. 168-170.
10. Alexander N.M. Oxidation and oxidative cleavage of tryptophanyl peptide bonds during
iodi-nation // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 1973. - Vol. 18. - P. 614-621.
11. Hsieh S.-C. et al. Abnormal in vitro CXCR2 modulation and defective cationic ion
transporter expression on polymorphonuclear neutrophils responsible for hyporesponsiveness to
IL-8 stimulation in patients with active systemic lupus erythema-tosus // Rheumatology. - 2008. Vol. 47. - P. 150-157.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
121 Кб
Теги
by15394, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа