close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15797

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 15797
(13) C1
(19)
G 01N 33/487 (2006.01)
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СИНОВИТА
ДЕСТРУКТИВНОГО ПАТОГЕНЕЗА
(21) Номер заявки: a 20091064
(22) 2009.07.15
(43) 2011.02.28
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт механики металлополимерных систем имени В.А.Белого Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Пинчук Леонид Семенович; Чернякова Юлия Михайловна;
Усанов Сергей Александрович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт механики металлополимерных систем имени В.А.Белого Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) BY 9451 C1, 2007.
RU 2159434 C1, 2000.
RU 2229717 C1, 2004.
RU 2064187 C1, 1996.
BY 15797 C1 2012.04.30
(57)
Способ диагностики синовита деструктивного патогенеза, включающий пункцию синовиальной жидкости, отличающийся тем, что синовиальную жидкость подвергают денатурирующему электрофорезу в полиакриламидном геле, после чего в нем определяют
содержание фракции протеинов с молекулярной массой 50-75 кДа и фракции протеинов с
молекулярной массой 20 кДа и диагностируют синовит деструктивного патогенеза при
уменьшении содержания фракции протеинов с молекулярной массой 50-75 кДа и увеличении содержания фракции протеинов с молекулярной массой 20 кДа по сравнению с содержанием фракций протеинов с указанными молекулярными массами в синовиальной
жидкости здорового сустава.
Изобретение соответствует области диагностического исследования синовиальной
жидкости (СЖ) путем идентификации содержащихся в ней протеинов, в частности, по их
молекулярной массе (ММ).
Содержащаяся в суставах человека СЖ представляет собой многокомпонентную по
химическому составу и многоуровневую по пространственной структуре биологическую
среду. Ее основу составляют белково-полисахаридные комплексы, распределенные в слабом водном электролите. Этот коллоидный раствор загущен гиалуроновой кислотой
(ГУК), которую вырабатывают клетки синовиальной оболочки - синовиоциты. ГУК образует в белковом коллоидном растворе вторичную сшитую структуру, превращая его в
гель, имеющий повышенную вязкость и сильную адгезию к поверхности хряща. Слой СЖ
разделяет поверхности трения хрящей, снижает трение в суставе, демпфирует ударные
нагрузки на сустав и защищает хрящ от механических повреждений.
Синовиты (воспаления синовиальной оболочки, не распространяющиеся на остальные
ткани и элементы сустава) обусловливают изменение структуры СЖ, самым очевидным
из которых является снижение ее вязкости. Слой "разжиженной" СЖ имеет низкую несу-
BY 15797 C1 2012.04.30
щую способность и не препятствует касанию микровыступов на поверхностях трения
хрящей, что приводит к их ускоренному изнашиванию. Для диагностики синовитов важно
установить причину "разжижения" СЖ: вызвано ли оно недостатком ГУК или имеет более
серьезные причины, связанные с деструкцией протеинов белково-полисахаридного комплекса СЖ. Стандартные методы лабораторно-клинического анализа СЖ, направленные
преимущественно на определение химического и клеточного (синовиоцитограммы) составов СЖ, дают ограниченную информацию о состоянии белковой фракции СЖ [1]. Современная методология клинико-биохимической лабораторной диагностики, к сожалению,
отдает предпочтение анализам сыворотки крови, но не СЖ [2, 3]. Между тем патологические процессы, приводящие к повреждению структуры СЖ, могут быть локализованы в
полости сустава, не распространяясь на кровяное русло. Поэтому аналогами изобретения
выбраны способы тестирования СЖ.
Известен способ диагностики туберкулезного синовита [4], состоящий в определении
титров противотуберкулезных антител одновременно в СЖ и сыворотке крови пациента.
Полученные значения используют для расчета диагностического показателя по предложенной формуле.
Недостаток способа состоит в его значительной трудоемкости, связанной с проведением серологического исследования, в частности реакций непрямой гемагглютинации
(РИГА) и связывания комплемента (РСК).
Способ тестирования на наличие ревматического заболевания [5] предполагает изучение в поляризованном свете высушенных препаратов СЖ и сыворотки крови. Путем сравнения образующихся при высушивании текстур, имеющих вид по-разному распределенных
сферолитных и дендритных образований, диагностируют остеоартроз, ревматоидный или
реактивный артрит.
Такой способ базируется на субъективной качественной оценке внешнего вида текстур, в большой мере зависящего от условий приготовления и хранения препаратов.
Способ прогнозирования объема предстоящей синовэктомии [6] основан на оценке активности воспалительного процесса в коленном суставе, которую делают, анализируя синовиоцитограммы СЖ. Затем с учетом длительности воспалительного процесса в суставе
по предложенной формуле определяют целесообразность хирургического удаления менисков и синовиальной оболочки.
Недостатком способа является невозможность установления этиологии и патогенеза
заболевания.
Прототипом изобретения выбран способ диагностики ревматического заболевания [7].
Он состоит в том, что образец СЖ подвергают электретно-термическому анализу, регистрируя спектр термостимулированных токов (ТСТ), возникающих при разрушении химических связей (меж- и внутримолекулярных) в комплексных соединениях СЖ. Тепловое
разрушение связей происходит в процессе нагревания образца с постоянной скоростью.
По величине и расположению токовых пиков на шкале температур определяют ревматоидный артрит, хронический или острый синовит. По спектрам ТСТ можно судить также о
вероятности деструкции протеиновых макромолекул, составляющих основу СЖ.
Недостатки прототипа:
невозможность определения количественных показателей молекулярно-массового
распределения (ММР) протеинов;
недостаточная воспроизводимость результатов электретно-термического анализа жидкостей, зависящая от множества методических факторов подготовки образцов и проведения эксперимента;
регистрируемые способом-прототипом косвенные характеристики ММР всегда менее
информативны, чем прямые измерения ММ исследуемых протеинов.
Задачи, на решение которых направлено изобретение:
2
BY 15797 C1 2012.04.30
1) выбрать из совокупности физико-химических методов определения ММР полимеров (осмометрия, эбулиоскопия, скоростная седиментация, фракционирование, адсорбционная тонкослойная и гель-проникающая хроматография, деструкционный метод и др.)
оптимально информативный и подходящий для изучения СЖ (по критериям вязкости и
диапазона ММ содержащихся в ней протеинов) метод, который может быть применен для
клинической диагностики деструкции протеинов СЖ;
2) определить, существенно ли влияние ММ ГУК на оценку ММР протеинов СЖ, взятой из суставов с разной патологией;
3) определить ММ продуктов патологической деструкции протеиновых молекул СЖ
при синовитах, фракция которых служила бы маркером этого деструктивного процесса.
Поставленные задачи решаются тем, что делают пункцию синовиальной жидкости,
которую подвергают электрофорезу в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия, и регистрируют адсорбцию двух фракций протеинов с ММ = 50-75 и ММ ≤ 20 кДа.
Уменьшение содержания первой и рост второй по сравнению с содержанием фракций
протеинов с указанными молекулярными массами в синовиальной жидкости здорового
человека служат диагностическим признаком синовита деструктивного патогенеза.
Сущность изобретения состоит в следующем:
1. Денатурирующий электрофорез характеризуется наивысшей на сегодняшний день
разрешающей способностью по сравнению с другими методами определения ММР протеинов [8]. Он наиболее информативен для изучения белковых фракций в диапазоне молекулярных масс 14 ÷ 170 кДа. Именно этому диапазону соответствует ММР протеинов
СЖ. Вязкость СЖ (0,5-0,7 Па⋅с) [1] оптимально подходит для диффузии фракций протеинов по порам полиакриламидного геля.
2. Основная для здоровой СЖ фракция высокомолекулярных протеинов с ММ = 5570 кДа может подвергаться при синовитах деструкции воспалительного или иммунного
патогенеза. Деструкция обусловливает разрыв молекулярных цепей и рост аномальной
фракции макромолекул с ММ ~ 20 кДа, которая не свойственна здоровой СЖ и существует в ней в виде следов.
3. Денатурирующий электрофорез оказался удобным и высокоинформативным методом регистрации роста деструктивной и уменьшения здоровой фракций протеинов СЖ.
При выборе методики контроля ММР протеинов СЖ исходили из следующих соображений:
протеины после обработки додецилсульфатом натрия (sodium dodecyl sulfate, SDS) переходят в денатурированное состояние [8];
количество молекул SDS, связывающихся с макромолекулой протеина, пропорционально ее длине и, следовательно, ее ММ;
собственный заряд денатурированной макромолекулы протеина несущественен по
сравнению с отрицательным зарядом связанных с ней молекул SDS [9].
Это идеально подходит для предварительной обработки полимолекулярных протеинов
СЖ и последующего контролируемого электрофоретического распределения их по фракциям. В качестве базового метода для диагностики патогенеза синовитов по ММР СЖ был
выбран денатурирующий электрофорез.
Примеры осуществления способа.
В экспериментах использовали СЖ, полученную из коленных суставов (условно здоровых и с разной патологией) при проведении лечебно-диагностических пункций, а также
донорскую сыворотку крови, изготовленную на станции переливания крови. Условно здоровой считали СЖ, взятую при артроскопии у соматически здоровых пациентов при отсутствии патологии сустава. При аспирациях СЖ были соблюдены этические нормы и
правила, установленные на 18-й (Хельсинки, 1964) и 41-й (Гонконг, 1989) World Medical
Assamblies.
3
BY 15797 C1 2012.04.30
Электрофорез исследуемых жидкостей выполняли с помощью прибора mini Protean II
Electrophoretic Cell (фирма "Bio-Rad", США) по методике, описанной в [9]. Согласно способу-прототипу [7] проводили электретно-термический анализ тех же жидкостей. Результаты экспериментов представлены на фигуре.
На фигуре приведены фотографии колонок с полиакриламидным гелем, в котором
диффузионно распределены окрашенные фракции протеинов. В колонки были введены
следующие жидкости: 1 - стандартные белковые маркеры (набор белков фирмы "Pharmacia", Швеция), 2 - сыворотка крови, 3 - условно здоровая СЖ, 4 и 5 - СЖ из суставов с
асептическими гемосиновитами-хроническим воспалительным и посттравматическим.
Анализ результатов денатурирующего электрофореза этих жидкостей приводит к следующим заключениям.
1. ММР протеинов в сыворотках крови (2) всех групп (фото всех колонок с сыворотками не приведены ввиду их абсолютной идентичности) и в условно здоровой СЖ (3)
практически одинаково. Следовательно, наличие в СЖ, основу которой составляет диализат крови, ГУК даже в ощутимой концентрации (~ 3 г/л [1]) не влияет на ММР протеинов,
регистрируемое высокочувствительным методом. Основной фракцией в образцах 2 и 3
являются протеины с ММ = 55-70 кДа.
2. В образце 4 (СЖ из сустава с хроническим воспалительным гемосиновитом) значительно увеличилась фракция протеинов с ММ ~ 20 кДа, которой соответствует интенсивная полоса, появившаяся в нижней части колонки. В здоровой СЖ (3) эта фракция
присутствует лишь в виде следов. Одновременно заметно уменьшилось (по сравнению с
образцом 3) содержание основной для СЖ и сыворотки фракции протеинов с ММ = 5570 кДа. Это служит прямым доказательством патологического разрушения протеиновых
макромолекул при хроническом воспалительном гемосиновите. Итак, диагностическим
маркером синовитов деструктивного патогенеза является усиление в ММР СЖ фракции
протеинов с ММ ~ 20 кДа.
3. Подобное явление нехарактерно для суставов с посттравматическим синовитом (5).
ММР протеинов в такой СЖ близко к нормальному, характерному для здоровой СЖ,
фракция протеинов с ММ ~ 20 кДа присутствует в ней в виде следов. Следовательно, патогенез такого синовита связан с недостатком выработки ГУК синовиальной оболочкой.
Можно представить, что такая СЖ еще не потеряла способности выполнять присущие ей
трибологическую, метаболическую, трофическую и защитную функции [1].
Снятые способом-прототипом [7] спектры ТСТ жидкостей 4 и 5 практически идентичны и не несут информации о патогенезе синовитов. Это свидетельствует, что предложенный способ превосходит способ-прототип по сведениям о механизмах развития синовитов
деструктивного патогенеза и патологических процессов, обусловливающих разрыв протеиновых цепей при этих заболеваниях.
Предложенный способ найдет применение в клинико-диагностических лабораториях
поликлиник и больниц как средство биохимической лабораторной диагностики заболеваний опорно-двигательного аппарата.
Источники информации:
1. Павлова В.Н. Синовиальная среда суставов. - М.: Медицина, 1980. - С. 296.
2. Камышников В.С. Справочник по клинико-биохимической лабораторной диагностике: В 2-х т. 2-е изд. - Минск: Беларусь, 2002. Т. 1. - С. 495, Т. 2. - С. 463.
3. Лифшиц В.М., Сидельникова В.И. Медицинские лабораторные анализы: Справочник. - М.: Триада-Х, 2000. - С. 312.
4. Патент РФ 2064187, МПК G 01N 33/53, 1997.
5. Патент РФ 2173462, МПК G 01N 33/48, 33/68, 2001.
6. Патент РФ 2180118, МПК G 01N 33/53, 2002.
4
BY 15797 C1 2012.04.30
7. Патент РБ 9451, МПК A 61B 5/05, G 01N 33/487, 27/06, 2007 (прототип).
8. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез
и ультрацентрифугирование (практическое пособие). - М.: Наука, 1981. - С. 288.
9. Побежимова Е.П., Колесниченко А.В., Грабельных О.И. Методы изучения митохондрий растений. Полярография и электрофорез. - М.: ООО "НПК Промэкобезопасность", 2004. - С. 98.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
455 Кб
Теги
by15797, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа