close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16211

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 07C 403/02
C 07C 49/603
C 07C 45/78
A 61K 31/122
A 61P 35/00
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
ЦИКЛОГЕКСЕНОНОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ИЗ АНТРОДИИ
КАМФОРНОЙ (ANTRODIA CAMPHORATA) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
(21) Номер заявки: a 20091080
(22) 2008.01.10
(31) 200710004235.8 (32) 2007.01.18 (33) CN
(85) 2009.08.18
(86) PCT/CN2008/070071, 2008.01.10
(87) WO 2008/089674, 2008.07.31
(43) 2010.04.30
(71) Заявитель: ГОЛДЕН БИОТЕКНОЛОДЖИ КОРПОРЕЙШН (CN)
(72) Авторы: ЛИУ, Шенг-Юн; ВЕН, ВуЧе; ТСОУ, Ван-Линг; КУО, МаоТиен; ЧАНГ, Чун-Чоу; ХУАНГ,
Чун-Хунг; ЛИ, Йя-Йинг; ФОК, КаХанг (CN)
BY 16211 C1 2012.08.30
BY (11) 16211
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: ГОЛДЕН БИОТЕКНОЛОДЖИ КОРПОРЕЙШН (CN)
(56) WO 96/07403 A1.
CN 1799562 A, 2006.
JP 60116642 A, 1985.
(57)
1. Соединение, представляющее собой 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон.
2. Соединение по п. 1, отличающееся тем, что выделено из Antrodia camphorata.
3. Соединение по п. 2, отличающееся тем, что выделено из экстракта Antrodia camphorata, полученного с помощью органического растворителя.
4. Соединение по п. 3, отличающееся тем, что органический растворитель выбран из
группы, включающей спирты, сложные эфиры, алканы и алкилгалоиды.
5. Соединение по п. 4, отличающееся тем, что органическим растворителем является
этанол.
6. Соединение по п. 2, отличающееся тем, что выделено из водного экстракта Antrodia camphorata.
7. Соединение по п. 1, проявляющее антиоксидантную активность.
8. Способ подавления роста клеток рака молочной железы, при котором на клетки
воздействуют соединением по п. 1.
9. Способ по п. 8, отличающийся тем, что соединение выделено из Antrodia camphorata.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что соединение выделено из экстракта Antrodia camphorata, полученного с помощью органического растворителя.
11. Способ по п. 10, отличающийся тем, что органический растворитель выбран из
группы, включающей спирты, сложные эфиры, алканы и алкилгалоиды.
BY 16211 C1 2012.08.30
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что органическим растворителем является
этанол.
13. Способ по п. 9, отличающийся тем, что соединение выделено из водного экстракта Antrodia camphorata.
14. Способ по п. 8, отличающийся тем, что клетки рака молочной железы относятся к
клеточной линии MCF-7 или MDA-MB-231.
15. Способ подавления роста клеток рака печени, при котором на клетки воздействуют
соединением по п. 1.
16. Способ по п. 15, отличающийся тем, что соединение выделено из Antrodia camphorata.
17. Способ по п. 16, отличающийся тем, что соединение выделено из экстракта Antrodia camphorata, полученного с помощью органического растворителя.
18. Способ по п. 17, отличающийся тем, что органический растворитель выбран из
группы, включающей спирты, сложные эфиры, алканы и алкилгалоиды.
19. Способ по п. 18, отличающийся тем, что органическим растворителем является
этанол.
20. Способ по п. 16, отличающийся тем, что соединение выделено из водного экстракта Antrodia camphorata.
21. Способ по п. 15, отличающийся тем, что клетки рака печени относятся к клеточной линии Hep 3B или Hep G2.
22. Способ подавления роста клеток рака простаты, при котором на клетки воздействуют соединением по п. 1.
23. Способ по п. 22, отличающийся тем, что соединение выделено из Antrodia camphorata.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что соединение выделено из экстракта Antrodia camphorata, полученного с помощью органического растворителя.
25. Способ по п. 24, отличающийся тем, что органический растворитель выбран из
группы, включающей спирты, сложные эфиры, алканы и алкилгалоиды.
26. Способ по п. 25, отличающийся тем, что органическим растворителем является
этанол.
27. Способ по п. 23, отличающийся тем, что соединение выделено из водного экстракта Antrodia camphorata.
28. Способ по п. 22, отличающийся тем, что клетки рака простаты относятся к клеточной линии LNCaP или DU-145.
29. Фармацевтическая композиция для подавления роста опухолевых клеток, выбранных из группы, включающей клетки рака молочной железы, рака печени и рака простаты,
содержащая эффективное количество соединения по п. 1 и фармацевтически приемлемый
носитель.
Настоящее изобретение относится к новому соединению, в частности к экстракту, выделенному и очищенному из Antrodia camphorata, и к его применению в подавлении роста
опухоли.
Antrodia camphorata (Ниу Чанг-Жи), также называемая "Чанг-Жи", "Ниу Чанг-Ку",
"Ред-Чанг", "Ред Чанг-Чи", "Чанг-Ку", камфорный камерный гриб и так далее, является
эндемичным видом на Тайване, растущим на внутренней гнилой сердцевине древесной
стенки коричника Cinnamomum kanehirae Хей на высоте над уровнем моря от 450 до
2000 м в горах Тайваня. Плодовое тело Antrodia camphorata растет внутри ствола дерева.
Cinnamomum kanehirae Хей распространен главным образом в горных областях Тао-Юань,
Нан-Тоу и внесен в перечень редких и ценных пород благодаря малой численности, и его
чрезмерная вырубка является противозаконной. Таким образом, Antrodia camphorata в
2
BY 16211 C1 2012.08.30
природе становится также редкой. Поскольку скорость роста природной Antrodia camphorata является крайне низкой, а сезон роста проходит с июня по октябрь, то цена Antrodia
camphorata является очень высокой.
Плодовые тела Antrodia camphorata являются многолетними, бесчерешковыми, пробковыми или древесными, с различными внешними формами, наподобие тарелки, колокола, копыта или башни. Они являются плоскими на поверхности дерева в начале роста.
Затем края на передней границе поднимаются, заворачиваясь в форму тарелок или сталактитов. Верхние поверхности Antrodia camphoratа являются блестящими, коричневого или
темно-коричневого цвета, с незаметными складками, плоскими и тупыми краями. Нижние
стороны являются оранжево-красными или частично желтыми, с порами на всей поверхности.
В дополнение, Antrodia camphorata издает сильный запах сассафраса (камфорный аромат), становится бледным желто-коричневым после высушивания на солнце и имеет
сильный горький вкус. В традиционной тайваньской медицине Antrodia camphorata обычно применяется для детоксикации, защиты печени, в качестве противоракового средства.
Antrodia camphorata, как и обычные съедобные и медицинские грибы, богата многочисленными питательными веществами, включая полисахариды (такие как β-глюкозан), тритерпеноиды, супероксид-дисмутазу (СОД), аденозин, белки (иммуноглобулины),
витамины (такие как витамин B, никотиновая кислота), микроэлементы (такие как кальций, фосфор и германий и прочее), нуклеиновую кислоту, агглютинин, аминокислоты,
стероиды, лигнины и стабилизаторы кровяного давления (такие как антродиевая кислота)
и тому подобное. Полагают, что эти биоактивные ингредиенты проявляют благоприятные
эффекты, такие как: противоопухолевый, усиление иммунитета, противоаллергический,
подавление агглютинации тромбоцитов, противовирусный, противобактериальный, антигипертензивный, снижение уровня глюкозы в крови, снижение холестерина, защита печени и тому подобное.
Тритерпеноиды являются наиболее изученным компонентом среди многочисленных
композиций Antrodia camphoratа. Тритерпеноиды являются общим наименованием для
природных соединений, содержащих 30 атомов углерода с пентациклическими или гексациклическими структурами. Горький вкус Antrodia camphorata обусловлен компонентом
из тритерпеноидов. Три новых тритерпеноидов эргостанового типа (антцин A, антцин B,
антцин C) были выделены Cherng et al. из плодовых тел Antrodia camphorata [Cherng I.H.
and Chiang H.C. 1995. Three new triterpenoids from Antrodia cinnamomea. J. Nat. Prod.
58:365-371]. Три новых соединения, названных жанкуевой кислотой A, жанкуевой кислотой B и жанкуевой кислотой C, были экстрагированы из плодовых тел Antrodia camphorata
этанолом Chen et al. [Chen C.H. and Yang S.W. 1995. New steroid acids from Antrodia cinnamomea, - a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. J. Nat. Prod. 58:1655-1661]. В дополнение Cherng et al. также нашли в плодовых телах Antrodia camphorata три других
новых тритерпеноида, являющихся сесквитерпена лактоном и двумя соединениями, полученными из бифенила, 4,7-диметокси-5-метил-1,3-бензодиоксолом и 2,2',5,5'-тетраметокси-3,4,3',4'-би-метилендиокси-6,6'-диметилбифенилом [Chiang H.C., Wu D.P.,
Cherng I.W. and Ueng C.H. 1995. A sesquiterpene lactone, phenyl and biphenyl compounds
from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 39:613-616]. В 1996 четыре новых тритерпеноида эргостанового типа (антцины E и F и метил антцинаты G и H) были выделены Cherng
et al. с помощью тех же самых аналитических методов [Cherng I.H., Wu D.P. and Chiang
H.C. 1996. Triteroenoids from Antrodia cinnamomea. Phytochemistry. 41:263-267]. Два родственных к эргостану стероида, жанкуевые кислоты D и E вместе с тремя ланостасвязанными тритерпенами, 15 альфа-ацетил-дегидросульфуреновой кислотой, дегидроебурикоевой кислотой и дегидросульфуреновой кислотой были выделены Yang et al.
[Yang S.W., Shen Y.C. and Chen C.H. 1996. Steroids and triterpenoids of Antrodia cinnamomea
a fungus parasitic on Cinnamomum micranthum. Phytochemistry. 41:1389-1392]. Поиски точ3
BY 16211 C1 2012.08.30
ных активных ингредиентов с противоопухолевым эффектом все еще остаются на экспериментальной стадии и нуждаются в разъяснении, хотя сообщалось о противоопухолевых
эффектах Antrodia camphorata (таких как в вышеупомянутых ссылках). Если будет найдена точная противоопухолевая композиция, это внесет большой вклад в благоприятные
эффекты лечения рака.
Чтобы идентифицировать противоопухолевые соединения из экстрактов Antrodia
camphorata, в данном изобретении было выделено и очищено соединение, представляющее
собой
4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10триенил)циклогекс-2-енон, как показано в формуле 1, с молекулярной формулой C24H38O4,
в виде бледно-желтого порошка, с молекулярной массой 390.
CH3
CH3
CH3
CH3
O
CH3
(1)
H3C
O
OH
O
CH3
Соединения формулы 1 очищены путем водной экстракции или экстракции органическим растворителем Antrodia camphorata. Органические растворители включают, но не
ограничены этим, спирты, такие как метанол, этанол или пропанол, сложные эфиры, такие
как этилацетат, алканы, такие как гексан, или алкилгалоиды, такие как хлорметан, хлорэтан. Среди них предпочтительным является спирт, особо предпочтительным является этанол.
Соединениями, которые можно применять в соответствии с изобретением, может быть
подавлен рост опухолевых клеток, что можно далее применять для медицинской композиции для лечения рака и усиления лечебных эффектов. Соединения изобретения можно
применять для ряда раковых клеток, включая рак молочной железы, рак печени и рак простаты, что приводит к замедлению роста раковых клеток, с последующим подавлением
пролиферации раковых клеток и снижением риска развития опухоли. Таким образом, их
можно применять в лечении рака, такого как рак молочной железы, рак печени, рак простаты и тому подобного.
С другой стороны, соединения формулы 1 в изобретении могут быть включены в медицинские композиции для лечения рака молочной железы, рака печени и рака простаты,
для подавления роста опухолевых клеток. Медицинские композиции включают не только
соединения формулы 1, но также и фармацевтически пригодные носители. Носители включают, но не ограничены этим, наполнители, такие как вода, уплотнители, такие как сахароза
или крахмал, связующие агенты, такие как производные целлюлозы, разбавители, дезинтегранты, усилители абсорбции или подсластители. Фармацевтическая композиция настоящего
изобретения может быть произведена путем смешивания соединений формулы 1, по крайней
мере, с одним из носителей с помощью обычных способов, известных в фармацевтической
области техники, и может быть представлена, но не ограничена этим, в виде порошка, таблетки, капсулы, пилюль, гранул или иного жидкого состава.
В дополнение, поскольку соединения настоящего изобретения в то же время обладают
антиоксидантной активностью, они могут быть идеальными добавками к здоровому питанию, диетам и напиткам, медицинским продуктам и косметике и являются благоприятными для здоровья человека благодаря способностям к профилактике сердечно-сосудистых
заболеваний или мутации клеток.
Настоящее изобретение далее разъясняется в следующих примерах и иллюстрациях
воплощений. Эти примеры, однако, нельзя рассматривать как ограничивающие объем
4
BY 16211 C1 2012.08.30
изобретения, и предполагается, что специалистами в данной области техники легко могут
быть сделаны модификации, находящиеся в пределах сущности изобретения и объема
приложенной формулы.
Мицелий, плодовые тела или их смесь из Antrodia camphorata вначале экстрагировали
водой или органическими растворителями до получения водного экстракта или органического экстракта Antrodia camphorata с применением способов, известных специалистам в
данной области техники. Органические растворители включали, но не ограничивались
этим, спирты, такие как метанол, этанол или пропанол, сложные эфиры, такие как этилацетат, алканы, такие как гексан, или алкилгалоиды, такие как хлорметан, хлорэтан. Среди
них предпочтительным является спирт, особо предпочтительным является этанол.
Водные или органические экстракты из Antrodia camphorata подвергали высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для выделения и очистки. Каждую фракцию
отбирали и анализировали на противораковый эффект. В активных фракциях с противораковым эффектом анализировали состав и впоследствии исследовали активность против
различных опухолевых клеток. Вышеуказанный подход привел к идентификации новых
соединений формулы 1, ингибирующих рост некоторых опухолевых клеток, не обнаруженных ранее в Antrodia camphorata, и о которых не сообщалось в каких-либо предыдущих публикациях.
Соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон формулы 1 разъясняется ниже в качестве примера настоящего
изобретения. Противоопухолевые эффекты 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона оценивали путем анализа с 3-(4,5диметилтиазол-2-ил)-2, S-дифенил тетразолия бромидом (MTT) тестом в соответствии с
моделью скрининга противоопухолевых лекарств Национального института рака (NCI) по
уровню выживания клеток с применением клеточных линий, таких как клетки рака молочной железы, рака печени, рака простаты и тому подобных. Вышеуказанные тесты доказали, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон снижает уровни выживания клеточных линий рака молочной железы
(MCF-7 и MDA-MB-231), клеточных линий гепатоцеллюлярной карциномы (Hep 3B и Hep
G2) и клеточных линий рака простаты (LNCaP и DU-145), в то же время показывая относительно низкие значения концентрации полуингибирования (IC50). Рост клеток рака молочной железы, рака печени и рака простаты подавлялся 4-гидрокси-2,3-диметокси-6метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-еноном, который, таким образом, можно применять для лечения рака, такого как рак молочной железы, рак печени,
рак простаты и тому подобное. Подробности примеров описаны далее.
Пример 1
Выделение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона.
100 г мицелия, плодовых тел или их смеси из Antrodia camphorata помещали в колбу.
В колбу добавляли подходящее количество воды и спирта (70-100 % спиртовой раствор) и
перемешивали при 20-25 °C в течение, по крайней мере, 1 часа. Раствор фильтровали через фильтр и 0,45 мкм мембрану и собирали фильтрат в качестве экстракта.
Фильтрат из Antrodia camphorata подвергали анализу посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Разделение проводили на колонке RP18, мобильная фаза состояла из метанола (A) и 0,1-0,5 % уксусной кислоты (B), с условиями
градиента 0-10 мин в 95 % ~ 20 % B, 10-20 мин в 20 % ~ 10 % B, 20-35 мин в 10 % ~ 10 % B,
35-40 мин в 10 % ~ 95 % B, при скорости потока 1 мл/мин. Поток, вытекающий из колонки, контролировали детектором в УФ/видимой области.
Фракции, собранные на 25-30 мин, отбирали и концентрировали до получения
4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2енона, продукта в виде бледно-желтого порошка. Анализ 4-гидрокси-2,3-диметокси-65
BY 16211 C1 2012.08.30
метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона показал молекулярную
формулу C24H38O4, молекулярную массу 390, точку плавления 48 °С ~ 52 °С. Исследование ЯМР-спектра показало, что 1H-NMR(CDCl3)δ(м.д.) = 1.51, 1.67, 1.71, 1.75, 1.94, 2.03,
2.07, 2.22, 2.25, 3.68, 4.05, 5.07 и 5.14; 13C-NMR(CDCl3)δ(м.д.) = 12.31, 16.1, 16.12, 17.67,
25.67, 26.44, 26.74, 27.00, 39.71, 39.81, 4.027, 43.34, 59.22, 60.59, 120.97, 123.84, 124.30,
131.32, 135.35, 135.92, 138.05, 160.45 и 197.12.
Химическую структуру 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона сравнивали с базой данных химических соединений, и
не было найдено подобной структуры. Эти данные подтвердили, что 4-гидрокси-2,3диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон является
новым соединением, о котором не сообщалось ранее.
Пример 2
Анализ выживания in vitro для эффектов против рака молочной железы.
Модель скрининга противораковых лекарств NCI выбрали для тестирования противоракового эффекта соединения из примера 1 изобретения. Выделенное соединение
4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2енон из примера 1 добавляли в среду для культивирования клеток рака молочной железы
человека, MCF-7 или MDA-MB-231, для анализа выживания опухолевых клеток. Этот
анализ проводили с применением теста с 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2, S-дифенил тетразолия бромидом (MTT), обычно применяемого для определения клеточной пролиферации,
процента жизнеспособных клеток и цитотоксичности. MTT является желтым красителем,
который абсорбируется живыми клетками и восстанавливается до багряно-синих кристаллов формазана редуктазой сукцинат-тетразолия в митохондриях. Образование формазана,
таким образом, применяют для оценки и определения уровня выживания клеток.
Клетки рака молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB-231 культивировали по
отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение
24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 х
трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную
жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет. Этанольные экстракты Antrodia camphorata (контрольная группа, общие экстракты Antrodia
camphorata без очистки) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией:
30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкг/мл соответственно, в то время как 4-гидрокси-2,3диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон (экспериментальная группа) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10,
3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкг/мл соответственно. Клетки инкубировали при 37 °С в 5 %
CO2 инкубаторе в течение 48 часов. MTT добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую
лунку в темноте и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл
литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере
при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полуингибирования (IC50) подсчитывали и указывали в табл. 1.
Таблица 1
Результаты анализа выживания in vitro для подавления клеток рака молочной железы
Образцы
IC50 (мкг/мл)
Контрольная группа (экстракт из Antrodia camphorata)
MCF-7
11,132
MDA-MB-231
25,812
Экспериментальная группа
MCF-7
0,852
MDA-MB-231
1,031
6
BY 16211 C1 2012.08.30
Из результатов табл. 1 видно, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон является мощным ингибитором роста
клеточной линии рака молочной железы человека. Значения IC50 4-гидрокси-2,3диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона для MCF-7 и
MDA-MB-231 составляют 0,852 и 1,031 мкг/мл соответственно, что значительно ниже,
чем у общих экстрактов из Antrodia camphorata. Таким образом, 4-гидрокси-2,3диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон из Antrodia
camphorata можно применять для подавления роста клеток рака молочной железы.
Пример 3
Дополнительное исследование in vitro по адъювантной терапии клеток рака молочной
железы.
Эксперимент также проводили в соответствии с in vitro моделью скрининга противораковых лекарств NCI. Клетки рака молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB231 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 х трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут.
Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей
среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный
планшет после добавления 0,0017 мг/мл Таксола и обрабатывали в течение 72 часов.
4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2енон, полученный в примере 1, добавляли в каждую из 96 лунок в следующих концентрациях: 0 мкг/мл (контрольная группа); 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкг/мл (экспериментальная группа) соответственно. Клетки инкубировали при 37 °С в 5 % CO2 инкубаторе в
течение 48 часов. MTT добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте и
инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны
570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полуингибирования
(IC50) подсчитывали и указывали в табл. 2.
Таблица 2
Результаты дополнительной терапии Таксолом in vitro клеток рака молочной железы
Образцы
Результаты
Контрольная группа
Уровень выживания клеток (%)
MCF-7 (0,0017 мкг/мл Таксола)
65±1
MDA-MB-231 (0,0017 мкг/мл Таксола)
76±3
Экспериментальная группа
IC50 (мкг/мл)
MCF-7 (0,0017 мкг/мл Таксола + формула 2)
0,009
MDA-MB-231 (0,0017 мкг/мл Таксола + формула 2)
0,011
Из результатов табл. 2 видно, что значения IC50 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона для MCF-7 и MDA-MB231 снизились до 0,009 и 0,011 мкг/мл соответственно после добавления Таксола. Таким
образом, эти результаты подтверждают ингибиторную активность 4-гидрокси-2,3диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона из Antrodia camphorate, который можно применять для подавления роста клеток рака молочной
железы, и показывают лучшую противоопухолевую синергетическую активность при
комбинации с Таксолом.
Пример 4
Анализ выживания in vitro для эффектов против рака печени.
Модель скрининга противораковых лекарств NCI также применяли для анализа противораковых эффектов соединения, выделенного в примере 1 настоящего изобретения.
Выделенное соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека7
BY 16211 C1 2012.08.30
2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон из примера 1 добавляли в среду для культивирования
клеток рака печени человека, Hep 3B или Hep G2, для анализа выживания опухолевых
клеток.
Клетки рака печени человека Hep 3B и Hep G2 культивировали по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 х трипсин-ЭДТА и
центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при
легком встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет. Этанольные экстракты
Antrodia camphorata (контрольная группа, общие экстракты Antrodia camphorata без очистки) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и
0,03 мкг/мл соответственно, в то время как 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон (экспериментальная группа) добавляли
в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкг/мл соответственно. Клетки инкубировали при 37 °С в 5 % CO2 инкубаторе в течение 48 часов.
MTT добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте и инкубировали в
течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки
реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полуингибирования (IC50) подсчитывали и указывали в табл. 3.
Таблица 3
Результаты анализа выживания in vitro для подавления клеток рака печени
Образцы
IC 50 (мкг/мл)
Контрольная группа (экстракт из Antrodia camphorata)
Hep 3B
5,121
Hep G2
18,631
Экспериментальная группа (формула 1)
Hep 3B
0,005
Hep G2
1,679
Из результатов табл. 3 видно, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон является мощным ингибитором роста
клеточной линии рака печени человека. Значения IC50 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона для Hep 3B и Hep G2 составляют 0,005 и 1,679 мкг/мл соответственно, что значительно ниже, чем у общих экстрактов
из Antrodia camphorata. Таким образом, 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон из Antrodia camphorata можно применять для подавления роста клеток рака печени.
Пример 5
Дополнительное исследование in vitro по адъювантной терапии клеток рака печени.
Эксперимент также проводили в соответствии с in vitro моделью скрининга противораковых лекарств NCI. Клетки рака печени человека Hep 3B и Hep G2 культивировали по
отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение
24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 х
трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную
жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки Hep 3B обрабатывали 0,0043 мг/мл Ловастатина в течение 72 часов, а Hep G2 обрабатывали 0,0017 мг/мл Таксола в течение
72 часов, перед помещением в 96-луночный планшет. 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон, полученный в примере 1, добавляли в каждую из 96 лунок в следующих концентрациях: 0 мкг/мл (контрольная группа); 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкг/мл (экспериментальная группа) соответственно. Клетки
8
BY 16211 C1 2012.08.30
инкубировали при 37 °С в 5 % CO2 инкубаторе в течение 48 часов. MTT добавляли с концентрацией 2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте и инкубировали в течение 4 часов, с последующим добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты
анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полуингибирования (IC50) подсчитывали и указывали в
табл. 4.
Таблица 4
Результаты дополнительной терапии in vitro клеток рака печени
Образцы
Результаты
Контрольная группа
Уровень выживания клеток (%)
Hep 3B (0,0043 мкг/мл Ловастатина)
61±3
Hep G2 (0,0017 мкг/мл Таксола)
81±2
Экспериментальная группа
IC50 (мкг/мл)
Hep 3B (0,0043 мкг/мл Ловастатина + формула 2)
0,002
Hep G2 (0,0017 мкг/мл Таксола + формула 2)
0,008
Из результатов табл. 4 видно, что значения IC50 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона для Hep 3B и Hep G2 снизились
до 0,002 и 0,008 мкг/мл соответственно после добавления синергетических активностей
Ловастатина и Таксола. Таким образом, эти результаты подтверждают ингибиторную активность
4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона из Antrodia camphorata, который можно применять для подавления
роста клеток рака печени, и показывают лучшую противоопухолевую синергетическую
активность при комбинации с Таксолом.
Пример 6
Анализ выживания in vitro для эффектов против рака простаты.
Модель скрининга противораковых лекарств NCI также применяли для анализа противораковых эффектов соединения, выделенного в примере 1 настоящего изобретения.
Выделенное соединение 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон из примера 1 добавляли в среду для культивирования
клеток рака простаты человека, LNCaP или DU-145, для анализа выживания опухолевых
клеток.
Клетки рака простаты человека LNCaP или DU-145 культивировали по отдельности в
средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение 24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 х трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отбрасывали,
а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком
встряхивании. Клетки помещали в 96-луночный планшет. Этанольные экстракты Antrodia
camphorata (контрольная группа, общие экстракты Antrodia camphorata без очистки) или
4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2енон (экспериментальная группа) добавляли в каждую из 96 лунок со следующей концентрацией: 30, 10, 3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкг/мл соответственно. Клетки инкубировали при
37 °С в 5 % CO2 инкубаторе в течение 48 часов. MTT добавляли с концентрацией
2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте и инкубировали в течение 4 часов, с последующим
добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полуингибирования (IC50) подсчитывали и указывали в табл. 5.
9
BY 16211 C1 2012.08.30
Таблица 5
Результаты анализа выживания in vitro для подавления клеток рака простаты
Образцы
IC50(мкг/мл)
Контрольная группа (экстракт из Antrodia camphorata)
LNCaP
11,491
DU-145
41,392
Экспериментальная группа (формула 1)
LNCaP
2,378
DU-145
1,812
Из результатов табл. 5 видно, что 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон является мощным ингибитором роста
клеточной линии рака простаты человека. Значения IC50 4-гидрокси-2,3-диметокси-6метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона для LNCaP и DU-145
составляют 2,378 и 1,812 мкг/мл соответственно, что значительно ниже, чем у общих экстрактов из Antrodia camphorata. Таким образом, 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон из Antrodia camphorata можно
применять для подавления роста клеток рака простаты.
Пример 7
Дополнительное исследование in vitro по адъювантной терапии клеток рака простаты.
Эксперимент также проводили в соответствии с in vitro моделью скрининга противораковых лекарств NCI. Клетки рака простаты человека LNCaP и DU-145 культивировали
по отдельности в средах, содержащих эмбриональную телячью сыворотку, в течение
24 часов. Пролиферировавшие клетки отмывали один раз ФБР, затем обрабатывали 1 х
трипсин-ЭДТА и центрифугировали при 1200 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную
жидкость отбрасывали, а осадок клеток ресуспендировали в 10 мл свежей среды для культивирования при легком встряхивании. Клетки LNCaP обрабатывали 0,0017 мг/мл Таксола в течение 72 часов, а DU-145 обрабатывали 0,0043 мг/мл Таксола в течение 72 часов,
перед помещением в 96-луночный планшет. 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енон, полученный в примере 1, добавляли в
каждую из 96 лунок в следующих концентрациях: 0 мкг/мл (контрольная группа); 30, 10,
3, 1, 0,3, 0,1 и 0,03 мкг/мл (экспериментальная группа) соответственно. Клетки инкубировали при 37 °С в 5 % CO2 инкубаторе в течение 48 часов. MTT добавляли с концентрацией
2,5 мг/мл в каждую лунку в темноте и инкубировали в течение 4 часов, с последующим
добавлением 100 мкл литического буфера для остановки реакции. Планшеты анализировали на ИФА-ридере при длине волны 570 нм для определения уровня выживания. Значения концентрации полуингибирования (IC50) подсчитывали и указывали в табл. 6.
Таблица 6
Результаты дополнительной терапии Таксолом in vitro клеток рака простаты
Образцы
Результаты
Контрольная группа
Уровень выживания клеток (%)
LNCaP (0,0017 мкг/мл Таксола)
56±3
DU-145 (0,0043 мкг/мл Таксола)
70+2
Экспериментальная группа
IC50 (мкг/мл)
LNCaP 3B (0,0017 мкг/мл Ловастатина + формула 2)
0,961
DU-145 (0,0043 мкг/мл Таксола + формула 2)
0,515
Из результатов табл. 6 видно, что значения IC50 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона для клеток рака простаты человека LNCaP и DU-145 снизились до 0,961 и 0,5158 мкг/мл соответственно после комбинации с Таксолом. Таким образом, эти результаты подтверждают ингибиторную активность
4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2енона из Antrodia camphoratа, который можно применять для подавления роста клеток ра10
BY 16211 C1 2012.08.30
ка простаты, и показывают лучшую противоопухолевую синергетическую активность при
комбинации с Таксолом.
Пример 8
Исследование антиоксидантной активности in vitro.
Человеческий липопротеин низкой плотности (LDL), окисленный ионом меди (Cu2+),
широко применяют для оценки антиоксидантной активности анализируемых образцов.
Антиоксидантную активность образца определяют по содержанию диенов в LDL после
окисления и выражают в эквивалентах Тролокса с применением стандартной кривой, рассчитанной по водорастворимому стандарту витамина E Тролоксу (значение 1 антиоксидантной активности соответствует 2 мкМ Тролокса).
Вначале готовили следующие растворы: бидистиллированную воду (отрицательная
контрольная группа), 5 мМ натрий-фосфатный буфер (НФБ), 1 и 2 мкМ раствор Тролокса
(положительная контрольная группа) и 40 мкг/мл 4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2-енона, выделенного в примере 1.
Концентрацию холестерина LDL (LDL-C) определяли с применением метода ферментативной реакции, готовя разведения до 0,1-0,25 мг/мл с помощью 5 мМ НФБ. Одну сотую
мкл LDL добавляли в каждую лунку 96-луночного кварцевого планшет, с последующим
добавлением вышеупомянутого Тролокса и соединения, выделенного в примере 1. Чтобы
индуцировать окисление, добавляли стандартизированный окисляющий агент CuSO4, до
конечной концентрации 5 мкМ в каждую 250 мкл лунку. Планшет анализировали на
ИФА-ридере при длине волны 232 нм, при 37 °С в течение 12 часов. Время отбора пробы
составило 15 минут. Результаты показаны в табл. 7.
Таблица 7
Результаты исследования антиоксидантной активности in vitro
Значения
Образцы
Tlag (мин)
∆Tlag (мин)
активности
Отрицательный контроль
H2O (Tlag0)
185
Положительный контроль
1 мкМ Тролокс
266
81
0,48
2 мкМ Тролокс
344
159
1,00
Экспериментальная группа
40 мкг/мл формулы 1
439
208
1,30
Замечание 1: Время лаг-фазы (Tlag, мин) определяли как пересечение лаг-фазы с фазой распространения поглощения при 234 нм. ATlag (мин) определяли как разницу во
времени между Tlag и Tlag0 для каждого образца.
Замечание 2: Считается, что соединение обладает антиоксидантной способностью, когда значение антиоксидантной активности больше 0,5.
Из результатов табл. 7 видно, что значение антиоксидантной активности
4-гидрокси-2,3-диметокси-6-метил-5-(3,7,11-триметилдодека-2,6,10-триенил)циклогекс-2енона составляет 1,3, что гораздо больше стандартного значения 0,5. Таким образом, соединения изобретения обладают антиоксидантной активностью, что может быть использовано для здорового питания, диет и напитков, медицинских продуктов и косметики, и
оказывают значительные благоприятные эффекты в отношении здоровья человека благодаря способности к профилактике сердечно-сосудистых заболеваний или мутации клеток.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
11
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
158 Кб
Теги
патент, by16211
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа