close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15946

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 15946
(13) C1
(19)
(46) 2012.06.30
(12)
(51) МПК
B 01D 15/10
G 01N 30/60
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
(2006.01)
(2006.01)
УСТРОЙСТВО ДЛЯ КОЛОНОЧНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
(21) Номер заявки: a 20100250
(22) 2010.02.22
(43) 2011.10.30
(71) Заявитель: Учреждение образования
"Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский
университет" (BY)
(72) Авторы: Генералов Игорь Иванович; Генералова Анжелика Геннадьевна; Железняк Наталья Васильевна (BY)
(73) Патентообладатель: Учреждение образования "Витебский государственный
ордена Дружбы народов медицинский
университет" (BY)
(56) US 4451365, 1984.
WO 96/26436 A1.
US 4840730, 1989.
RU 94044940 A1, 1996.
SU 307335, 1971.
BY 15946 C1 2012.06.30
(57)
Устройство для колоночной хроматографии, содержащее колонки для матриц и раствора элюента, каждая из которых включает выходной колоночный фильтр; стойку с центральной осью, на которой установлены муфты со стопорными винтами и две или более
кассеты, каждая из которых выполнена в форме барабана с гнездами для колонок и отверстиями для головки стопорного винта, причем муфты со стопорными винтами установлены с возможностью регулирования высоты размещения кассет с колонками, а колонки из
разных кассет соединены между собой соединительными трубками.
Фиг. 1
Фиг. 2
BY 15946 C1 2012.06.30
Изобретение относится к биологии, медицине и биотехнологии и может быть использовано для проведения любого вида колоночной хроматографии низкого давления (аффинной хроматографии, быстрой гель-фильтрации, ионообменной и обращенно-фазовой
хроматографии) на матрицах различного происхождения одновременно на многих колонках.
Существующие колонки для хроматографии низкого давления представляют собой
стеклянный или полимерный цилиндрический сосуд или трубку различного диаметра и
длины с суженным выходным отверстием, где находится мелкопористая мембранафильтр. Устройство чаще всего располагается вертикально. К нижнему выходному отверстию присоединяется трубка для отвода жидкости. Колонка заполняется гранулами матрицы (твердой фазы) и проводится соответствующая хроматография путем тока жидкости
сверху вниз под действием силы тяжести или под действием невысокого избыточного
гидростатического давления. Для одновременной обработки нескольких образцов набор
колонок помещается в прямоугольную стойку-кассету с расположением колонок вертикально в одном ряду.
Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является устройство для
"grаvitу"-хроматографии фирмы "Bio-Rad" [1]. Оно представляет собой набор полимерных
цилиндрических колонок, помещенных вертикально в прямоугольную стойку. Колонки
имеют узкое выходное отверстие, где находится мелкопористая мембрана, на которую наслаивают гранулы матрицы. К нижнему выходному отверстию присоединяется трубка для
отвода элюента в коллектор фракций различного типа (в рутинных случаях - штатив с
пробирками необходимых объемов).
Устройство имеет определенные недостатки.
В частности, общее количество колонок (и, соответственно, проб) в такой кассете
обычно не превышает 6-8. Даже это условие выполняется только в случае элюирования
образца в 1-2-приемные емкости (пробирки или флаконы), например, при обессоливании
пробы или выхода одной известной ее фракции. При сборе же многих фракций для каждой из колонок кассеты общее количество одновременно анализируемых проб обычно не
превышает 3-4. Это связано с невозможностью размещения перед кассетой более 3-4 мини-коллекторов фракций или длинных рядов емкостей для сбора проб. Возможно удлинение соединительных выходных трубок колонок с размещением большего количества
штативов. Однако это увеличивает нерабочий объем колонок, что приводит к разбавлению пробы и ухудшает разделение.
Размещение колонок в кассете-прототипе является жестко фиксированным. Отсюда
нет возможности использовать для процесса хроматографии перемещаемый коллектор
фракций. Также это не позволяет при необходимости проводить последовательную элюцию материала из одной колонки в несколько разных резервуаров, расположенных на
удалении друг от друга.
Кроме того, вышеприведенный вариант хроматографии включает лишь одну стадию
разделения или очистки образца на матрице, что значительно ограничивает его применение. Устройство не предусматривает последовательного использования нескольких матриц для многостадийной очистки одной и той же пробы.
Также возникают трудности при быстрой смене элюента во время хроматографии в
такой системе. При этом объем вводимой жидкой фазы в колонки существенно ограничен
из-за невозможности произвольно менять их длину и объем.
Задачей изобретения является разработка устройства для колоночной хроматографии,
позволяющего одновременно проводить хроматографию многих проб через несколько
матриц.
Реализация данной задачи достигается путем создания кассетного устройства барабанного типа для колоночной хроматографии, что делает возможным перемещение (пово-
2
BY 15946 C1 2012.06.30
рот) колонок в кассете от 0 до 360 °С возможностью фиксации их в определенном положении.
Изобретение поясняется следующими графическими материалами.
На фиг. 1 изображен однокассетный вариант устройства для колоночной хроматографии. На фиг. 2 изображен двухкассетный вариант устройства.
Устройство для колоночной хроматографии (фиг. 1 и 2) состоит из стойки-держателя
для кассет с центральной осью (3), жестко закрепленной в основании стойки (4); набора
кассет барабанного типа (1) с гнездами (2) для колонок (7) или фильтрационных патронов.
В колонках (7) находится раствор элюента (9) и матрица (сорбент) для хроматографии (8),
помещенная на выходной колоночный фильтр (11).
Кассеты барабанного типа (1) устанавливают в необходимом положении на центральной оси (3) стойки, располагая на опорной муфте с резьбой. Опорную муфту (6А) фиксируют на оси (3) при помощи стопорного винта. Головку винта (6Б) помещают в одно из
фиксирующих отверстий (5) кассет (1)(фиг. 1, 2).
Колонки из разных кассет (1) соединены между собой соединительными трубками
(10) (фиг. 1, 2).
На фиг. 1 приведен базовый вариант устройства, который предназначается для проведения одностадийной колоночной хроматографии (для обессоливания образца, смены буферной системы, удаления низкомолекулярных примесей и т.д.).
В предложенном варианте колонки с матрицей-сорбентом (8) помещают в гнезда барабана (2). Кассету (1) фиксируют на необходимой высоте на стойке (3) стопорным винтом опорной муфты, при этом головку винта помещают в одно из фиксирующих
отверстий кассеты (5), расположенных на нижней плоскости барабана у оси стойки (3).
Фиксация головки винта краями отверстия обеспечивает устойчивое положение кассеты с
колонками. При необходимости кассету приподнимают над стопорным винтом, перемещают на необходимый угол и устанавливают на ближайшее к винту фиксирующее отверстие. Таким образом, кассету устанавливают в положении, наиболее удобном для работы
оператора. Ось стойки устройства жестко закрепляют на основании (4). Конец выходной
трубки колонки (7) помещают в ряд пробирок или флаконов, размещенных в штативе или
коллекторе фракций. Штативы с пробирками для фракций размещают под колонкой, перемещая их в радиальном направлении. Это не препятствует сбору фракций из соседних
колонок.
На фиг. 2 приведен типовой вариант устройства для многостадийной хроматографии,
предназначенного для проведения любых видов колоночной хроматографии низкого давления с использованием нескольких матриц и элюентов. В этом случае барабаны кассет
(1) размещают один над другим в необходимом количестве (в приведенном примере - 2
кассеты). Колонки (7) из разных кассет соединяют между собой полимерными трубками
(10), через которые проходит элюент (9).
Комбинируя общее число барабанных кассет, различные матрицы для хроматографии,
концентрирующие патроны, емкости с буферами и элюентами возможно подобрать условия, при которых многостадийный вариант хроматографии, обеспечивающий эффективный выход целевого компонента смеси, может быть выполнен в условиях одного
эксперимента. Это сокращает продолжительность очистки и сохраняет нативность разделяемых соединений.
Работу данной системы ускоряют посредством оснащения ее насосом, увеличивающим гидростатическое давление в системе и скорость потока элюента (если матрицы колонок выдерживают избыточное рабочее давление). Принцип действия такой системы
может быть использован и для ВЭЖХ-разделения смесей при условии применения соответствующих колонок и рабочих давлений.
3
BY 15946 C1 2012.06.30
Примеры осуществления способа.
Базовый вариант устройства использовали для предварительной очистки поликлональных IgG из сыворотки крови человека раствором риванола (2-этокси-6,9диаминоакридина лактата) [2]. Одновременно обрабатывалось 6-8 образцов крови. Очистку проводили следующим образом.
1. Кровь в количестве 1-3 мл без добавления антикоагулянта инкубировали в течение
2 часов при температуре 4 °С до образования сгустка. Затем центрифугировали 10-15 минут в центрифужных пробирках в центрифуге с бакетным ротором (1500 об/мин). Аккуратно забирали чистую сыворотку.
2. К сыворотке прибавляли охлажденный до 4 °С 0,75 % раствор риванола в соотношении 1 объем риванола к 2 объемам сыворотки. Смесь инкубировали при температуре
4 °С не менее 2 часов.
3. Осадок отбрасывали. Риванол из надосадочной жидкости удаляли гель-фильтрацией
на мелкопористой декстрановой матрице Молселект ПО (элюент - 0Д5М раствор хлорида
натрия на 0,01М ФБР pH 7,2-7,4).
Для этого декстрановую матрицу размещали в полипропиленовой колонке объемом
12-14 мл, диаметром 10 мм, объем сорбента составлял 8-10 мл. Колонки (до 8-10 шт.) помещали в гнезда кассет, элюцию проводили со скоростью 10-15 капель в минуту. Окончание разделения контролировали визуально по окрашенному переднему фронту
прохождения риванола через выход колонки.
При помощи предлагаемого устройства удалось провести удаление избытка риванола
из реакционной смеси в течение 10-15 минут, при этом все пробы легко контролировались
во время работы.
Вариант использования типового устройства для многостадийной хроматографии выполняли следующим образом.
Проводили дальнейшую очистку IgG из сыворотки человека, которую предварительно
обрабатывали раствором риванола (см. выше).
1. Полученный после обработки риванолом препарат IgG подвергали DEAEхроматографии на матрице Toyopearl HW 65OM или Молселект DEAE A50, уравновешенной 0,01М фосфатным буфером pH 7,4 со скоростью 0,3 мл/мин.
Для этого колонки с анионообменником помещали в гнезда верхней кассеты. Через
анионит пропускали препарат IgG, который далее поступал по соединительным трубкам в
соответствующие колонки нижней кассеты, заполненные агарозой, конъюгированной с
рекомбинантным протеином А золотистого стафилококка. Данная матрица является аффинным сорбентом для иммуноглобулинов класса G.
Через колонки пропускали весь объем препарата IgG и затем такой же объем 0,005М
фосфатного буфера pH 7,4.
2. После окончания этапа верхние колонки с анионитом отсоединяли от колонок нижней кассеты и заменяли на резервуары с промывочными буферами и элюентом в верхнем
барабане.
После этого нижние колонки последовательно промывали 0,1М фосфатным буфером
рН 7,4 с 1 % раствором тритона Х-305, а затем без детергента в количестве 5-6 объемов
колонки до исчезновения белка в элюенте.
3. Элюцию связавшихся иммуноглобулинов класса G (G1, G2, G4) вели 0,05М глицинHCl буфером pH 2,8 на 0Д5М растворе NaCl до исчезновения белка в элюенте (отбирали
отдельно фракции по 1,5-2 мл). Фракции, содержащие наиболее высокие концентрации
белка, объединяли. Их нейтрализовали 1М раствором Трис pH 9,0 до pH 7,0-7,5. Концентрацию белка в полученных образцах определяли спектрофотометрически на длине волны
280 нм.
4. Нижние колонки, заполненные агарозой, конъюгированной с рекомбинантным протеином А золотистого стафилококка, после элюции промывали 0,1 фосфатным буфером с
4
BY 15946 C1 2012.06.30
1 % раствором тритона Х-305 pH 7,4 в количестве, равном 10-15 объемам колонки, а затем
0,01М фосфатным буфером без детергента с pH 7,4 в количестве, равном 10-20 объемов
колонки, для регенерации матрицы.
5. Проверка чистоты полученных препаратов иммуноглобулинов с помощью иммуноэлектрофореза и диссоциирующего электрофореза в полиакриламидном геле в системе
буферов по Laemmli с окраской Кумасси ярким голубым R250 [3] подтвердила их гомогенность.
Таким образом, предложенные варианты устройства в сравнении с прототипом обеспечивают проведение одновременной хроматографии большего количества проб (не менее
чем в 1,5-2 раза). При этом максимальное количество колонок в кассетах ограничено
только диаметром кассет (или их площадью при мозаичном расположении гнезд для колонок), а также наружным диаметром самих колонок (микроколонок, фильтрационных
патронов). Их может быть 10 и более, что позволяет проводить одновременную хроматографию соответствующего количества проб.
Комбинация двух и более кассет обеспечивает последовательную хроматографию
проб через несколько матриц. Это позволяет выполнить многостадийный вариант хроматографии образцов в условиях одного эксперимента, что сокращает продолжительность
очистки и сохраняет нативность разделяемых компонентов.
Источники информации:
1. Catalogue Q, 1991. Bio-Rad Prod. - 1991. - Р. 21.
2. Иммунологические методы / Под ред. Г. Фримеля: Пер. с нем. - М., 1987.
3. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез
и ультрацентрифугирование: Практическое пособие. - М., 1981. - 286 с.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
110 Кб
Теги
by15946, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа