close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15563

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.02.28
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 15563
(13) C1
(19)
C 12N 1/21
C 12N 15/54
(2006.01)
(2006.01)
ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI, ПРОДУЦИРУЮЩИЙ
УРИДИНФОСФОРИЛАЗУ
(21) Номер заявки: a 20100585
(22) 2010.04.19
(43) 2011.12.30
(71) Заявители: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси"; Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Квач Сергей Вячеславович;
Ерошевская Людмила Анатольевна;
Зинченко Анатолий Иванович;
Шахбазов Антон Валерьевич; Картель Николай Александрович (BY)
(73) Патентообладатели: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси"; Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) КВАЧ С.В. и др. Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: Сборник научных
трудов. - Минск: Беларуская навука,
2009. - С. 148-155.
RU 2177998 C2, 2002.
US 6911341 B2, 2005.
BY 15563 C1 2012.02.28
(57)
Штамм бактерий Escherichia coli БИМ B-547Д - продуцент уридинфосфорилазы.
Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии, в частности к генной инженерии, и решает задачу получения нового высокопродуктивного рекомбинантного бактериального штамма-продуцента уридинфосфорилазы (УРФ).
УРФ (КФ 2.4.2.3) катализирует фосфоролитическое расщепление молекулы уридина и
ряда его модифицированных аналогов (например, урациларабинозида) на пентозо-1фосфат и пиримидиновое основание, согласно реакции
BY 15563 C1 2012.02.28
Обратимый характер реакции позволяет использовать ее для синтеза модифицированных нуклеозидов, которые находят применение в медицине в качестве лекарственных
субстанций [1-3].
Известны штаммы бактерий, продуцирующие УРФ:
Escherichia coli БМТ-4Д/1A [4], используемый в способе получения противолейкозного нуклеозида 2-хлор-2'-дезоксиаденозина; Enterobacter aerogenes AJ-11125 [5], предложенный для синтеза противовирусного нуклеозида рибавирина; Escherichia coli БМ-11 [6],
Escherichia coli BL21 [7] и Enterobacter aerogenes DGO-04 [8], предназначенные для получения противовирусного нуклеозида аденинарабинозида.
Общим недостатком перечисленных штаммов является низкая продуктивность в отношении УРФ, так как они получены стандартными методами микробиологической селекции (без применения техники рекомбинантной ДНК), и их клетки содержат одну
копию гена, кодирующего УРФ.
Известен рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli BL21 (DE3)/pETUPHO1продуцент УРФ [9]. Удельная активность УРФ в осветленном бесклеточном экстракте,
полученном после разрушения клеток этого штамма ультразвуком, составляет 340 ед./мг
белка. За единицу активности принято количество фермента, расщепляющее 1 мкмоль
уридина за 1 мин при 25 °С. Данные по продуктивности штамма в отношении УРФ (в ед.
активности/мл культуральной жидкости или ед. активности/г клеток) в работе не приведены и рассчитать их не представляется возможным.
Известен штамм бактерий Escherichia coli BL21(DE3)/pERURPHO1, использующийся
в способе получения рекомбинантной УРФ [10]. УРФ накапливается в клетках этого
штамма в количестве 80 % от суммарного белка клеток. Данные по продуктивности
штамма в отношении УРФ в работе также отсутствуют.
Известен рекомбинантный штамм бактерий Escherichia coli DH5α/pGM708, продуцирующий УРФ в количестве 10 400 ед./г сырых клеток [11]. За единицу активности принято
количество фермента, расщепляющее 1 мкмоль уридина за 1 мин при 30 °С.
Недостатком указанного штамма является сравнительно невысокая продуктивность в
отношении УРФ.
Известны рекомбинантные штаммы Escherichia coli DUD [12] и Escherichia coli
EXP05/03 [13], продуцирующие УРФ и предложенные для использования в процедуре получения соответственно 2,6-диаминопуринрибозида и 2-хлор-2'-дезоксиаденозина. Однако
в указанных работах не приведены данные о продуктивности штаммов-продуцентов рекомбинантных ферментов.
Из известных штаммов-продуцентов УРФ наиболее близким по активности к предлагаемому является штамм Escherichia coli pUDP4 (прототип) [14]. Активность УРФ штамма-прототипа составляет 14 900 ед./г сырых клеток. За единицу активности принято
количество фермента, расщепляющее 1 мкмоль уридина за 1 мин при 60 °С. Штаммпрототип получен трансформацией Escherichia coli BL21(DE3) рекомбинантной плазмидой pUDP, в которую встроен ген udp, изолированный с помощью ПЦР из генома штамма,
отобранного методом традиционной селекции.
Недостатком штамма-прототипа является сравнительно невысокая продуктивность в
отношении УРФ.
Настоящее изобретение решает задачу получения штамма Escherichia coli pUDP17 более активного в отношении УРФ и продуцирующего фермент, способный выделяться из
лизата клеток с помощью одностадийной металло-аффинной хроматографии.
Источником структурного гена udp, кодирующего аминокислотную последовательность УРФ, служила хромосомная ДНК регуляторного мутанта Escherichia coli БМТ-4Д/1A
[4], характеризующегося дерепрессированным синтезом УРФ. ДНК выделяли с помощью фенол-хлороформного метода с дополнительной очисткой при помощи цетавлона [15].
2
BY 15563 C1 2012.02.28
Ген udp синтезировали с помощью ПЦР, используя высокоточную Pfu-полимеразу и
пару синтетических олигонуклеотидных праймеров: UDP-F (5'-CGTAAGCATATGTCCAAGTCTGATGTTTTTCATCTCG-3') и UDP-R (5'-ACTCGAGCAGCAGACGACGCGCCGC-3'). В 5'-окончания праймеров были встроены сайты рестрикции (выделены курсивом) эндонуклеаз NdeI (UDP-F) и XhoI (UDP-R). Продукты амплификации разделяли
путем электрофореза в 1 %-ном агарозном геле. Продукт, соответствующий гену udp, выделяли из геля, обрабатывали смесью рестриктаз NdeI и XhoI и полученную вставку с геном udp легировали в вектор pET24b+ , содержащий T7-промотор и последовательность
нуклеотидов, кодирующую гистидиновый олигопептид (Novagen, США). Полученной лигазной смесью трансформировали компетентные клетки Escherichia coli DH5α, полученные стандартным кальциевым методом [15] с последующим высевом на плотную
питательную среду LB (1 % триптон, 0,5 % дрожжевой экстракт, 1 % NaCl), содержащую
канамицин в концентрации 100 мкг/мл. Каждую из пяти выросших одиночных колоний
перенесли в колбы, содержащие 25 мл среды LB с канамицином, и культивировали 12 ч.
Из полученных биомасс стандартным щелочным методом [15] выделили плазмиды, которые проанализировали методом ПЦР с использованием олигонуклеотида UDP-F и олигонуклеотида
к
последовательности
T7-терминатора
плазмиды
pET24b+ (5'GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3'). В результате была сконструирована плазмида
pETUDP17, несущая вставку с геном udp в правильной ориентации. Путем последующей
трансформации плазмидой pETUDP17 клеток Escherichia coli BL21(DE3) был получен рекомбинантный штамм Escherichia coli pUDP17 - суперпродуцент УРФ, молекула которой
удлинена на 6 остатков гистидина, что позволяет применить для выделения фермента из
лизата Escherichia coli одноэтапную очистку с использованием высокоэффективной металлоаффинной хроматографии, в отличие от стандартных многостадийных приемов выделения рекомбинантной УРФ [16].
Штамм-продуцент Escherichia coli pUDP17 отличается от штамма-реципиента
BL21(DE3) наличием нескольких копий рекомбинантной плазмиды pET24b+ , в которую
встроен ген udp, ответственный за синтез гомологичной УРФ, удлиненной с С-конца на
металло-аффинный шестигистидиновый олигопептид. В качестве генетического маркера
эта плазмида содержит ген kan, придающей клеткам, трансформированным этой плазмидой, устойчивость к канамицину.
Клетки Escherichia coli pUDP17 проявляют способность к суперпродукции УРФ, которая, судя по электрофоретическому анализу в полиакриламидном геле, накапливается в
клетках в количестве около 80 % от суммарного водорастворимого белка.
Штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ
"Институт микробиологии НАН Беларуси" под коллекционным номером БИМ B-547Д и
характеризуется следующими свойствами.
Генотип
F--, dcm, ompT, hsdS(rB-mB-), gal, (LambdaDE3) [15]. Клетки содержат плазмиду
pET24b+ с геном kan, детерминирующим устойчивость клеток к канамицину, и встроенным модифицированным геном udp (удлиненным на 6 гистидиновых кодонов).
Морфологические признаки
Клетки - прямые палочки размером (1,1-1,5) x (2,0-6,0) мкм; подвижные, перитрихальное жгутикование; грамотрицательные.
На МПА и агаризованной среде Адамса (30 °С, 3 сут.) колонии гладкие, слабо выпуклые, легко сливающиеся. Цвет колоний желтый. Поверхность блестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые.
Культуральные признаки и физиолого-биохимические свойства
Растет на простых питательных средах, содержащих канамицин в количестве
25-100 мкг/мл.
3
BY 15563 C1 2012.02.28
Диапазон температуры роста бактерий - 8-40 °С с оптимумом - 37 °С. pH-оптимум роста находится в зоне 7,2-7,4. Факультативный анаэроб.
Клетки Escherichia coli pUDP17 могут в качестве единственного источника углерода
использовать ацетат, но не цитрат. Глюкоза и другие углеводы сбраживаются с образованием пирувата, который затем превращается в молочную, уксусную и муравьиную кислоты. Индолположительны, не образуют H2S на железо-сахарной среде, не сбраживают
лактозу и малонат, не гидролизуют желатин.
На бульоне Хоттингера к 24 ч (30 °С) рост бактерий выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок, который полностью взмучивается
при встряхивании (S-форма).
Клетки проявляют устойчивость к канамицину (до 200 мкг/мл).
Содержание Г + Ц в составе ДНК 56,1±0,4 мол. % (определено оптическим методом).
Клетки Escherichia coli pUDP17 сохраняют жизнеспособность не менее полугода при
хранении в холодильнике (4-6 °С) на полноценной агаризованной среде (мясо-пептонный
бульон, среда Хоттингера), содержащей канамицин (100 мкг/мл), под слоем вазелинового
масла, а также в лиофилизированном (криопротектор - 10 %-ное обезжиренное молоко)
состоянии.
Клетки Escherichia coli pUDP17 после разрушения обладают способностью катализировать обратимый фосфоролиз уридина и ряда других нуклеозидов урацила. Активность
клеток, измеренная в реакции фосфоролиза уридина, составляет 76 800 ед./г сухих клеток
или 307 200 ед./л культуральной жидкости.
Содержание "химерной" УРФ в клетках штамма Escherichia coli pUDP17 составляет
около 80 % от суммарного содержания водорастворимого белка, и фермент после разрушения клеток, например, ультразвуком может быть очищен до гомогенного состояния в
одну стадию с помощью аффинной хроматографии на матрице, содержащей ионы двухвалентных металлов.
Для культивирования Escherichia coli pUDP17 с целью получения УРФ применяют питательную среду ZYM5052 [17], приготовленную на дистиллированной воде, следующего состава:
триптон - 1,0 %;
дрожжевой экстракт - 0,5 %;
глицерин - 0,5 %;
глюкоза - 0,05 %;
α-D-лактоза - 0,2 %;
аспартат - 0,25 %;
Na2HPO4 - 0,025 M;
KH2PO4 - 0,025 M;
NH4Cl - 0,05 M;
Na2SO4 - 0,005 M;
MgSO4 - 0,001 M;
канамицин - 50 мкг/мл; pH 7,0.
Посевным материалом служит суточная бактериальная культура, которую вносят в
среду в количестве 1/100 от конечного объема среды.
Для наработки УРФ проводят культивирование клеток Escherichia coli pUDP17 на среде ZYM5052 до оптической плотности 13-14 (λ = 600 нм).
Изменение биомассы бактерий контролируют турбодиметрически (λ = 600 нм), используя соответствующую калибровочную кривую. По окончании культивирования клетки осаждают центрифугированием при 7 000 g в течение 10 мин, дважды отмывают от
питательной среды с помощью 0,15 M NaCl и разрушают ультразвуком.
Активность УРФ в ультразвуковом лизате клеток определяют по скорости фосфоролиза уридина. Стандартная реакционная смесь (1 мл) содержит (мМ): уридин - 100, калийфосфатный буфер (pH 7,0) - 50 и 0,1 мл ультразвукового лизата клеток с концентрацией
4
BY 15563 C1 2012.02.28
белка 0,02 мг/мл. Смесь инкубируют 20 мин при 60 °С при перемешивании на магнитной
мешалке. Ход реакции контролируют с помощью тонкослойной хроматографии в системе:
хлороформ-изопропанол-25 %-ный аммиак (10:10:1). За единицу активности фермента
принимают такое его количество, которое обеспечивает фосфоролиз уридина в количестве
1 мкмоль за 1 мин в указанных выше условиях реакции.
Активность штамма Escherichia coli pUDP17 в отношении УРФ, выраженная в ед./мл
культуральной жидкости (продуктивность штамма), значительно выше любого из известных штаммов-продуцентов этого фермента.
Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения УРФ.
Изобретение иллюстрируется следующими примерами конкретного выполнения.
Пример 1
Культивирование Escherichia coli pUDP17 в оптимальных условиях.
Культивирование Escherichia coli pUDP17 проводят в колбе Эрленмейера объемом
250 мл на термостатируемой биологической качалке с частотой колебания платформы
170-190 об/мин при температуре 37 °С. Питательная среда (50 мл) для выращивания приготовляется на дистиллированной воде и имеет следующий состав: триптон - 1,0 %;
дрожжевой экстракт - 0,5 %; глицерин - 0,5 %; глюкоза - 0,05 %; α-D-лактоза - 0,2 %; аспартат - 0,25 %; Na2HPO4 - 0,025 M; KH2PO4 - 0,025 M; NH4C1 - 0,05 M; Na2SO4 - 0,005 M;
MgSO4 - 0,001 M (pH 7,0). Стерилизацию среды осуществляют горячим паром под давлением в режиме 0,5 ати, 15 мин. После стерилизации в среду вносят канамицин до концентрации 50 мкг/мл.
Посевным материалом служит суточная бактериальная культура, которую вносят в
среду в количестве 1/100 от конечного объема среды.
В процессе культивирования проводят измерение оптической плотности культуры при
λ = 600 нм до достижения культурой оптической плотности 13 о.е.
По окончании выращивания клетки осаждают центрифугированием при 7 000 g в течение 10 мин, дважды отмывают от питательной среды 0,15 M раствором NaCl и разрушают ультразвуком. Для этого клетки (1 г) суспендируют в 50 мл 10 мМ калийфосфатного буфера (pH 7,0) и обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе микроорганизмов Sonifier-450 фирмы "Branson" (США) при мощности 0,2 кВт в течение 3 мин.
Остатки разрушенных клеток осаждают центрифугированием в течение 10 мин при 15
000 g. Полученный супернатант используют в качестве источника УРФ. Активность УРФ,
определенная, как описано выше, составляет 76 800 ед./г сухих клеток или 307 200 ед./л
культуральной жидкости.
Пример 2
Получение ферментного препарата УРФ Escherichia coli pUDP17.
Полученный, как описано в примере 1, УЗ-лизат 10 г клеток штамма Escherichia coli
pUDP17 наносят на хроматографическую колонку (7 мл) со смолой Ni-NTA (фирма Qiagen, США). Колонку промывают 70 мл буфера, содержащего 20 мМ Трис-HCl, 0,5 M
NaCl и 20 мМ имидазол (pH 7,9). Белок элюируют 10 мл буфера, содержащего 20 мМ
Трис-HCl, 0,5 M NaCl и 1 M имидазол (pH 7,9). Раствор белка подвергают диализу против
1000-кратного объема 50 мМ К-фосфатного буфера (pH 7,0), содержащего 20 об. % глицерина. Активность УРФ в полученном препарате составляет 300 ед./мг белка. Выход ферментативной активности 90 %.
Таким образом, получен штамм, обладающий по сравнению с известными штаммамипродуцентами УРФ значительно более высокой продуктивностью (307 200 ед./л культуральной жидкости против 141 500 ед./л культуральной жидкости у прототипа) и возможностью применения для очистки фермента одной аффинно-хроматографической стадии.
Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов-продуцентов УРФ.
5
BY 15563 C1 2012.02.28
Источники информации:
1. Utagawa T. Enzymatic preparation of nucleoside antibiotics // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. - 1999. - Vol. 6. - P. 215-222.
2. Патент BY 9975. Способ получения 9-(β-D-арабинофуранозил)-2-фтораденина /
Л.А. Ерошевская, В.Н. Барай, Е.Н. Калиниченко, И.А. Михайлопуло, А.И. Зинченко.
3. Mikhailopulo I.A. Biotechnology of nucleic acid constituents - state of the art and perspectives // Curr. Organic Chem. - 2007. - Vol. 11, № 4. - P. 317-335.
4. Barai V.N., Zinchenko A.I., Eroshevskaya L.A., Kalinichenko E.N., Kulak T.I., Mikhailopulo I.A. An universal biocatalyst for the preparation of base- and sugar-modified nucleosides
via an enzymatic transglycosylation // Helvetica Chim. Acta. - 2002. - Vol. 85, № 7. - P. 19011908.
5. Shirae H., Yokozeki K., Kubota K. Enzymatic production of ribavirin from pyrimidine
nucleosides by Enterobacter aerogenes AJ 11125 // Agric. Biol. Chem. - 1988. - Vol. 52, № 5. P. 1233-1237.
6. Ерошевская Л.А. Препаративный синтез противовирусного нуклеозида 9-β-Dарабинофуранозиладенина с помощью бактериальных клеток / Л.А. Ерошевская, В.Н. Барай, А.И. Зинченко и др. // Антибиотики и мед. битехнология. - 1986. - Т. 31, № 3. - С. 174178.
7. Rogert M.C., Trelles J.A., Porro S., Lewkowicz E.S., Iribarren A.M. Microbial synthesis
of antiviral nucleosides using Escherichia coli BL21 as biocatalyst // Biocatal. Biotransform. 2002. - Vol. 20, № 5. - P. 347-351.
8. Wei X.K., Ding Q.B., Zhang L., Guo Y.L., Ou L., Wang C.L. Induction of nucleoside
phosphorylase in Enterobacter aerogenes and enzymatic synthesis of adenine arabinoside //
J. Zhejiang Univ. Sci. B. - 2008. - Vol. 9, № 7. - P. 520-526.
9. Esipov R.S., Gurevich A.I., Chuvikovsky D.V., Chupova L.A., Muravyova T.I., Miroshnikov A.I. Overexpression of Escherichia coli genes encoding nucleoside phosphorylases in the
pET/B121(DE3) system yields active recombinant enzymes // Protein Expr. Purif. - 2002. - Vol.
24, № 1. - P. 56-60.
10. RU 2177998 C2, 10.01.2002.
11. US 6911341, 28.06.2005.
12. Ge C., Yang L.O., Ding Q., Ou L. Co-expression of recombinant nucleoside phosphorylase from Escherichia coli and its application // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2009. - Vol. 159,
№ 1. - P. 168-177.
13. EP 1932918 Al, 18.06.2008.
14. Квач С.В., Ерошевская Л.А., Зинченко А.И. Оптимизация условий экспрессии генно-инженерной уридинфосфорилазы Escherichia coli // Микробные биотехнологии: фундаментальные и прикладные аспекты: Сб. науч. тр. Т. 2; под ред. Э.И. Коломиец и
А.Г. Лобанка. - Минск: Беларуская навука, 2009. - С. 148-155.
15. Sambrook J., Frittsch E., Maniatis T. Molecular cloning: a laboratory manual / 2-nd ed.New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 2222 p.
16. Timofeev V.I., Lashkov A.A., Gabdoulkhakov A.G., Pavlyuk B.P., Kachalova G.S., Betzel C., Morgunova E.Y., Zhukhlistova N.E., Mikhailov A.M. Isolation, crystallization and preliminary crystallographic analysis of Salmonella typhimurium uridine phosphorylase crystallized
with 2,2'-anhydrouridine // Acta Cryst. F: Struct. Biol. Cryst. Commun. - 2007. - Vol. 63, № 10. P. 852-854.
17. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures //
Protein Expr. Purif. - 2005. - Vol. 41, № 1. - P. 207-234.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
108 Кб
Теги
патент, by15563
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа