close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15675

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 15675
(13) C1
(19)
G 01N 33/53 (2006.01)
ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ
ДИФТЕРИЙНОГО ТОКСИНА В ПРОБЕ
(21) Номер заявки: a 20090669 / u 20080904
(22) 2008.12.09
(43) 2010.08.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и
микробиологии" (BY)
(72) Авторы: Колодкина Валентина Леонидовна; Денисевич Татьяна Николаевна; Титов Леонид Петрович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии" (BY)
(56) ЭНГЛЕР К.Х. и др. // Клиническая
микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. - Т. 3. - № 2. С. 156-162.
RU 2127886 C1, 1999.
RU 2127883 C1, 1999.
RU 2143003 C1, 1999.
RU 2087911 C1, 1997.
RU 2113172 C1, 1998.
RU 2129276 C1, 1999.
BY 15675 C1 2012.04.30
(57)
Тест-система для выявления дифтерийного токсина в пробе, содержащая раствор биоконъюгата лошадиных антитоксических антител с коллоидным золотом и полоску нитроцеллюлозной мембраны, имеющую две зоны: на первой фиксированы моноклональные
мышиные антитела к фрагменту А дифтерийного токсина, на второй - антилошадиные антитела.
Фиг. 1
Изобретение относится к микробиологии и медицинской диагностике и может быть
использовано для выявления дифтерийной инфекции.
Определение дифтерийного токсина является основным в диагностике дифтерийной
инфекции. Многие методы его определения основаны на взаимодействии с антитоксиче-
BY 15675 C1 2012.04.30
скими антителами с последующей визуализацией образовавшегося комплекса. В качестве
меток используются ферменты (пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза) и коллоидное
золото. При использовании ферментных меток возникает необходимость в применении
дополнительных реагентов и оборудования. Применение коллоидного золота обеспечивает непосредственную визуализацию результатов.
Известна иммунохроматографическая тест-система для выявления дифтерийного токсина [1], включающая полоски нитроцеллюлозной мембраны (НЦМ), разделенные на тестовую и контрольную зоны, с нанесенными на них антителами и зону связывания,
содержащую биоконъюгат антитоксических антител с коллоидным золотом. В основе работы тест-системы лежит взаимодействие токсина с конъюгированными коллоидным золотом моноклональными мышиными антитоксическими антителами, миграция
образовавшегося комплекса по мембране и фиксация его на поликлональных лошадиных
антитоксических антителах тестовой зоны полоски. Тест-система позволяет определять
токсин в концентрации 0,5 нг/мл через 3 часа от начала исследования, является простой и
не требующей дополнительного оборудования. Однако тест-система является дорогостоящей из-за использования моноклональных антител в качестве детектирующих, кроме
того, производители не раскрывают подробности производства ее компонентов.
Задачей изобретения является разработка отечественной тест-системы определения
дифтерийного токсина, не уступающей по специфичности и чувствительности известной.
Технический результат достигается в тест-системе для выявления дифтерийного токсина в пробе, содержащей раствор биоконъюгата лошадиных антитоксических антител с
коллоидным золотом и полоску нитроцеллюлозной мембраны, имеющую две зоны: на
первой фиксированы моноклональные мышиные антитела к фрагменту А дифтерийного
токсина, на второй - антилошадиные антитела.
Предлагаемая тест-система для выявления дифтерийного токсина включает высокоспецифичные моноклональные мышиные антитела к фрагменту А дифтерийного токсина,
фиксированные на НЦМ, которые при взаимодействии с токсином, вырабатываемым коринебактериями в процессе роста на жидкой питательной среде, образуют комплекс, выявляемый при выдерживании в растворе биоконъюгата поликлональных лошадиных
антитоксических антител (детекторные антитела) с коллоидным золотом.
Тест-систему получают следующим образом.
На тестовую зону нитроцеллюлозной мембраны наносится 1 мкл моноклональных
мышиных антител к фрагменту А дифтерийного токсина в концентрации 1 мкг/мл. Моноклональные антитела имеют преимущества перед поликлональными, проявляющиеся в
отсутствии перекрестной реактивности.
Для контроля работоспособности тест-системы используют антилошадиные антитела
(концентрация 2 мкг/мл), наносимые в количестве 1 мкл на контрольную зону НЦМ. Контрольные антитела должны реагировать с лошадиными антителами, конъюгированными с
коллоидным золотом, вне зависимости от результата теста. Окрашивание в контрольной
зоне свидетельствует об адекватной работе биоконъюгата.
Для приготовления биоконъюгата pH коллоидного золота доводят до 8,2, добавив к
5 мл раствора 25 мкл 0,2М K2CO3. К полученному раствору коллоидного золота добавляют 125 мкл антител (концентрация 1 мг/мл) и перемешивают на магнитной мешалке
20 мин, добавляют 100 мкл 1 %-ного раствора ПЭГ М-20. Стабилизированный конъюгат
центрифугируют при 14000 об/мин 10 мин на микроцентрифуге. После центрифугирования надосадок сливают и осадок ресуспендируют в 1 мл буфера для биоконъюгата.
В качестве положительного контроля используется среда Игла MEM с добавлением
эмбриональной сыворотки КРС (20 %) и дифтерийного анатоксина (6 нг/мкл).
В качестве отрицательного контроля используется среда Игла MEM с добавлением
эмбриональной сыворотки КРС (20 %).
Пакетики из парафилма служат для размещения полоски при проведении реакции детектирования биоконъюгатом.
2
BY 15675 C1 2012.04.30
Тест-система работает следующим образом.
Полоску НЦМ помещают в пробирку с суспензией исследуемых коринебактерий и
инкубируют при 37 °С в течение 5 часов с периодическим помешиванием. В процессе инкубирования вырабатываемый микробами токсин соединяется с мышиными антитоксическими антителами, образуя комплекс антиген-антитело. После инкубации НЦМ извлекают
из суспензии, промывают прилагающимся буферным раствором и сушат. Смешивают в
лунках планшета для серологических реакций 15 мкл "золотистого красителя" и 60 мкл
раствора фосфатно-солевого буфера, pH 8,2, вкладывают просушенные полоски нитроцеллюлозной мембраны в пакетики из парафилма, добавляют разведенный краситель. Пакетики запечатывают и инкубируют 30-60 минут. Поликлональные антитоксические
антитела, конъюгированные с коллоидным золотом, будут реагировать с токсином, связанным с фиксированными на мембране моноклональными мышиными антителами, в результате чего полученный комплекс окрашивается в розовый цвет. При отсутствии
токсина образование комплекса не происходит, окрашивания нет.
На фиг. 1 представлена схема работы тест-системы при наличии токсина в пробе, где:
1 - тест-зона НЦМ;
2 - контрольная зона НЦМ;
3 - моноклональные мышиные антитоксические антитела;
4 - токсин;
5 - поликлональные лошадиные антитоксические антитела, конъюгированные с коллоидным золотом (КЗ);
6 - антивидовые лошадиные антитела.
На фиг. 2 представлена схема работы тест-системы при отсутствии токсина в пробе, где:
1 - тест-зона НЦМ;
2 - контрольная зона НЦМ;
3 - моноклональные мышиные антитоксические антитела;
5 - поликлональные лошадиные антитоксические антитела, конъюгированные с коллоидным золотом (КЗ);
6 - антивидовые лошадиные антитела.
Учет результатов реакции проводят визуально.
Появление двух пятен розового цвета на полоске (в тест- и контрольной зонах) интерпретируется как положительный результат.
На фиг. 3 представлена полоска НЦМ при положительном результате теста.
Появление одного пятна розового или красного цвета в контрольной зоне интерпретируется как отрицательный результат.
На фиг. 4 представлена полоска НЦМ при отрицательном результате теста.
Отсутствие пятен в контрольной зоне либо их наличие только в тест-зоне свидетельствует о неправильной постановке реакции или неисправности тест-системы.
На фиг. 5 и 6 представлены полоски НЦМ при неадекватной работе тест-системы.
Тест-система считается специфически активной при наличии выраженной реакции с
положительным контрольным раствором и отсутствием реакции с отрицательным контрольным раствором.
Заявляемая тест-система была испытана на 140 штаммах Corynebacterium diphtheriae, в
том числе 80 токсигенных.
Чувствительность заявляемой тест-системы составляет 100 % (95 % доверительный
интервал, 98,0÷100), специфичность 100 % (95 % доверительный интервал, 97,5÷100).
Источники информации:
1. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - 2001. - Том 3. - № 2. С. 156-162.
3
BY 15675 C1 2012.04.30
Фиг. 2
Фиг. 3
Фиг. 4
Фиг. 5
Фиг. 6
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
349 Кб
Теги
патент, by15675
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа