close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15648

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07H 21/04
(2006.01)
НАБОР ДЛЯ ЭКСТРАКЦИИ ДНК МИКОБАКТЕРИЙ ИЗ
ДИАГНОСТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА
(21) Номер заявки: a 20091819
(22) 2009.12.18
(43) 2011.08.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр пульмонологии
и фтизиатрии" (BY)
(72) Авторы: Слизень Вероника Вячеславовна; Суркова Лариса Константиновна; Залуцкая Оксана Михайловна; Титов Леонид Петрович
(BY)
BY 15648 C1 2012.04.30
BY (11) 15648
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр пульмонологии и фтизиатрии" (BY)
(56) RU 2116795 C1, 1998.
RU 2289627 C2, 2006.
RU 2192011 C1, 2002.
UA 61779 A, 2003.
UA 8094 U, 2005.
КИНШТ В.Н. и др. Клиническая лабораторная диагностика. - 2005. - № 3. С. 23-24, 33-34.
ALDOUS W.K. et al. Journal of Clinical
Microbiology. - 2005. - V. 43. - No. 5. P. 2471-2473.
NOLTE F.S. et al. Journal of Clinical
Microbiology. - 1993. - V. 31. - No. 7. P. 1777-1782.
(57)
Набор для экстракции ДНК микобактерий из диагностического материала, отличающийся тем, что содержит 250 мкл экстрагирующей ДНК суспензии, представляющей собой 10 %-ный Chelex-100 в 2xTAE буфере, 80 мкл раствора для преципитации ДНК,
представляющего собой 1,7 %-ный раствор 3M ацетата натрия в изопропаноле, и 1 мл раствора для ресуспендирования ДНК, представляющего собой 1xTE буфер, содержащий
0,5 % Твин-20.
Предлагаемое изобретение относится к области медицины, в частности к биохимическим исследованиям биологических объектов, и может быть использовано для диагностики туберкулеза с применением молекулярно-генетических методов.
Молекулярно-генетические методы детекции микобактерий туберкулеза (МБТ) включают три основных этапа. Первый этап является общим для всех методов и заключается в
экстракции ДНК из диагностического образца от пациента (чаще всего мокроты) или
культуры микобактерий. Второй этап представляет собой амплификацию участка генома
МБТ, третий - анализ амплифицированного продукта. Качество экстракции ДНК является
одним из наиболее значимых факторов, обусловливающих эффективность молекулярногенетических исследований.
BY 15648 C1 2012.04.30
Клеточная стенка микобактерий туберкулеза сходна с клеточной стенкой грамположительных бактерий, поскольку образована многослойным пептидогликановым комплексом. Миколовые кислоты являются главным липидным компонентом матрикса клеточной
стенки МБТ, состоящего из пептидогликана, ковалентно связанного с гетерополисахаридом арабиногалактаном и этерифицированного миколовыми кислотами. Это придает клеточной стенке МБТ сильные гидрофобные свойства. В дополнение к липидам, которые
могут составлять до 60 % оболочки клетки, клетки МБТ содержат углеводы и растворимые белки. Особенности химического состава клеточной стенки обусловливают сложность экстракции ДНК микобактерий. Кроме этого, наиболее распространенным
биологическим материалом для исследования на туберкулез является мокрота, вязкость
которой создает сложность для качественной экстракции ДНК.
Известно применение коммерческих наборов для выделения ДНК на основе обратимой сорбции молекул ДНК на мелкодисперсных частицах стекла в буферных растворах.
Наиболее близким к предлагаемому является набор для выделения ДНК, состоящий из
лизирующего буфера в виде 3-10 М раствора мочевины, связывающего буфера в виде 2,55,0 М хлористого натрия, элюирующего буфера в виде раствора 10 мМ Трис-HCl и 1 мМ
Трилона Б с pH 8, 80 %-го этилового спирта в качестве отмывочного буфера и в качестве
сорбента - силикагель [1].
Недостатком применения указанного набора является то, что вязкость исследуемых
образцов мокроты приводит в ряде случаев к слипанию образца с мелкодисперсными частицами стекла в ходе этапа сорбции ДНК, что снижает эффективность выделения ДНК.
Задачей настоящего изобретения является разработка более простого и эффективного
набора для выделения ДНК из образцов диагностического материала.
Поставленная задача решается предлагаемым набором для экстракции ДНК, предусматривающим выделение ДНК с использованием комплексообразователя Chelex-100 с
последующим осаждением этанолом, содержащим 250 мкл осаждающей суспензии, представляющей собой 10 %-ный Chelex-100 в 2xTAE буфере, 80 мкл раствора для преципитации ДНК, представляющего собой 1,7 %-ный раствор 3 М ацетата натрия в изопропаноле,
и 1 мл раствора для ресуспендирования ДНК, представляющего собой 1xTE буфер с
0,5 %Твин-20.
Экстракция ДНК микобактерий с использованием данного набора осуществляется следующим образом.
К исследуемому материалу (мокрота) добавляют муколитик в объеме, равном объему
пробы, после чего центрифугируют при 12000 об/мин в течение 15 мин. Используя наконечник с аэрозольным барьером, набирают осадок биологического материала объемом 250
мкл и вносят в пробирку с осаждающей суспензией (компонент 1). Тщательно перемешивают пробы при помощи вортекса, нагревают на водяной бане при 95 °С в течение 20 мин,
либо в твердотельном термостате при 90 °С в течение 20 мин. Центрифугируют пробы
при 12000 об/мин в течение 15 мин. Полученную надосадочную жидкость объемом 400
мкл вносят в пробирку с преципитирующим раствором (компонент 2), размешивают на
вортексе, вносят 800 мкл спирта этилового 96 %, охлажденного в морозильной камере,
тщательно смешивают с помощью вортекса, помещают в морозильную камеру на 20 мин.
Центрифугируют пробу при 12000 об/мин в течение 15 мин. Супернатант тщательно удаляют, добавляют 1,0 мл 70 % этанола, тут же удаляют его, стараясь не утерять осадка. Дополнительно импульсно откручивают пробирку на микроцентрифуге или вортексцентрифуге для удаления остатков спирта. Высушивают содержимое пробирки при 4045 °С в течение 4-7 мин. Добавляют 150 мкл ресуспендирующего раствора (компонент 3),
инкубируют содержимое 5-10 мин при 40-45 °С. Перемешивают на вортексе. Жидкость,
содержащую ДНК, используют для постановки ПЦР. Очищенную ДНК до проведения
дальнейших исследований хранят при температуре не выше -16 °С.
2
BY 15648 C1 2012.04.30
Была проведена сравнительная оценка эффективности выделения ДНК микобактерий
туберкулеза тремя методами: с использованием комплексообразователя Chelex-100 с последующим осаждением этанолом, щелочного лизиса, с помощью кремниевого сорбента
(фиг. 1, 2, таблица). Для оценки эффективности выделения ДНК был использован метод
ПЦР в реальном времени с TaqMan зондами, позволяющими выявлять микобактерии туберкулеза.
Общая ДНК, экстрагированная с использованием температурного лизиса и Chelex-100,
содержит специфическую ДНК микобактерии, что подтверждается в реакции ПЦР с
TaqMan зондами в отношении специфических участков микобактерии IS6110 (фиг. 1, 2).
На фиг. 1 представлена сравнительная характеристика флюоресценции ДНК, выделенной из образца мокроты № 1, экстрагированной тремя методами:
с помощью Chelex-100 - кривая с крестиками, концентрация исходной ДНК 13,89 мкг/мл;
с помощью кремниевого сорбента - кривая с треугольниками, концентрация исходной
ДНК - 21,11 мкг/мл;
с помощью щелочного лизиса - кривая с квадратами, концентрация исходной ДНК 48,9 мкг/мл.
На фиг. 2 - сравнительная характеристика флюоресценции ДНК, выделенной из образцов мокроты № 17-24, экстрагированных тремя методами, свидетельствует о том, что
экстракция с помощью Chelex-100 дает более высокие уровни флюоресценции:
с помощью Chelex-100 - кривые с крестиками;
с помощью кремниевого сорбента - кривые с треугольниками;
с помощью щелочного лизиса - кривые с квадратами.
Сравнительный анализ экстрактов ДНК, выделенных из мокроты тремя различными
методами, был проведен с использованием оценки пороговых циклов (таблица) - это количество циклов амплификации, необходимое для достижения пороговой величины
флюоресценции, свидетельствующей о положительной реакции. При этом существует обратная зависимость между количеством ДНК и пороговым циклом: чем меньше пороговый цикл, тем выше концентрация образца.
Согласно полученным данным, экстракция с помощью Chelex-100 и щелочным лизисом дает сравнимые результаты, экстракция с использованием методики с кремниевым
сорбентом очень часто неэффективна и приводит к утрате ДНК (12 отрицательных результатов, в то время как с помощью Chelex-100 и щелочным лизисом 5 и 3 отрицательных результата соответственно).
Таким образом, предлагаемый набор, по сравнению с известными, имеет ряд преимуществ:
1. Обеспечивает получение высококачественных препаратов ДНК из образцов мокроты.
2. Характеризуется меньшей трудоемкостью.
3. Состоит из легко доступных компонентов.
Набор для экстракции ДНК
Экстракция с Chelex-100
№ истоЭкстракция с крем- Экстракция щелочным ли№
и концентрированием
рии бониевым сорбентом
зисом и нейтрализацией
п/п
ДНК
лезни
Пороговые циклы (Ct)
1
6108
16,65
20,73
17,56
2
13082
24,78
26,81
23,47
3
13226
00,00
23,97
27,68
4
6109
00,00
19,43
16,94
5
13117
24,31
35,87
21,68
6
13235
28,89
00,00
27,43
3
BY 15648 C1 2012.04.30
Продолжение таблицы
№ исто№
рии боп/п
лезни
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
13124
13215
13237
13158
13231
13204
6104
13141
13228
12688
12687
13309
13341
13297
13296
13299
13294
13292
Экстракция с Chelex-100
и концентрированием
ДНК
33,85
00,00
00,00
29,88
29,76
30,48
29,80
33,38
36,42
29,10
27,87
38,98
31,92
00,00
31,03
00,00
28,07
34,46
Экстракция с крем- Экстракция щелочным линиевым сорбентом
зисом и нейтрализацией
Пороговые циклы (Ct)
00,00
00,00
00,00
29,64
47,44
00,00
00,00
31,30
00,00
31,64
29,91
00,00
00,00
00,00
00,00
35,43
00,00
00,00
Источники информации:
1. Патент РФ 2116795, 1998.
Фиг. 1
4
30,10
25,41
32,54
30,46
24,77
26,54
30,40
45,72
31,74
29,82
25,00
30,79
00,00
00,00
00,00
40,02
40,72
00,00
BY 15648 C1 2012.04.30
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
743 Кб
Теги
by15648, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа