close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15836

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 15836
(13) C1
(19)
C 07K 5/107
C 07K 1/06
(2006.01)
(2006.01)
ПЕПТИДНЫЙ СУБСТРАТ ДЛЯ СВЯЗЫВАНИЯ Fc-ФРАГМЕНТА
ИММУНОГЛОБУЛИНА КЛАССА G
(21) Номер заявки: a 20100273
(22) 2010.02.25
(43) 2011.10.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Лапко Анастасия Викторовна; Макаревич Денис Александрович; Мартинович Вера Павловна;
Голубович Владимир Петрович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) JP 2004189658 A, 2004.
US 7408030 B2, 2008.
WO 02/32934 A1.
BY 15836 C1 2012.04.30
(57)
Пептидный субстрат формулы Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe для связывания Fc-фрагмента
иммуноглобулина класса G.
Данное изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к новому пептидному субстрату формулы Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe (где Phe - фенилаланин; Gln глутамин; Tyr-OMe - тирозин метиловый эфир), который может связываться с Fcфрагментом иммуноглобулинов класса G подобно нативному протеину A клеточной стенки Staphylococcus aureus.
Протеин A клеточной стенки Staphylococcus aureus участвует во многих защитных
биологических функциях, включая противоопухолевую и токсическую, действует как иммуномодулятор, способен вызывать ответ типа Th1, приводящий к производству цитокинов, используется в методах иммуноадсорбции для лечения протеинурии при
нефротическом синдроме и серьезных аутоиммунных заболеваний и др. [1].
Наиболее распространенными субстратами, используемыми в клинической практике,
являются нативный протеин A и B-домен протеина A [2]. Однако они имеют достаточно
высокую рыночную стоимость и получение этих субстратов характеризуется сложностью
и специфичностью. Аналогов заявляемого пептидного субстрата не выявлено.
Задача изобретения - создание нового пептидного субстрата (тетрапептида) с формулой Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe. Заявляемый пептидный субстрат может быть использован для
удаления иммуноглобулинов класса G из биологических жидкостей человека и может
найти практическое применение в медицинской практике.
Для решения данной задачи с помощью методов теоретического конформационного
анализа отобрана структура заявляемого тетрапептида, аминокислотные остатки которого
входят в состав активного центра протеина A, обеспечивающего его связывание с Fc-
BY 15836 C1 2012.04.30
фрагментом иммуноглобулинов класса G, и осуществлен синтез заявляемого пептидного
субстрата.
Способ получения заявляемого пептидного субстрата приведен в примере 1.
Пример 1.
Синтез пептидного субстрата Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe.
Пептид Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe получают с использованием классических методов пептидного синтеза. Основной метод образования пептидной связи - карбодиимидный, в качестве конденсирующего агента используют диизопропилкарбодимид, противорацемической добавки - 1-оксибензотриазол. Для блокирования α-аминогрупп используют
третбутилоксикарбонильную защиту. Ее отщепление проводят обработкой пептидов 3,5 5,0 н. раствором HCl в этилацетате. Карбоксильные группы блокируют путем образования
метиловых эфиров.
Структура синтезированных пептидов подтверждена методами масс-спектрометрии,
аминокислотного анализа, ВЭЖХ, ТСХ.
Масс-спектры целевых пептидов получают на масс-спектрометре PE SCIEX APl
150EX (Perkin Elmer, США) с использованием Turboionspray источника ионов. Аналитическую ВЭЖХ синтезированных соединений проводят на хроматографе фирмы Waters
(Millenium32, 966 фотодиодный детектор, колонка Vydac 201HS52 RP C18 (2.1·250 мм)).
Используемый градиент концентраций от 10 до 40 % ацетонитрила в воде с добавлением
0,1 % TFA. Скорость потока 1 мл/мин.
Тонкослойную хроматографию проводят на пластинках "Сорбфил", Россия.
Хроматографические подвижности приведены в системах:
(А) - хлороформ/метанол 6:1;
(Б) - хлороформ/метанол 6:1;
(В) - бутанол/уксусная кислота/вода, 40:10:10.
Удельное вращение опредяют на спектрополяриметре J-20 ("Jasco", Япония).
Температуры плавления определяют на приборе Кофлера.
Разработанная схема синтеза включает 6 синтетических стадий.
(I) Получение Nα-третбутилоксикарбонил-фенилаланил-тирозина метилового эфира
(Boc-Phe-Tyr-OMe).
0,536 г (1,2 ммоль) дициклогексиламмонийной соли третбутилоксикарбонил-фенилаланина и 0,287 г (1,2 ммоль) гидрохлорида метилового эфира тирозина растворяют в 3 мл
смеси хлористого метилена и ДМФ 1:1, затем раствор охлаждают до 0 °С и прибавляют
последовательно 0,19 г (1,25 ммоль) НОВТ и 0,258 г (1,25 ммоль) ДЦГК. Реакционную
смесь перемешивают 1 час при охлаждении и 6 часов при комнатной температуре. После
окончания реакции осадок ДЦГМ отфильтровывают, промывают на фильтре 1 мл ДМФ. В
фильтрат добавляют 30 мл этилацетата, и полученный раствор промывают 9 %-ным раствором лимонной кислоты, 5 %-ным раствором NaHCO3, водой, сушат над Na2SO4. После
отгонки этилацетата образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира гексаном и сушат над P2O5. Выход - 0,44 г (86 %) Boc-Phe-Tyr-OMe в виде белого кристаллического порошка. [α]20D - 7,0° (C 1, MeOH); Т. пл. 83-87 °С Rf 0,76 (A), 0,77 (B).
(II) Получение фенилаланил-тирозина метилового эфира, гидрохлорида (Phe-TyrOMe·HCl).
К 0,39 г (0,9 ммоль) Boc-Phe-Tyr-OMe прибавляют 4 мл HCl в этилацетате, прозрачный раствор перемешивают 30 мин магнитной мешалкой, затем упаривают на роторном
испарителе, остаток промывают эфиром (трижды), сушат в вакуум-эксикаторе над P2O5.
Выход Phe-Tyr-OMe-HCl - 0,30 г (92 %). [α]20D + 11,0° (C 1, MeOH); Т. пл. 63-67 °С Rf 0,29
(A), 0,44 (B).
(III) Получение Nα-третбутилоксикарбонил-глутаминил-фенилаланил-тирозина метилового эфира (Boc-Gln-Phe-Tyr-OMe).
2
BY 15836 C1 2012.04.30
К раствору 0,270 г (0,75 ммоль) гидрохлорида метилового эфира фенилаланилтирозина в 2,5 мл ДМФ прибавляют 0,11 мл N-метилморфолина (1,0 ммоль). Реакционную
смесь перемешивают в течение 20 минут, затем прибавляют 0,197 г (0,80 ммоль) третбутилоксикарбонил-глутамина. После охлаждения до 0 °С в реакционный сосуд вносят последовательно 0,14 г (0,9 ммоль) НОВТ и 0,165 г (0,8 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь
перемешивают в течение 2 ч при 0 °С и 5 ч при комнатной температуре. После окончания
реакции осадок ДЦГМ отфильтровывают, промывают на фильтре 1 мл ДМФ. В фильтрат
добавляют 30 мл этилацетата, и полученный раствор промывают 9 %-ным раствором лимонной кислоты, 5 %-ным раствором NaHCO3, водой, сушат над Na2SO4. После отгонки
этилацетата образовавшийся маслообразный остаток переосаждают из эфира гексаном и
сушат над P2O5. Выход - 0,33 г (80 %) Boc-Gln-Phe-Tyr-OMe, [α]20D - 22,0° (C 1, MeOH); Т.
пл. 108-109 °С Rf 0,76 (Б), 0,71 (В).
(IV) Получение гутаминил-фенилаланил-тирозина метилового эфира, гидрохлорида
(Gln-Phe-Tyr-OMe·HCl).
К 0,30 г (0,54 ммоль) Boc-Gln-Phe-Tyr-OMe прибавляют 3 мл НСl в этилацетате, реакционную смесь встряхивают на шейкере в течение 30 мин, затем прибавляют 5 мл эфира.
С образовавшегося гигроскопичного осадка сливают надосадочную жидкость, промывают
его эфиром (3x3 мл), сушат в вакуум-эксикаторе над Р205. Выход Gln-Phe-Tyr-OMe·HCl 0,24 г (91 %). [α]20D - 6,0° (C 1, MeOH); Rf 0,26 (Б), 0,38 (В).
(V). Получение Nα-третбутилоксикарбонил-фенилаланил-глутаминил-фенилаланилтирозина метилового эфира (Boc-Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe).
0,223 г (0,5 ммоль) дициклогексиламмонийной соли третбутилоксикарбонил-фенилаланина и 0,221 г (0,45 ммоль) гидрохлорида метилового эфира тирозина растворяют в 2
мл смеси хлористого метилена и ДМФ 1:1, затем раствор охлаждают до 0 °С и прибавляют последовательно 0,093 г (0,5 ммоль) НОВТ и 0,103 г (0,5 ммоль) ДЦГК. Реакционную
смесь перемешивают 1 час при охлаждении и 6 часов при комнатной температуре. После
окончания реакции осадок ДЦГМ отфильтровывают, промывают на фильтре 0,1 мл хлористого метилена. Затем хлористый метилен упаривают, к диметилформамидному раствору прибавляют 10 мл эфира. Выпавший объемный осадок отделяют фильтрованием,
промывают эфиром (2×2мл). После сушки в вакуум-эксикаторе над Р2О5 получают 0,25 г
(79 %) Boc-Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe, [α]20D - 28,0° (C 1, MeOH); Т. пл. 113-116 °С Rf 0,86 (Б),
0,65 (В).
(VI) Получение заявляемого тетрапептида фенилаланил-глутаминил-фенилаланилтирозина метилового эфира, гидрохлорида (Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe·HCl).
К 0,218 г (0,31 ммоль) Boc-Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe прибавляют 2,5 мл НСl в этилацетате, реакционную смесь встряхивают на шейкере в течение 30 мин, затем прибавляют 4 мл
эфира. С образовавшегося гигроскопичного осадка сливают надосадочную жидкость,
промывают его эфиром (3x3 мл), петролейным эфиром (2x3 мл), сушат в вакуумэксикаторе над Р205. Выход Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe·HCl - 0,186 г (94 %) в виде белого объемного мелкокристаллического порошка. [α]20D - 16,0° (C 1, MeOH); Rf 0,41 (Б), 0,47 (Д).
Активность заявляемого тетрапептида Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe подтверждена исследованиями аффинности связывания с Fc-фрагментом иммуноглобулинов G, приведенными в
примере 2.
Пример 2.
Определение аффинности связывания пептидного субстрата с Fc-фрагментом иммуноглобулинов класса G.
Для оценки соответствия функции связывания синтезированного тетрапептидного
аналога активного центра протеина A Staphylococcus aureus с Fc-фрагментом иммуноглобулинов использовался иммуноферментный анализ [3]. В качестве иммуноферментной
тест-системы был использован набор "IgG общий - ИФА - БЕСТ" фирмы "Вектор Бест"
(Новосибирск, Россия), предназначенный для иммуноферментного определения концен3
BY 15836 C1 2012.04.30
траций общего иммуноглобулина класса G (IgG) в сыворотке крови и других биологических жидкостях человека в клинических, диагностических и научно-исследовательских
лабораториях.
Непосредственно перед проведением анализа получают комплекс заявляемого тетрапептида с Fc-фрагментом общего IgG в различных молярных соотношениях 4:1; 2:1; 1:1;
0,5:1; 0,25:1; 0,125:1; 0,064:1 соответственно. Комплекс инкубируют при 37 °С в течение
30 минут. Анализ проводится в две стадии. На первой стадии калибровочные образцы с
известной концентрацией IgG и анализируемые образцы комплекса тетрапептид - Fcфрагмент IgG, а также контрольные образцы (нулевой контроль и контрольный образец
IgG) инкубируются в лунках стрипированного планшета с иммобилизованными моноклональными антителами (MAb1) к тяжелым цепям IgG. Затем планшет отмывается промывочным буфером. На второй стадии связавшийся в лунках IgG обрабатывается
конъюгатом MAb2 к легким (лямбда и каппа) цепям иммуноглобулинов человека с пероксидазой. После отмывания избытка указанного конъюгата образовавшиеся иммунные
комплексы "иммобилизованные MAb1 - IgG-конъюгат" выявляются ферментативной реакцией пероксидазы с перекисью водорода в присутствии хромогена (тетраметилбензидина). Интенсивность окраски хромогена пропорциональна концентрации IgG в
анализируемом образце и обратно пропорциональна количеству образовавшегося комплекса антитела с тетрапептидом. После остановки пероксидазной реакции стопреагентом результаты учитываются фотометрически. Концентрацию связавшегося IgG в
образцах определяют по калибровочному графику.
Проведенный анализ показал, что существует определенная зависимость процента
связывания IgG с иммобилизованными моноклональными антителами в присутствии тетрапептида в различных соотношениях. Установлено, что при увеличении молярного соотношения в сторону IgG процент ингибирования Fc участка также растет и достигает плато
при соотношении 1:1.
Полученные данные свидетельствуют о том, что при проведении иммуноферментного
анализа образуется устойчивый комплекс Fc-фрагмента иммуноглобулина G и синтезированного тетрапептида, который не связывается с иммобилизованными антителами. Таким
образом, заявляемый тетрапептид Phe-Gln-Phe-Tyr-OMe является функционально активным в отношении Fc-фрагмента иммуноглобулина G и может найти применение в медицине для проведения иммуносорбционной терапии, при выделении и очистке антител, а
также в качестве субстрата и реагента в научных экспериментах.
Источники информации:
1. Forsgren A. // Infection and immunity. - 1970. - Vol. 2. - No. 5. - P. 672-673.
2. Starovasnik M.A., O'Connell M.P., Fairbrother W.J., Kelley R.F. // Protein Scince. 1999. - Vol. 8. - P. 1423-1431.
3. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М. - М.: Высшая школа,
1991. - 288 с.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
85 Кб
Теги
патент, by15836
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа