close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16221

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
BY (11) 16221
(13) C1
(19)
(46) 2012.08.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 7/00
C 12R 1/93
(2006.01)
(2006.01)
ШТАММ AVIAN INFLUENZA VIRUS КМИЭВ-V107 ШТАММ-АНТИГЕН
(21) Номер заявки: a 20091870
(22) 2009.12.24
(43) 2011.08.30
(71) Заявитель: Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Гусев Анатолий Алексеевич; Згировская Алла Александровна; Азарова Ирина Андреевна;
Ломако Юрий Васильевич; Насонов
Игорь Викторович; Минчук Юлия
Николаевна (BY)
(73) Патентообладатель: Республиканское
научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(56) ФРОЛОВ С.В. и др. // Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Т. V. - Владимир, 2007. С. 119-130.
RU 2323740 C1, 2008.
RU 2346982 C1, 2009.
RU 2361917 C1, 2009.
БОРИСОВ А.В. b др. // Ветеринария. 2008. - № 6. - С. 14-17.
BY 16221 C1 2012.08.30
(57)
Штамм avian influenza virus КМИЭВ-V107 - штамм-антиген.
Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к биотехнологии, и
может быть использовано для создания вакцин с высокой иммуногенностью.
Известен штамм вируса H5N1 "Новосибирский", который культивируется на 9-10суточных СПФ-эмбрионах, его биологическая активность составляет 109,0 ЭИД50/см3, гемагглютинирующая активность - 64 log2 [1].
Этот штамм является производственным, его используют для производства вакцины
против гриппа птиц подтипа H5.
Недостатком данного штамма является его высокая вирулентность, что приводит к гибели эмбрионов и уменьшению количества экстраэмбриональной жидкости, отбираемой у
эмбриона, соответственно, и объема вакцины.
Известен штамм вируса гриппа птиц подтипа H5N2 "Приморский", относящийся к семейству Orthomyxoviridae, вирионы плеоморфной, чаще округлой формы, диаметром 80120 нм. Штамм культивируется на 9-10-дневных эмбрионах кур, не вызывая их гибели в
течение 72-часовой инкубации при 37 °С. При введении восприимчивым птицам вызывает
образование напряженного иммунитета. Биологическая активность вируса 108,0 ЭИД50/мл.
Вирус штамма "Приморский" способен агглютинировать эритроциты птиц, морских свинок, кроликов, лошадей, овец и других животных, гемагглютинирующий титр 1 : 128 [2].
Недостатком данного штамма является его низкая биологическая активность.
BY 16221 C1 2012.08.30
Задачей настоящего изобретения является селекция выделенного ранее штамма avian
influenza virus КМИЭВ-V107, обладающего биологической активностью и высокой иммуногенностью, который может быть использован для конструирования диагностических и
профилактических препаратов.
Поставленная цель достигается тем, что в качестве штамма-антигена был селекционирован штамм avian influenza virus КМИЭВ-V107 - штамм-антиген, обладающий высокой
биологической активностью и высокой иммуногенностью.
Штамм avian influenza virus КМИЭВ-V107 депонирован в коллекции микроорганизмов
РУП "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского". Коллекционный
номер КМИЭВ-V107.
Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству Orthomixoviridae,
род Influenzavirus. A. Это РНК-содержащий вирус, состоящий из негативного фрагментированного нуклеокапсида спиральной симметрии.
Культурально-морфологические признаки. Вирус культивируется на 9-10-суточных СПФ-куриных эмбрионах при заражении в аллантоисную или амниотическую полость. Вирус агглютинирует эритроциты кур, морских свинок, кроликов, лошадей, овец.
Инфекционный титр вируса на СПФ-куриных эмбрионах составляет 8,5 lg ЭИД50/см3, гемагглютинирующий титр - 7,0-8,0 log2.
Морфологические признаки. РНК-содержащий вирус. Форма вириона близка к сферической с диаметром частиц 80-120 нм. Вирус состоит из фрагментированного нуклеокапсида спиральной симметрии и липопротеидной оболочки, на поверхности которой
имеются выступы двух видов. Негативный геном состоит из 8 фрагментов, каждый из которых кодирует определенный белок. Выступы 1-го вида образованы гемагглютинином
(НА). Выделено 15 подтипов гемагглютинина. Выступы 2-го типа образованы нейраминидазой (NA). Установлено 9 подтипов нейраминидазы.
Физико-биохимические свойства. Инактивируется формальдегидом, детергентами,
гидроксиламином, кислотами. При 55 °С инактивируется в течение 1 часа, при 60 °С - в
течение 10 минут. При низких температурах и в лиофилизированном состоянии сохраняется до 2 лет.
Молекулярно-биологические признаки. РНК вируса гриппа несет в себе информацию о 8 структурных и 2 неструктурных белках (один ген кодирует один или два белка).
Это полимеразные белки РВ1, РВ2, РВ3, поверхностные белки гемагглютинин и нейраминидаза, нуклеопротеид - NP, мембранные белки - M и неструктурные белки - NS.
Гены, кодирующие поверхностные белки, обладают наибольшей изменчивостью,
остальные же относительно консервативны.
Вирус состоит из двух слоев мембраны с заключенным в них нуклеокапсидом. Основой нуклеокапсида является рибонуклеопротеид, включающий вирусную РНК, белок NP и
3 белка полимеразного комплекса. Полипептид NP несет в себе антигенные детерминанты, определяющие типовую принадлежность штамма.
Белки полимеразного комплекса связаны с нуклеокапсидом и осуществляют синтез
всех типов РНК в новой популяции вирионов.
M-белок является типоспецифичным. Он в виде непрерывного молекулярного слоя
примыкает к наружной мембране, определяя структурную организацию последней. Мембранные белки функционируют как ионные насосы, регулируя уровень кислотности.
Неструктурные белки NS1 и NS2 вырабатываются вирусом гриппа в организме хозяина и препятствуют выработке клетками интерферона.
Гемагглютинин отвечает за прикрепление вируса к поверхности клетки хозяина, нейраминидаза, осуществляя ферментативную реакцию, способствует проникновению вируса
внутрь клетки хозяина и выходу вновь образовавшихся вирионов либо приводит к элюции
вируса с клеточной мембраной. Предполагается, что активность нейраминидазы помогает
вирусным частицам проникать через секреты слизистых оболочек, богатых сиаловой кис2
BY 16221 C1 2012.08.30
лотой. Таким образом, вирионы быстро достигают клеток-мишеней эпителия дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта.
Маркерные признаки. Гемагглютинин и нейраминидаза относятся к полипептидам с
высокой иммуногенной активностью. Гемагглютинин стимулирует синтез в организме
антител, нейтрализующих инфекционную активность вируса и тормозящих реакцию гемагглютинации. В экспериментальных условиях специфические антитела можно получить
на кроликах, крысах и морских свинках. Нейраминидаза по антигенной значимости является вторым после гемагглютинина вирусспецифическим полипептидом. Его изменчивость сопровождается появлением новых эпизоотически и эпидемически значимых
штаммов вируса гриппа типа A.
Онкогенность. Штамм вируса КМИЭВ-V107 не является онкогенным.
Данные о контаминации. Штамм вируса КМИЭВ-V107 не контаминирован.
Антигенная активность. Антигенная активность составляет не ниже 6,0 log2 в РТГА
у 85 % привитых цыплят.
Биологическая активность составляет не ниже 108,5 ЭИД50/см3.
Безвредность. Штамм вируса КМИЭВ-V107 непатогенен для цыплят.
Вирулентность. Штамм вируса КМИЭВ-V107 невирулентен.
Иммуногенность. Иммуногенность штамма вируса КМИЭВ-V107 составляет не менее 85 %.
Чувствительность к антибиотикам. Вирус резистентен к действию антибиотиков.
Способы и условия хранения. Хранят в сухом лиофилизированном состоянии при
температуре не выше 40 °С в течение 5 лет. Жизнеспособность его поддерживается путем
пассажа на СПФ-эмбрионах кур.
Условия консервации. Лиофильная сушка в защитной среде или при температуре не
выше минус 20 °С.
Пример 1
Выделение avian influenza virus КМИЭВ-V107.
Штамм avian influenza virus КМИЭВ-V107 выделяли на 9-10-суточных СПФэмбрионах кур, которых заражали надосадочной жидкостью, полученной после обработки
патологического материала, отобранного от птиц. Заражение проводили на хорионаллантоисную оболочку. Эмбрионы инкубировали в течение 72-96 часов при 37 °С с ежедневным овоскопированием, после чего производили отбор экстраэмбриональной жидкости.
Экстраэмбриональную жидкость проверяли на гемагглютинирующую активность вируса в
реакции гемагглютинации (РГА) на предметном стекле.
При отсутствии гемагглютинации в РГА проводили 3-5 "слепых" пассажей на эмбрионах, проверяя в каждом пассаже экстраэмбриональную жидкость на наличие гемагглютининов. Пробу исследуемого материала считать положительной, если в 3-5 пассажах
обнаруживали гемагглютинацию эритроцитов или патогенное действие вируса (гибель
эмбрионов)
Пример 2
Культивирование штамма avian influenza virus КМИЭВ-V107 в СПФ куриных эмбрионах.
Штамм avian influenza virus КМИЭВ-V107 культивировали на 9-10-суточных СПФэмбрионах кур. Эмбрионы заражали 103 эмбриональных инфекционных доз (ЭИД50/0,1 см3)
вируса с 20 мкг трипсина ("Sigma", Т1426) на хорионаллантоисную оболочку. Эмбрионы
инкубировали в течение 72-96 часов при 37 °С с ежедневным овоскопированием. Затем
эмбрионы вскрывали, отбирали экстраэмбриональную жидкость и проверяли ее в реакции
гемагглютинации. В случае размножения вируса в куриных эмбрионах полученная экстраэмбриональная жидкость должна агглютинировать эритроциты кур.
Установлено наличие размножения вируса в эмбрионах, что подтверждается гемагглютинацией эритроцитов кур (реакция положительная), титр составлял 1 : 256 (8,0 log2).
3
BY 16221 C1 2012.08.30
Пример 3
Определение биологической активности штамма avian influenza virus КМИЭВ-V107.
Биологическую активность штамма avian influenza virus КМИЭВ-V107 определяли
титрованием на развивающихся эмбрионах кур 9-10-дневной инкубации. Лиофильно высушенный вирус растворяли стерильным водным раствором натрия хлорида с массовой
долей 0,9 % (pH 7,2) в объеме, равном объему вируса до сушки. Из полученной пробы готовили разведения от 10-1 до 10-9 на стерильном водном растворе натрия хлорида с массовой долей 0,9 % (pH 7,2). Перед заражением скорлупу яйца в области воздушной камеры
протирали спиртовым раствором с массовой долей йода 5 % и фламбировали. Каждым
разведением вируса, начиная с 10-9, заражали по 4 эмбриона в ХАО в объеме 0,1 см3. В
качестве контроля оставляли 4 эмбриона, которых не заражали. После заражения эмбрионов отверстия в скорлупе заклеивали парафином. Зараженные и контрольные эмбрионы
инкубировали в течение 72-96 часов при (37 ± 1) °С и относительной влажности 60-70 %.
Овоскопию эмбрионов проводили 2 раза в сутки. Эмбрионы, павшие в течение 24 часов
после заражения, уничтожали, считая их гибель неспецифической. По истечению срока
инкубации все эмбрионы вскрывали (в том числе и павшие), отбирали экстраэмбриональную жидкость и исследовали ее в капельной реакции гемагглютинации (РГА) с 1 %-ным
раствором куриных эритроцитов.
Учет результатов титрования проводили по методу Кербера в модификации Ашмарина.
Биологическая активность штамма avian influenza virus КМИЭВ-V107 составляла 108,5
ЭИД50/см3.
Пример 4
Определение иммуногенной активности штамма avian influenza virus КМИЭВ-V107.
Иммуногенную активность штамма avian influenza virus КМИЭВ-V107 проверяли путем заражения цыплят 8-10-суточного возраста. С этой целью были сформированы опытная группа цыплят и контрольная, по 20 голов в каждой. Цыплят опытной группы
иммунизировали внутримышечно по 0,5 см3 в область грудной мышцы штаммом avian influenza virus КМИЭВ-V107. Контролем служила группа цыплят такого же возраста, которым вводили аналогичным способом плацебо (физиологический раствор). До
иммунизации (фон), а затем после нее на 14, 21 и 28 сутки у всех цыплят были отобраны
пробы крови, сыворотку которой исследовали в РТГА. Об иммуногенности штамма avian
influenza virus КМИЭВ-V107 судили по нарастанию титров специфических антител в сыворотках крови кур. Для определения титров использовали набор для лабораторной диагностики гриппа птиц (на 13 серотипов гемагглютинина) в РТГА.
Результаты изучения иммуногенной активности штамма avian influenza virus
КМИЭВ-V107 представлены в таблице.
Антигенная активность штамма avian influenza virus КМИЭВ-V107 в РТГА
Штамм вируса
Титры антител, 1оg2
14-е сутки
21-е сутки
фон
28-е сутки
Штамм avian influenza virus
0
2,0
6,0
7,0
КМИЭВ-V107
Как видно из таблицы, введение штамма avian influenza virus КМИЭВ-V107 цыплятам
приводило к нарастанию титров антител в сыворотках крови с 2,0 до 7,0 log2.
Таким образом, штамм avian influenza virus КМИЭВ-V107 обладает, по сравнению с
прототипом, более высокой биологической активностью 108,5 ЭИД50/см3 и может быть использован для изготовления вакцины в качестве штамма-антигена с высокими иммуногенными свойствами.
4
BY 16221 C1 2012.08.30
Источники информации:
1. Штамм для изготовления инактивированной вакцины против гриппа птиц (описание
антигенных и биологических свойств) / С.В.Фролов, Т.Б.Манин, И.П.Пчелкина и др. //
Труды Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2007. - Том V. С. 119-130.
2. Эффективность инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц
(H5N2) / А.В.Борисов, Д.С.Сурнев, В.П.Мельников, Д.А.Лозовой // Ветеринария. - 2008. № 6. - С. 14-17.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
99 Кб
Теги
by16221, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа