close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15623

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 01H 4/00
(2006.01)
СПОСОБ СТИМУЛИРОВАНИЯ КОРНЕОБРАЗОВАНИЯ У ПОБЕГА
ЛЬНА, ПОЛУЧЕННОГО ИЗ КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ IN VITRO
(21) Номер заявки: a 20090194
(22) 2009.02.13
(43) 2010.10.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Гузенко Елена Витальевна
(BY); Лемеш Валентина Александровна (BY); Хотылева Любовь Владимировна (BY); Картель Николай
Александрович (BY); Баер Олег
Александрович (UA); Емец Алла
Ивановна (UA); Блюм Ярослав Борисович (UA)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
BY 15623 C1 2012.04.30
BY (11) 15623
(13) C1
(19)
(56) ПОЛЯКОВ А.В. Биотехнология в селекции льна. - Тверь, 2000. - С. 90-93.
RU 2282352 C1, 2006.
RU 2060646 C1, 1996.
UA 14935 U, 2006.
US 6548300 B1, 2003.
ОРЛОВСКАЯ О.А. и др. Международная научная конференция "От
классических методов генетики и селекции к ДНК-технологиям": Материалы конференции. - Минск, 2007. С. 57.
ОРЛОВСКАЯ О.А. и др. Льноводство:
реалии и перспективы: Сборник научных материалов. - Могилевская областная укрупненная типография имени Спиридона Соболя, 2008. - С. 123126.
Получение растений-регенерантов льнадолгунца, устойчивых к фузариозному
увяданию, методами in vitro (культура
пыльников, клеточная селекция): Методические рекомендации. - Торжок,
2008. - С. 4-9.
(57)
Способ стимулирования корнеобразования у побега льна, полученного из каллусной
культуры in vitro, заключающийся в том, что срез побега помещают на границе раздела
питательная среда/воздух, при этом в качестве питательной среды используют агаризованную безгормональную среду Мурасиге-Скуга, содержащую половинный набор макросолей и витаминов, 10 г/л сахарозы и 7 г/л агара, которой заполняют чашку Петри, с
половины чашки Петри среду удаляют, прорезают в оставшейся части среды окошко, срезают побег с каллуса, протыкают побегом среду над окошком и продвигают его до соприкосновения среза со средой в нижней части окошка, после чего, сохраняя вертикальное
положение побега, размещают чашку Петри на световой установке до образования корней.
Изобретение относится к области биотехнологии растений, в частности к тем методам
культивирования в условиях in vitro, где требуются укоренение полученных растенийрегенерантов и адаптация их к естественным условиям выращивания (ex vitro). Изобрете-
BY 15623 C1 2012.04.30
ние может успешно использоваться в технологиях на основе культивируемых тканей и
клеток растений, а именно: получение биологически активных веществ растительного
происхождения, ускоренное микроклональное размножение, получение безвирусных растений, получение растений после отдаленной гибридизации, антерные культуры (гаплоиды, дигаплоиды), клеточный мутагенез и селекция, соматическая гибридизация,
генетическая трансформация.
Известно, что корнеобразование (ризогенез) и последующая адаптация к почвенным
условиям являются наиболее трудновыполнимыми этапами в культуре in vitro для любого
растительного материала и в высокой степени для льна, регенеранты которого характеризуются особенно низкой адаптационной способностью [1, 2].
В используемых методах для получения корней у регенерантов льна меняют основной
состав среды, уменьшая в два, а иногда и в четыре раза концентрацию минеральных солей
по рецепту Мурасига и Скуга [1, 3, 4], или заменяют ее средой Уайта [5], уменьшают количество сахаров до 0,5-1 % и полностью исключают цитокинины, оставляя один лишь
ауксин [6]. В качестве стимулятора корнеобразования применяют β-индолил-3-масляную
кислоту, β-индолил-уксусную кислоту [7] или β-нафтил-уксусную кислоту [7, 8]. Кроме
этого, применяется затемнение нижней части сосуда, что также стимулирует корнеобразование [5].
Аналогами заявляемого способа индукции корнеобразования могут считаться способы
получения корней на жидких питательных средах. В данных способах для поддержания
побегов используются подложки из парафиновых дисков, П-образных полосок фильтровальной бумаги, пенопластовых тонких пластинок либо пластинок из любого другого
инертного пористого материала [5, 9]. Полоски загибаются, концами вниз помещаются в
пробирку так, чтобы образовавшаяся горизонтальная плоскость материала оказалась чуть
выше уровня жидкой среды. Культивирование эксплантов происходит на подложке. Данные способы неудобны в исполнении, так как требуются многочисленные сложные манипуляции в стерильных условиях, к тому же микропобеги льна проблематично закрепить
на подложке. Кроме того, использование парафиновых дисков может иметь отрицательное воздействие на корнеобразование и качество корневой системы из-за ухудшения аэрации микропобегов [9].
Наиболее близким к заявляемому является метод, в котором используется безгормональная среда Мурасига и Скуга, содержащая половинный набор макросолей и витаминов, агар (7 г/л) и сахарозу (10 г/л) [1].
Несмотря на варьирование состава сред, способ получения корней у регенерированных побегов льна во всех методиках одинаков: побеги длиной 2-2,5 см отделяют от каллуса и заглубляют в выбранной среде так, чтобы побег сохранял вертикальное положение. В
течение довольно длительного промежутка времени (1-2 месяца) формируются корни.
Данный способ имеет существенные недостатки. При долгом культивировании растительных тканей на питательных средах происходит постепенное накопление веществ токсического действия (фенольные соединения), что приводит к формированию растений с
измененной морфологией [10]. Возможно накопление этилена, вызывающего эпинастию и
хлороз [10, 11]. Вместе с тем наблюдаются такие нежелательные эффекты, как подавление
пролиферации пазушных меристем, образование верифицированных (оводненных) побегов и, как следствие, уменьшение способности растений к укоренению. При заглублении
побегов в среду культивирования уменьшается аэрация нижней части стебля растениярегенеранта. В таких условиях образование корней затруднено, а образовавшиеся корни
обладают сниженной биосинтетической активностью, замедляется поглощение воды и солей, что вызывает ослабление роста побегов [12].
В связи с этим задача заявляемого способа состоит в создании определенных условий
культивирования, стимулирующих ризогенез, у растений-регенерантов.
2
BY 15623 C1 2012.04.30
Для решения поставленной задачи разработана методика стимулирования корнеобразования. Сущность заявленного способа состоит в том, что при переносе на среду для ризогенеза побеги льна не заглубляются в питательную среду, а культивируются на границе
питательная среда/воздух.
Известно, что у молодых тканей с высоким содержанием физиологически активного
материала (в данном случае срез стебля регенерированного побега) интенсивность клеточного дыхания выше, чем у зрелой ткани. Также известно, что образование вторичных
корней происходит из клеток камбия. Заявляемый способ основан на улучшении аэрации
камбиальной зоны стебля, что приводит к увеличению активности клеток этой зоны и,
следовательно, способствует образованию корней.
Для заявляемого способа используется безгормональная среда Мурасига и Скуга, содержащая половинный набор макросолей и витаминов, агар (7 г/л), сахарозу (10 г/л). Далее следует специальная подготовка чашек Петри, заполненных средой указанного
состава. Подготовка включает следующие этапы:
1) заливают 25-30 мл среды в чашку Петри диаметром 90 мм;
2) отделяют с помощью скальпеля и удаляют половину среды (фиг. 1);
3) отступив от верхней границы оставшейся половины среды 5 мм, прорезают "окошко" практически на всю ширину чашки (примерный размер 5 × 80 мм) (фиг. 2);
4) побеги отделяют от каллуса. Растение держат пинцетом, подносят к "мостику" из
среды (фиг. 3);
5) протыкают "мостик" стебельком и продвигают до тех пор, пока срез стебля растения слегка не коснется поверхности той части среды, которая образует нижнюю часть
"окошка". Стрелкой указано направление действия (фиг. 4);
6) чашки Петри с помещенными в них побегами размещают на световых установках
вертикально.
При реализации проектов с применением биотехнологических методов на культуре
льна в основном используются сорта льна масличного [13, 14, 15]. Они обладают более
высокой регенерационной способностью по сравнению с сортами льна-долгунца [16]. При
разработке заявляемого способа мы использовали генотипы сортов и льна масличного, и
льна-долгунца. Индукция ризогенеза по заявляемому методу позволяет одинаково успешно получать функциональные корни у побегов льна обоих типов. Наблюдаемое интенсивное развитие корневой системы (фиг. 5) способствует быстрому установлению
оптимального эндогенного баланса гормонов, что позволяет растениям легко адаптироваться к условиям выращивания ex vitro (фиг. 6). В результате проведенных нами наблюдений установлено, что индукция ризогенеза заявляемым способом
сокращает сроки образования корней до 10-20 дней по сравнению с 30-60 днями, если
пользоваться общепринятой методикой;
повышает эффективность ризогенеза до 80 % по сравнению с 10-20 %, если пользоваться общепринятой методикой;
позволяет получить хорошо развитую корневую систему, что облегчает адаптацию
побегов к условиям ex vitro;
позволяет получать корни у генотипов льна с различной регенерационной способностью.
Источники информации:
1. Поляков А.В. Биотехнология в селекции льна. - Тверь, 2000. - 150 с.
2. Pretova A., Obert В. and Bartosova Z. Flax // Biotechnology in Agriculture and Forestry.
Vol. 6. Transgenic Crops VI Red. by E.C. Springer-veriag Berlin Heidelberg. - 2007. - P. 129-140.
3. Поляков А.В., Кельнер Е.В. Органогенез и регенерация у льна-долгунца в культуре
in vitro. Технические культуры. - М.: Агропромиздат, 1991. - С. 192-199.
3
BY 15623 C1 2012.04.30
4. Burbulis N., Blinstrubiene A., Kupriene R., Sliesaravicius A., Venskutoniene E. Optimization of Linseed flax (Linum usitatissimum L.) in vitro cultures // Zemdirbyste. Agriculture. V. 94. - No 4. - 2007. - P. 120-128.
5. Основы биотехнологии растений. Культура клеток и тканей: Учебное пособие / И.К. Сорокина, Н.И. Старичкова, Т.Б. Решетникова, Н.А. Гринь. - СГУ им. Н.Г.Чернышевского,
2002. - 45 с.
6. Teguh Wijayanto and Alan McHughen. Genetic transformation of Linum by particle bombardment //In Vitro Cell. Dev. Biol. - Plant 35:456 - 465. - November - December, 1999.
7. Rutkowska-Krause I., Mankowska G., Poliakov A.V. Regeneration ofandrogenic flax
(Linum usitatissimum L.) plants and their application in breeding programme //Natural Fibres. 2002. - P. 92-101.
8. Wang Yu Fu, Kang Qing Hua, Liu Yan, Li Xi Chen, Liu Shao Jun, Xu Ying. Study on
Flax Genetic Transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens // J. Natural Fibres. Vol. 1 (1). - 2004. - P. 1-10.
9. Пронина И.Н. Оптимизация процесса ризогенеза подвоев и сортов яблони и груши
in vitro: Автореферат канд. дисс. - Мичуринск, 2008. - 23 с.
10. Кузьмина Н.А. Основы биотехнологии // http://www.biotechnolog.ru/, 2005.
11. Бабикова А.В., Горпенченко Т.Ю., Журавлев Ю.Н. Растение как объект биотехнологии // КОМАРОВСКИЕ ЧТЕНИЯ. - Вып. LV. - 2007. - С. 184-211.
12. Крамер П.Д., Козловский Т.Т. // Физиология древесных растений. - 1983. - 464 с.
13. Баер О.А., Баер Г.Я., Емец А.И., Блюм Я.Б. Введение в культуру in vitro и регенерационная способность сортов льна-долгунца с различной устойчивостью к полеганию //
Физ. и биох. культ. растений. - 2004. - Т. 36. - № 1. - С. 48-54.
14. Поляков А.В., Чикризова О.Ф., Каляева М.А., Захарченко Н.С., Балохина Н.В.,
Бурьянов Я.И. Трансформация растений льна-долгунца // Физиол. растений. - 1998. Т. 45. - № 6. - С. 882-887.
15. Wang Yu Fu, Kang Qing Hua, Liu Yan, Li Xi Chen, Liu Shao Jun, Xu Ying. Study on
Flax Genetic Transformation mediated by Agrobacterium tumefaciens // J. Natural Fibres. Vol. 1 (1). - 2004. - P. 1-10.
16. Yelena Guzenko, Valentina Lemesh, Lyubov Khotyleva. Comparative analysis of regenerative ability in linseed and fiber flax cultivars// INTERNATIONAL SCIENTIFIC CONFERENCE Actualities in Plant Physiology 12-13 June, 2008, Babtai, Lithuanian Institute of
Horticulture. - P.58-59.
Фиг. 1
4
BY 15623 C1 2012.04.30
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
5
BY 15623 C1 2012.04.30
Фиг. 6
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
2 268 Кб
Теги
by15623, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа