close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY15957

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.06.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 15957
(13) C1
(19)
C 12N 1/20 (2006.01)
C 12R 1/385 (2006.01)
ШТАММ PSEUDOMONAS AERUGINOSA
КМИЭВ-В 122 – ШТАММ-АНТИГЕН
(21) Номер заявки: a 20100189
(22) 2010.02.09
(43) 2011.10.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Лемиш Артём Петрович; Андрусевич Андрей Сергеевич; Станкуть
Виталий Эдвардович; Станкуть Александр Эдвардович (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) ДЗЮБАК С.Т. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1984. - № 1. - С. 50-53.
UA 30644 U, 2008.
RU 2270867 C2, 2006.
RU 2309767 C1, 2007.
БРОДИНОВА Н.С. и др. // Журнал
микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1984. - № 4. - С. 22-26.
BY 15957 C1 2012.06.30
(57)
Штамм Pseudomonas aeruginosa КМИЭВ-В 122 - штамм-антиген.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штамма,
предназначенного для конструирования вакцин против псевдомоноза животных, средств
специфической профилактики и лечения.
Известен штамм Pseudomonas aeruginosa PA-7 - штамм-антиген, который накапливает
экзотоксин A при культивировании на бульоне Мартена (с содержанием Fe2+ 0,08 мкг/мл +
+ 0,05 % M глутамата натрия + 1 % глицерина) при температуре 32 °С, 18-часовой инкубации и максимальной оксигенации 450 м3/ч. Биологическая активность культурального
супернатанта штамма составляет 200 LD50/мл, а антигенная активность - 7 log2 [1].
Известен штамм Pseudomonas aeruginosa, исходные культуры которого обладали вирулентностью, значение LD50 которого составляет 0,59×109 микробных клеток [2].
Однако эти известные штаммы обладают недостаточным накоплением продукции экзотоксина A, низкой антигенной активностью и слабой вирулентностью для изготовления
биопрепаратов в больших объемах.
Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является получение
штамма, обладающего способностью высокого накопления продукции экзотоксина A,
способностью длительно сохранять высокую вирулентность и более высокой антигенной
активностью.
Поставленная задача достигается тем, что штамм выделен из спермы больного псевдомонозом хряка в 2009 году в Минском ПП РБ Несвижского района, Минской области.
Таксономическая принадлежность. Микроорганизм (КМИЭВ-В 122) отнесен к виду
Pseudomonas aeruginosa рода Pseudomonas семейства Pseudomonadaceae.
BY 15957 C1 2012.06.30
Патогенность для животных. Штамм патогенен для лабораторных животных; при подкожном введении вызывает гибель белых мышей массой 14-16 г.
Культурально-морфологические признаки. Данный микроорганизм в мазках, приготовленных из бульонных и агаровых культурах, окрашенных по Граму, имеет вид прямых
или слегка изогнутых грамотрицательных палочек размером 0,5-1,0×1,5-5,0 мкм. Подвижные,
число жгутиков 1, спор и капсул не образуют. Аэробы. Не растут в кислой среде (pH 4,5).
В МПБ в первый день выращивания дает легкое равномерное помутнение среды с образованием на поверхности среды пристеночного кольца, содержащего флюоресцирующий
пигмент (пиоцин) сине-зеленого цвета; на 2-4 день на дне пробирки образуется характерный слизистый осадок, поднимающийся при встряхивании пробирки в виде косички. При
активном встряхивании происходит перераспределение пигмента с усилением цвета. На
МПА развиваются в основном два вида колоний: большие (диаметром 2-5 мм), сероватые,
полупрозрачные, гладкие, с плоскими краями и выпуклым центром и мелкие, шероховатые. Вокруг колоний образуется зона, окрашенная в зеленый цвет различных оттенков
(флюоресцеин, светящийся при облучении ультрафиолетом). Оптимальная температура
культивирования 37 °С. Растет на питательных средах при 42 °С.
Биохимические свойства. Штамм Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В 122) по биохимическим свойствам обладает способностью ферментировать глюкозу с образованием кислоты без газа. Не образует индол. Использует нитраты в качестве источника азота.
Антигенный состав. Имеет в своем составе O- и H-антигены.
Другие особенности и маркерные признаки. Штамм Pseudomonas aeruginosa образует
флюоресцирующий пигмент (пиоцин) сине-зеленого цвета. Растет на питательных средах
при 42 °С.
Условия хранения. Хранят в ампулах после лиофильного высушивания в сахарозожелатиновой среде в течение 5 лет при температуре + 2-4 °С. Культивируют путем пересева на питательные среды - ПЖА, бульон Хоттингера, МПА на основе перевара Хоттингера - 1 раз в течение месяца.
Антигенные свойства. Антигенная активность штамма Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В122) - штамма-антигена - в РИГА составляет 9 log2.
Иммуногенность штамма Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена составляет 90 %.
Вирулентность. Штамм Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В 122) - штамм-антиген обладает высокой вирулентностью, LD50 которого составляет 0,3×109 м.к.
Чувствительность к антибиотикам. Штамм чувствителен к следующим антибактериальным препаратам: норфлоксацину, офлоксацину, карбеницилину, гентамицину, полимиксину, неомицину, цефуроксину, левомицетину.
1. Пример выделения штамма Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В 122) - штаммаантигена. Штамм Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В 122) - штамм-антиген - выделяли
путем посева спермы хряков-производителей, больных псевдомонозом, на МПБ. Пробирки оставляли в термостате при 37 °С на 12-18 часов. Через указанное время отмечали помутнение среды с образованием сине-зеленого пигмента.
2. Пример культивирования штамма Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В 122) штамма-антигена. Выращивание данного штамма осуществляли на ферментере "Фермус-1"
на бульоне Мартена (с содержанием Fe2+ 0,08 мкг/мл + 0,05 % М глутамата натрия +
+ 1 % глицерина) при температуре 32 °С, 18-часовой инкубации и максимальной оксигенации 450 м3/ч. Контроль накопления экзотоксина A осуществляли в реакции преципитации. Результаты исследований отображены в таблице.
Таким образом, заявляемый штамм Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В 122) - штаммантиген - накапливает экзотоксин A на питательной среде (бульон Мартена) при температуре
32 °С, 18-часовой инкубации и максимальной оксигенации 450 м3/ч и обладает большей
по сравнению с прототипом (200 LD50/мл) биологической активностью культуральных супернатантов, которая составляет 150 LD50/мл (меньшая доза введения обладает большей
летальностью, т.е. большей биологической активностью), с наличием четких линий пре2
BY 15957 C1 2012.06.30
ципитации в реакции двойной диффузии в геле с моноспецифической сывороткой к очищенному токсину в разведении 1:16.
Накопление продукции экзотоксина A P. aeruginosa
при культивировании на бульоне Мартена
Средние показатели активности
культуральных супернатантов
различными методами
Число
иммунохимическим Штамм
Среда культивирования
опытов биологиче- реакция преципитации (в разведении
ским
(в LD50/мл) культурального супернатанта)
Бульон Мартена (с содержанием
КМИЭВFe2+ 0,08 мкг/мл + 0,05 % М глу5
150 LD50/мл
1:16
В 122
тамата натрия + 1 % глицерина)
Бульон Мартена (с содержанием
Известный
Fe2+ 0,08 мкг/мл + 0,05 % М глу5
200 LD50/мл
1:8
штамм
тамата натрия + 1 % глицерина)
3. Пример определения вирулентных свойств штамма Pseudomonas aeruginosa
(КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена. Вирулентные свойства изучали в опытах на белых
мышах живой массой 14-16 г, с этой целью готовили суспензию суточной агаровой культуры данного штамма в физиологическом растворе натрия хлорида. Животных заражали
десятикратными разведениями подкожно в области спины в дозе 0,5 мл. За опытными животными вели наблюдение в течение 10 суток после заражения. На каждую заражающую
дозу использовали по 10 животных. Расчет LD50 проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина; результаты исследований показали, что LD50 штамма Pseudomonas
aeruginosa (КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена - составила 0,3×109 микробных клеток.
4. Пример определения антигенной активности штамма Pseudomonas aeruginosa
(КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена. Антигенные свойства изучали в реакции непрямой
гемагглютинации в разведении сыворотки до 1:1024. В качестве антигена использовали
бактериальную культуру штамма Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В 122) - штаммаантигена. Результаты реакции показали, что антигенная активность штамма Pseudomonas
aeruginosa (КМИЭВ-В 122) - штамма-антигена - составляет 9 log2.
Таким образом, штамм Pseudomonas aeruginosa (КМИЭВ-В 122) - штамм-антиген - обладает свойством накопления продукции экзотоксина А для изготовления вакцины с активностью культурального супернатанта, среднее значение биологической активности
которого составляет 150 LD50/мл, что в 1,3 раз больше по сравнению с известным штаммом, обладающего способностью сохранять длительно высокую вирулентность LD50
0,3×109 (у известного штамма 0,59×109) и более высокой антигенной активностью - 9 log2
(у известного штамма 7 log2). Заявленный штамм может быть использован в качестве
штамма-антигена для конструирования профилактических и диагностических препаратов.
Источники информации:
1. Бородина Н.С., Баскакова Н.В., Мороз А.Ф., Вертиев Ю.В., Мокриевич Н.М. Продукция экзотоксина А при культивировании Pseudomonas aeruginosa PA-7 на бульоне
Мартена // Микробиология, эпидемиология и иммунология. - 1984. - № 4. - С. 22-26.
2. Дзюбак С.Т. Вирулентность и токсигенность культур Pseudomonas aeruginosa разного
происхождения // Микробиология, эпидемиология и иммунология. - 1984. - № 1. - С. 50-53
(прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
84 Кб
Теги
by15957, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа