close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16099

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/48
A 61B 5/00
(2006.01)
(2006.01)
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕНОМНОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ У
РЕБЕНКА С КЛИНИЧЕСКИ ПРЕДПОЛАГАЕМЫМ СИНДРОМОМ
НИЙМЕГЕН
(21) Номер заявки: a 20100643
(22) 2008.12.10
(62) a 20081146, 2008.12.10
(43) 2011.12.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной
академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Гончарова Роза Иосифовна; Кужир Татьяна Дановна; Савина
Наталья Викторовна; Смаль Маргарита Петровна; Политыко Анна
Дмитриевна (BY)
BY 16099 C1 2012.08.30
BY (11) 16099
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) RU 2295130 C1, 2007.
RU 2213782 C2, 2003.
АРУТЮНЯН Р.М. и др. // Вестник
Российской Академии медицинских
наук. - 2001. - № 10. - С. 84-88.
COLLINS A.R. et al. //Biochim Biophys
Acta. - 1994. - 1219. - No 3. - P. 724-727.
SEEMANOVA E. et al. //Cas Lek Cesk. 2002. - V. 141. - No 1. - Р.16-22.
TAYLOR A.M. // Best Pract Res Clin
Haematol. - 2001. - V. 14. - No 3. Р. 631-644.
(57)
Способ диагностики геномной нестабильности у ребенка с клинически предполагаемым синдромом Ниймеген, заключающийся в том, что методом ДНК-комет в ДНК выделенных лимфоцитов периферической крови при инкубации их в течение 180 минут в
среде RPMI-1640 с 10 % инактивированной телячьей сыворотки определяют на 180-й минуте уровень эндогенных повреждений, остаточный уровень повреждений, индуцированных окислительным стрессом, вызванным обработкой лимфоцитов H2O2, а также скорость
и эффективность репарации индуцированных повреждений ДНК и диагностируют геномную нестабильность при уровне эндогенных повреждений, превышающем 20 a.u., и/или
остаточном уровне индуцированных окислительным стрессом повреждений ДНК, составляющем не менее 30 a.u., и/или эффективности репарации индуцированных повреждений
ДНК, не превышающей 65 %, а скорости репарации индуцированных повреждений ДНК,
сниженной не менее чем в 1,5 раза по сравнению со скоростью репарации ДНК в норме.
Изобретение относится к медицине, в частности к наследственным болезням; предназначено для повышения достоверности диагностики синдрома Ниймеген.
Моногенное рецессивное заболевание, называемое синдромом хромосомных поломок
Ниймеген (Nijmegen Breakage Syndrom), относится к группе синдромов хромосомной нестабильности [1], отличительной особенностью которых служит нестабильность хромо-
BY 16099 C1 2012.08.30
сомного аппарата. Типичными симптомами этого заболевания являются микроцефалия,
деформации лицевого скелета по типу "птичьего лица", задержка физического развития,
признаки врожденного иммунодефицита с первых лет жизни в виде тяжелых хронических
пневмоний и частых инфекций дыхательных путей, предрасположенность к злокачественным новообразованиям.
Синдром Ниймеген вызывается мутацией (657del5) в гене NBS1, который кодирует
белок нибрин, участвующий в регуляции клеточного цикла и восстановлении разрывов
двухцепочечной ДНК [2]. Мутация наиболее распространена среди славянского населения
Восточной Европы. Так, в Чехии, Польше и Украине гетерозиготное носительство регистрируется с частотой 1:177, что значительно превосходит ее распространение в западноевропейских странах. Сходную частоту этой мутации в гетерозиготном состоянии можно
ожидать и в популяции Беларуси. При переходе мутации в гомозиготное состояние развивается синдром Ниймеген со всеми неблагоприятными последствиями для здоровья и
жизни ребенка.
Определение геномной нестабильности имеет большое значение как один из основных
приемов диагностики синдрома Ниймеген (CH). Наиболее близким по технической сущности к заявленному изобретению является способ определения нестабильности генома у
детей с детским церебральным параличом [3]. В отличие от заявляемого способа, он предназначен для выявления геномной нестабильности при ненаследственной патологии, относится к детской неврологии и включает анализ цитогенетического статуса по частоте
аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови после их 72-часового культивирования и частоте микроядер в эритроцитах при подсчете не менее 20000 эритроцитов
на каждом препарате. Данный способ предусматривает использование цитогенетических
методов и учитывает только один критерий геномной нестабильности, а именно повышение фоновой (спонтанной) частоты цитогенетических нарушений.
Хромосомная нестабильность при СН, выявляемая при цитогенетическом анализе по
повышенному уровню аберраций хромосом [4], обусловлена дефектами системы репарации (восстановления) ДНК [5]. Мы полагаем, что повышение уровня первичных повреждений ДНК и нарушение репарации ДНК могут оказаться диагностически важными
признаками СН, а оценка этих процессов представляет принципиально иной подход определения геномной нестабильности при этом синдроме.
Задачей заявляемого изобретения является разработка способа диагностики геномной
нестабильности с помощью метода ДНК-комет при СН. Эта задача достигается путем использования нового подхода оценки нестабильности генома, сочетающего метод ДНКкомет с определенным дизайном экспериментального исследования in vitro, позволяющего учесть несколько критериев геномной нестабильности, сравнить параметры стабильного и нестабильного состояния генома на молекулярном уровне и оценить процесс
репарации ДНК.
Метод ДНК-комет (гель-электрофорез единичных клеток) применяется для идентификации мутагенных факторов среды [6, 7], а также для оценки мутагенных воздействий в
различных группах населения [8]. Однако в доступной литературе не обнаружено сведений, касающихся анализа с помощью данного метода геномной нестабильности при СН.
Преимуществом метода ДНК-комет по сравнению с рутинным цитогенетическим анализом является идентификация широкого спектра первичных повреждений ДНК, использование неделящихся клеток без этапа культивирования и связанных с ним
неблагоприятных эффектов in vitro, что повышает точность изучаемых параметров, существенно упрощает и удешевляет работу с клетками и значительно сокращает сроки анализа. Важнейшей отличительной особенностью данного подхода является возможность
оценить эффективность и скорость репарации ДНК, которые не могут быть определены
цитогенетическими методами.
2
BY 16099 C1 2012.08.30
Предлагаемый нами способ основан на комплексном исследовании образцов крови,
который учитывает известные критерии геномной нестабильности, а именно:
1) повышенную чувствительность генома к эндогенным повреждениям;
2) повышенную чувствительность генома к экзогенным повреждениям;
3) нарушение процесса репарации ДНК по сравнению с аналогичными показателями у
здоровых лиц.
Обнаруженные у больных с предполагаемым диагнозом СН статистически значимые
изменения параметров стабильного генома вместе или в любом сочетании надежно свидетельствуют о геномной нестабильности.
Сущность способа состоит в определении методом ДНК-комет параметров, свидетельствующих о нестабильности генома, на образцах периферической венозной крови у
пациентов с клинически предполагаемым диагнозом СН.
Авторами заявки установлено, что показатели геномной нестабильности, получаемые
с помощью предлагаемого способа, тесно коррелируют с данными стандартного цитогенетического анализа, который до настоящего времени служит основным лабораторным
методом оценки стабильности генома.
Способ выполняется следующим образом. После забора венозной крови (в количестве
не более 1-2 мл) проводят выделение лимфоцитов центрифугированием в градиенте Histopaque-1077 (ICN) в течение 30 мин. Выделенные лимфоциты инкубируют при 37 °С в
среде RPMI-1640 с добавлением инактивированной телячьей сыворотки (10 %) в течение
3-х часов. В качестве модельного мутагена используют пероксид водорода (Н2О2) в дозе
100 мкМ. Обработку клеток проводят при оптимальных условиях с последующей отмывкой мутагена.
Для определения уровня повреждений ДНК используют метод ДНК-комет (щелочную
версию) [6]. Процедура включает следующие этапы:
1. Приготовление микропрепаратов, для чего суспензию лимфоцитов смешивают с
низкоплавкой агарозой и наносят на заранее подготовленные предметные стекла.
2. Лизис клеток, в процессе которого происходит разрушение клеточных структур и
высвобождение ДНК.
3. Щелочная денатурация, в ходе которой щелоче-лабильные сайты ДНК реализуются
в однонитевые разрывы.
4. Электрофорез, в ходе которого фрагменты ДНК под влиянием электрического поля
формируют хвост кометы, тогда как ядро представлено неповрежденной ДНК.
5. Нейтрализация препаратов.
6. Фиксация, высушивание и окрашивание препаратов.
7. Анализ препаратов выполняют с использованием флуоресцентного микроскопа, при
этом на стекле просчитывают 100 клеток. Кометы распределяют на пять классов; среднее
количество повреждений ДНК в условных единицах a.u. (arbitrary units) рассчитывают по
известной формуле [9].
Для исследования чувствительности генома к эндогенным повреждениям все указанные процедуры проводят на образцах интактных (необработанных) лимфоцитов; уровень
эндогенных повреждений ДНК регистрируют на 180-й мин инкубации клеток.
Для исследования чувствительности генома к экзогенным повреждениям, вызванным
окислительным стрессом, указанные процедуры проводят на лимфоцитах, обработанных
in vitro H2O2. Уровень индуцированных повреждений ДНК регистрируют сразу после обработки (0-я мин) и в конце инкубации клеток (180-я мин).
Для исследования процесса репарации ДНК пробы отбирают на 0, 15, 30, 60, 120 и
180-й мин после обработки лимфоцитов Н2О2. Эффективность репарации ДНК (ЭР) определяют как процент элиминированных повреждений по отношению к первоначально индуцированному уровню. Скорость репарации ДНК оценивают при построении графиков,
соответствующих кинетике элиминации индуцированных повреждений ДНК, путем срав3
BY 16099 C1 2012.08.30
нения уравнений, описывающих зависимость количества повреждений ДНК от времени.
Продолжительность репарации оценивают по ее завершению к 180-й мин.
Статистический анализ данных и их графическое представление производят с помощью стандартных средств Microsoft Office (программа Excel).
На основании проведенных исследований в контрольной группе здоровых лиц (выборка 40 человек), не имеющих контактов с мутагенными факторами, выявлены следующие параметры стабильного состояния генома: а) уровень эндогенных повреждений ДНК
(фон) равен 12,08±1,09 a.u. (180-я мин); б) уровень повреждений, индуцированных in vitro
пероксидом водорода, составляет 92,48±4,52 a.u. в начале и 15,9±1,44 a.u. в конце инкубации лимфоцитов; в) кинетика элиминации повреждений ДНК описывается уравнением
степенной зависимости, скорость репарации ДНК наиболее высока в течение первого получаса после мутагенного воздействия; эффективность репарации ДНК составляет 62 % за
это же время и достигает 80 % к концу инкубации лимфоцитов, г) продолжительность репарации поврежденной ДНК не превышает 3-х часов, т.к. уровни индуцированных и эндогенных повреждений в конце наблюдения статистически не различаются между собой.
Статистически значимые изменения в сторону увеличения параметров (а), (б) и (г), а также снижения параметра (в) вместе или в любом сочетании свидетельствуют о геномной
нестабильности.
Исследование образцов крови пациентов с клинически предполагаемым диагнозом СН
позволило установить следующие параметры состояния генома: а) средний уровень эндогенных повреждений (фон) в этой группе составляет 20,2±2,85 a.u. (180-я мин), что достоверно отличается от аналогичного показателя в группе здоровых лиц (t = 2,66; P = 0,04); б)
средний уровень индуцированных повреждений ДНК составляет 90,67±12,19 (0-я мин) и
34,50±4,50 a.u. (180-я мин), т.е. остаточный уровень индуцированных повреждений ДНК
более чем в 2 раза превосходит этот показатель в группе контроля; в) эффективность репарации ДНК за первые полчаса составляет 33 %, что вдвое ниже, чем в контроле, а к
концу исследования достигает всего 62 %, что соответствует эффективности репарации
ДНК через 30 мин после воздействия H2O2 на лимфоциты здоровых лиц. Фигура отражает
кинетику элиминации индуцированных повреждений ДНК при СН (дети-СН) по сравнению со здоровыми лицами (здоровые). Обе кривые описываются уравнениями степенной
зависимости, сравнение которых свидетельствует о почти двукратном снижении скорости
репарации ДНК в группе больных детей по сравнению с нормой (t = 3,35; Р<0,04). На это
указывает и тот факт, что (г) репарация ДНК не завершается за 3 ч, т.к. остаточный уровень индуцированных повреждений не падает до уровня эндогенных повреждений ДНК в
этой же группе и более чем в 2 раза превышает остаточный уровень индуцированных повреждений ДНК в группе здоровых лиц. Таким образом, геномная нестабильность выявлена по всем анализируемым критериям, однако наиболее значимые изменения
претерпевает процесс репарации ДНК.
Таким образом, наиболее показательными для диагностики геномной нестабильности
у детей с клинически предполагаемым диагнозом СН являются следующие параметры состояния генома:
1) повышенный уровень эндогенных повреждений ДНК (не менее 20 a.u. - при кратности увеличения этого параметра по отношению к параметру стабильного генома около 2);
2) повышенный остаточный уровень индуцированных повреждений ДНК (не менее
30 a.u. - кратность увеличения этого параметра по отношению к параметру стабильного
генома составляет 1,8 и более);
3) снижение эффективности репарации ДНК (не более 65 % за 180 мин); уменьшение
скорости репарации ДНК не менее чем в 1,5 раза относительно параметров, характеризующих нормальный репарационный процесс.
Способ подтверждается следующими примерами.
4
BY 16099 C1 2012.08.30
1. Больной Т., возраст 7 мес., выявлены клинические симптомы (микроцефалия, черепно-лицевые дизморфии, гипервосприимчивость к вирусным инфекциями), позволяющие предполагать наличие СН. С помощью метода ДНК-комет обнаружена геномная
нестабильность по следующим параметрам: а) уровень эндогенных повреждений ДНК составляет 26 a.u. (кратность увеличения 2,2 по отношению к параметру стабильного генома); б) остаточный уровень индуцированных повреждений ДНК на 180-й мин после
окислительного стресса - 30 a.u. (кратность увеличения 1,9 по отношению к параметру
стабильного генома); в) ЭР на 180-й мин - 55 % (на треть ниже, чем в норме). Показатели
уравнения, описывающего кинетику элиминации повреждений ДНК, свидетельствуют о
снижении скорости репарации ДНК более чем в 2 раза. Геномная нестабильность, установленная с помощью предлагаемого способа, тесно коррелирует с данными цитогенетического анализа.
2. Больной К., 3 года 5 мес., выявлены клинические симптомы (низкий рост, микроцефалия, черепно-лицевые дизморфии, гипервосприимчивость к вирусным инфекциям),
позволяющие предполагать наличие СН. С помощью метода ДНК-комет обнаружена геномная нестабильность по следующим параметрам: а) уровень эндогенных повреждений
ДНК составляет 25 a.u. (кратность увеличения 2,1 по отношению к параметру стабильного
генома); б) остаточный уровень индуцированных повреждений ДНК составляет 39 a.u.
(кратность увеличения 2,6 по отношению к параметру стабильного генома); в) ЭР на 180-й
мин - 64 % (на четверть ниже, чем в норме). Показатели степенного уравнения, описывающего кинетику элиминации повреждений ДНК, свидетельствуют о снижении скорости
репарации ДНК в полтора раза. Геномная нестабильность, установленная с помощью
предлагаемого способа, тесно коррелирует с данными цитогенетического анализа.
Предложенный способ ДНК-диагностики нестабильности генома с помощью метода
ДНК-комет, основанный на учете нескольких критериев геномной нестабильности и
определении параметров нестабильного состояния генома, позволяет повысить достоверность диагностики СН за счет выявления нарушений репарационного процесса как важнейшего этиологического фактора заболевания. Новый способ дает возможность оценить
уровень первичных повреждений ДНК, скорость и эффективность репарации ДНК, которые не определяются цитогенетически, а также не требует культивирования лимфоцитов,
упрощает и удешевляет работу с клетками и значительно сокращает сроки проведения
анализа.
Источники информации:
1. Varon R., Seemanova E., Chrzanowska K. Et al. Clinical ascertainment of Nijmegen
breakage syndrome (NBS) and prevalence of the major mutation, 657del5, in three Slav populations // Eur. J. Hum.Genet. - 2000. - Vol. 8. - No 11. - P. 900-902.
2. Kobayashi J., Antoccia A., Tauchi H. et al. NBS1 and its functional role in the DNA damage response // DNA Repair (Amst). 2004. - Vol. 3. - No 8-9. - P. 855-861.
3. Патент РФ "Способ определения нестабильности генома у детей с детским церебральным параличом" / Д.Д.Гайнетдинова, В.В.Семенов. RU, (11) 2295130, (13) С1, (51)
МПК G 01N 33/48. - 2006.01.
4. Метод цитогенетической диагностики синдрома атаксии-телангиэктазии (Луи-Бар)
и синдрома Нижмеген: Инструкция к применению / А.Д.Политыко, И.В.Наумчик,
О.М.Хурс, Т.М.Егорова. № регистрации в МЗ РБ 089-106.-2006.
5. Digweed M., Sperling К. Nijmegen breakage syndrome: clinical manifestation of defective response to DNA double-strand breaks // DNA Repair (Amst). - 2004 - Vol. 3. - No 8-9. P. 1207-1217.
6. Collins A.R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and
limitations // Mol. Biothechnology. - 2004. - Vol. 26. - Р. 249-261.
5
BY 16099 C1 2012.08.30
7. Дурнев А.Д. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных
клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений. Методические рекомендации. - Москва, 2006. - 27 с.
8. Арутюнян Р.М., Оганесян Г.Г., Нерсесян А.К. Применение метода ДНК-комет для
оценки генотоксических эффектов в группах риска // Вестник РАМН. - 2001. - № 10. С. 84-88.
9. Collins A.R., Fleming I.M., Gedik C.M. In vitro repair of oxidative and ultravioletinduced DNA damage in supercoiled nucleoid DNA by human cell extract // Biochim. Biophys.
Acta. - 1994. - Vol. 1219. - No 3. - P. 724-727.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
167 Кб
Теги
by16099, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа