close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15453

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.02.28
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 30/02 (2006.01)
G 01N 33/04 (2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МЕЛАМИНА
В МОЛОКЕ ИЛИ МОЛОЧНОМ ПРОДУКТЕ
(21) Номер заявки: a 20100197
(22) 2010.02.10
(43) 2011.10.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научно-практический центр гигиены" (BY)
(72) Авторы: Шуляковская Ольга Васильевна; Филонов Валерий Петрович;
Белышева Людмила Леонидовна; Полянских Елена Ильинична (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
(56) МУК 4.1.2420-08. Методические указания. Определение меламина в молоке
и молочных продуктах. - Минск, 2008.
ZOU Y. et al. LC/GC chromatographyonline.com, FindAnalytichem, Jun. 1, 2009,
[http://chromatographyonline.findanalyti
chem.com/lcgc/Trace-Level-Analysis-ofMelamine-in-Milk-Products-/Article
Standard/Article/detail/611922].
BY 15453 C1 2012.02.28
BY (11) 15453
(13) C1
(19)
LUAN W. et al. LC/GC chromatographyonline.com, FindAnalytichem, Mar. 2, 2009
[http://chromatographyonline.findanalytichem.
com/lcgc/App+Notes+Food%2fBeverage/
Diversity-of-Methodologies-for-MelamineAnalysis-i/ArticleStandard/Article/detail/
627631].
JIANG W. et al. LC/GC chromatographyonline.com, FindAnalytichem, Feb. 1, 2010
[http://chromatographyonline.findanalytichem.
com/lcgc/Articles/The-Analysis-of-Melaminein-Milk-Powder-Using-HILI/ArticleStandard/
Article/detail/655595?ref=25].
AN R. Agilent in pharmaceutical analysis,
Mar. 2009, is.26, [http://www.chem.agilent.
com/en-US/Newsletters/pharmaanalysis/
issue26 /pages/PN_26_melamine.aspx].
FREMLIN L.J. et al. LC/GC chromatographyonline.com, FindAnalytichem, Feb. 1, 2009
[http://chromatographyonline.findanalytichem.
com/lcgc/Articles/Melamine-and-CyanuricAcid-Detection-in-5-Min-Usin/ArticleStandard/
Article/detail/581390].
(57)
Способ определения меламина в молоке или молочном продукте, включающий экстракцию меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане, очистку и концентрирование экстракта с последующим количественным определением содержания
меламина в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет
массовой доли меламина в молоке или молочном продукте, отличающийся тем, что экстракцию меламина проводят смесью 5 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты и ацетонитрила в течение 10 мин при температуре 50 °С в ультразвуковой бане, а очистку и
концентрирование экстракта осуществляют с помощью твердофазной экстракции.
Изобретение относится к медицине, к разделу лабораторной диагностики, а также к
пищевой промышленности.
Известен способ определения меламина в молоке и молочных продуктах, основанный
на экстракции меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане с последу-
BY 15453 C1 2012.02.28
ющим количественным определением содержания меламина методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии [1].
Способ является прототипом по отношению к заявляемому.
Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются экстракция меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане с последующим количественным определением содержания меламина в экстракте с помощью высокоэффективной
жидкостной хроматографии.
Однако указанный способ не позволяет количественно определять меламин с высокой
чувствительностью и точностью из-за низкой специфичности используемых растворителей.
Задачей заявляемого способа является повышение чувствительности и точности определения.
Поставленная задача решается следующим образом.
Предложен способ определения меламина в молоке или молочном продукте, включающий экстракцию меламина органическим растворителем в ультразвуковой бане,
очистку и концентрирование экстракта с последующим количественным определением
содержания меламина в экстракте методом высокоэффективной жидкостной хроматографии и расчет массовой доли меламина в молоке или молочном продукте, причем экстракцию меламина проводят смесью 5 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты и ацетонитрила в течение 10 мин при температуре 50 °С в ультразвуковой бане, а очистку и
концентрирование экстракта осуществляют с помощью твердофазной экстракции.
Указанные условия экстракции, очистки и концентрирования позволяют достичь максимальной чувствительности (предел обнаружения меламина увеличивается в 5 раз) и извлечения меламина из молока и молочных продуктов.
Пример. Определение меламина в молоке и молочном продукте
1. Экстракция
Навеску исследуемого образца 2,00 ± 0,01 г помещают в пробирку для центрифугирования вместимостью 50 см3, добавляют 5,0 см3 5 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и 2 см3 ацетонитрила. Пробирку плотно закрывают, встряхивают и помещают на
10 мин в ультразвуковую баню при температуре 50 °С. Затем пробирку центрифугируют
10 мин со скоростью 4000 об/мин. Отбирают верхний слой в отдельную пробирку, а к
осадку добавляют еще 5,0 см3 5 %-ного раствора ТХУ и 1,5 см3 ацетонитрила, встряхивают, помещают в ультразвуковую баню на 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при тех
же условиях. Отбирают верхний слой и присоединяют к первой порции. К осадку в третий
раз прибавляют 5 см3 5 %-ного раствора ТХУ и 1,5 см3 ацетонитрила, встряхивают, помещают в ультразвуковую баню на 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при тех же условиях. Отбирают верхний слой и присоединяют к первой и второй порциям.
Объединенный экстракт фильтруют в мерную колбу вместимостью 25 см3 через
бумажный фильтр "синяя лента", который необходимо предварительно смочить 1 см3
5 %-ного раствора ТХУ. Объем доводят до метки 5 %-ным раствором ТХУ.
2. Очистка и концентрирование экстракта
Для проведения твердофазной экстракции отбирают 5 см3 экстракта, полученного по
п. 1, в пробирку вместимостью 10 см3, добавляют 5 см3 дистиллированной воды, раствор
тщательно перемешивают.
При содержании жира в образце более 10 % перед проведением твердофазной экстракции проводят обезжиривание экстракта (п. 1). Берут 25 см3 экстракта, помещают в делительную воронку на 100 см3, добавляют 25 см3 гексана, встряхивают в течение 1 мин и
оставляют до полного разделения слоев. Затем отбирают 5 см3 нижнего слоя в пробирку
для проведения твердофазной экстракции, добавляют 5 см3 дистиллированной воды, раствор тщательно перемешивают.
2
BY 15453 C1 2012.02.28
Через подготовленный* предварительно картридж пропускают 10 см3 экстракта из
пробирки (п. 2). Затем промывают картридж 5 см3 дистиллированной воды, а затем 5 см3
метанола. Высушивают картридж под вакуумом в течение 1-2 мин, а затем элюируют меламин 5 см3 1,25 %-ного раствора аммиака в метаноле со скоростью элюирования 0,51,0 см3/мин.
Полученный элюат упаривают досуха в этой же пробирке на роторном испарителе при
температуре 50 °С. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы, фильтруют через
мембранный фильтр Millipore с размером пор 0,45 мкм.
* Подготовка картриджа:
Устанавливают картридж (Agilent SampliQ SCX; 3 ml/60 mg кат. № 5982-3236) в установку для твердофазной экстракции, включают насос, с помощью крана и секундомера
устанавливают скорость элюирования метанола 0,5-1,0 см3/мин. Через сорбент пропускают 5 см3 метанола, а затем 6 см3 дистиллированной воды.
3. Приготовление растворов
3.1. Приготовление 1 M раствора NaOH
Взвешивают (4,00 ± 0,01) г NaOH, помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3,
добавляют 50 см3 дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения щелочи, охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до метки.
Раствор хранят в склянке, закрытой притертой полимерной пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение 1 года.
3.2. Приготовление 5,0 %-ного раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ)
В коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают (5,000 ± 0,001) г ТХУ и добавляют (95,000 ± 0,001) г дистиллированной воды, перемешивают.
Раствор хранят в склянке с притертой пробкой при комнатной температуре.
Раствор стабилен в течение 6 мес.
3.3. Приготовление 1,25 %-ного раствора аммиака в метаноле
В коническую колбу вместимостью 250 см3 помещают (5,000 ± 0,001) г аммиака водного и добавляют (95,000 ± 0,001) г метанола, перемешивают. Раствор хранят в склянке с
притертой пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение 1 мес.
3.4. Приготовление подвижной фазы
В плоскодонный стакан вместимостью 1000 см3 помещают (2,343 ± 0,001) г октансульфоната натрия и (1,924 ± 0,001) г лимонной кислоты, растворяют в 850 см3 дистиллированной воды, с помощью 1 M раствора NaOH доводят до pH = 3,0. Полученный раствор
помещают в мерную колбу вместимостью 1000 см3 и доводят объем дистиллированной
водой до метки. К 920 см3 полученного раствора добавляют 80 см3 ацетонитрила. Подвижную фазу фильтруют через мембранный целлюлозный фильтр. Раствор хранят в
склянке из темного стекла с завинчивающейся пробкой при комнатной температуре. Раствор стабилен в течение 1 мес.
3.5. Приготовление стандартных растворов меламина
3.5.1. Приготовление основного стандартного раствора меламина концентрацией
500 мкг/см3
Навеску 0,1000 ± 0,0001 г кристаллического меламина вносят в мерную колбу вместимостью 200 см3, добавляют 100 см3 метанола и помещают в ультразвуковую баню на
15 мин при комнатной температуре, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Раствор
стабилен в течение 3 месяцев.
3.5.2. Приготовление стандартного раствора меламина концентрацией 100 мкг/см3
(раствор A)
Отбирают 10,0 см3 основного стандартного раствора меламина, приготовленного по
п. 3.5.1, и помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, объем доводят до метки подвижной фазой. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике.
Раствор стабилен в течение 7 суток.
3
BY 15453 C1 2012.02.28
3.5.3. Приготовление стандартного раствора меламина концентрацией 10 мкг/см3 (раствор Б)
Отбирают 10,0 см3 стандартного раствора меламина (раствор A), приготовленного по
п. 3.5.2, и помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, объем доводят до метки подвижной фазой. Раствор хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике.
Раствор стабилен в течение 7 суток.
3.5.4. Приготовление градуировочных растворов меламина
Градуировочные растворы меламина концентрацией 0,2, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 мкг/см3 готовят по схеме, представленной в табл. 1. Аликвотные части стандартных растворов A и Б
меламина переносят в мерные колбы и доводят подвижной фазой до метки при 20 ± 2 °С.
Таблица 1
Схема приготовления градуировочных растворов меламина
Объем аликвотной части
Концентрация меламина
№ градуировочОбъем мерной
стандартного раствора
в градуировочном
ного раствора
колбы, см3
меламина, см3
растворе, мкг/см3
1
5,0 (раствор A)
100
5,0
2
2,5 (раствор A)
100
2,5
3
5,0 (раствор Б)
50
1,0
4
5,0 (раствор Б)
100
0,5
5
2,0 (раствор Б)
100
0,2
Градуировочные растворы хранят в стеклянной посуде с притертой пробкой в холодильнике. Растворы стабильны в течение 7 суток.
4. Установление градуировочной характеристики
Полученные по п. 3.5.4 градуировочные растворы меламина хроматографируют,
начиная с самой низкой концентрации.
условия хроматографирования:
объем вводимой пробы
20 мкл
скорость подачи подвижной фазы
1,5 см3/мин
температура термостата колонки
30 °С
длина волны
240 нм
ширина оптической щели
16 нм
ширина пика (Responsetime)
>0,1 мин
Slit
4 нм.
Каждый градуировочный раствор хроматографируют не менее 2 раз, принимая за результат измерения среднее арифметическое параллельных измерений.
5. Построение градуировочного графика
Для построения градуировочного графика устанавливают зависимость площади пиков
от соответствующей концентрации меламина в градуировочном растворе. Прямая градуировочного графика должна проходить через начало координат и определяться функциональной зависимостью:
Y = bX,
(1)
где Y - площадь пика меламина;
X - концентрация меламина в градуировочном растворе;
b - коэффициент регрессии.
Градуировочный график рассчитывается методом наименьших квадратов.
6. Выполнение измерений
Анализ полученного по п. 2 фильтрата проводят на жидкостном хроматографе. Условия хроматографирования такие же, как и при построении градуировочного графика п. 4.
Определяют площади пиков, используя компьютерную систему обработки сигналов. Проводят анализ двух параллельных проб.
4
BY 15453 C1 2012.02.28
7. Обработка результатов измерений
Расчет содержания меламина X, мг/кг, проводят по формуле:
C × V1 × V3
X=
,
(2)
m × V2
где C - концентрация меламина, найденная по градуировочному графику, мкг/см3;
m - масса навески, г;
V1 - общий объем экстракта, 25 см3;
V2 - объем экстракта, взятого для пропускания через картридж, 5 см3;
V3 - объем подвижной фазы, взятый для растворения сухого остатка пробы после упаривания, 1 см3.
За окончательный результат измерения принимают среднее арифметическое значение
результатов двух параллельных определений. Вычисления проводят до третьего знака после запятой и округляют до второго.
Результаты определения меламина в молоке и молочных продуктах представлены в
табл. 2.
Таблица 2
Определяемое содержания меламина
в молоке и молочных продуктах предлагаемым способом
Наимено- Температу- Время Внес. Определяе- Извле- Предел Смесь раствора экстрак- экстрак- к-во, мое кол-во,
вание
че- обнаруже- рителей для
продукта
ции, мин мг/кг
мг/кг
ние, % ния, мг/кг экстракции
ции, °С
По предлагаемому способу
5
4,31
86,25
40
10
4,41
88,1
15
4,51
90,2
5
4,54
90,7
5 % ТХУ +
Молоко
50
10
5
4,94
98,8
0,2
+ацет-л 5:2
15
4,85
97,6
5
4,76
95,2
60
10
4,84
96,9
15
4,89
97,9
5
4,16
83,2
40
10
4,23
84,9
15
4,25
84,7
5
4,51
90,2
5 % ТХУ +
Творог
50
10
5
4,74
95,0
0,2
+ацет-л 5:2
15
4,75
94,7
5
4,72
94,4
60
10
4,75
95,0
15
4,75
95,0
2 % ТХУ +
4,86
97,3
+ацет-л 1:6
5 % ТХУ +
Молоко
50
10
5
4,94
98,8
0,2
ацет-л 5:2
10 % ТХУ +
4,89
97,9
+ацет-л 3:4
5 % ТХУ +
Сливки
50
10
5
4,97
99,4
0,2
+ацет-л 5:2
Известный способ (прототип)
50 % трифторуксусная
Молоко Комнатная
15
5
4,0
80,1
1,0
кислота
5
BY 15453 C1 2012.02.28
Достигаемый технический результат заявляемого способа заключается в том, что способ позволяет в 5 раз увеличить предел обнаружения (увеличение чувствительности метода), а также повышает точность определения на 3,1-18,7 %.
Источники информации:
1. МУК 4.1.2420-08. Методические указания по определению меламина в молоке и
молочных продуктах. - М., 2008 (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
110 Кб
Теги
патент, by15453
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа