close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16444

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.10.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/50 (2006.01)
СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ СПОНТАННОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО
ПЕРИТОНИТА У БОЛЬНОГО ЦИРРОЗОМ ПЕЧЕНИ С АСЦИТОМ
(21) Номер заявки: a 20101821
(22) 2010.12.16
(43) 2012.08.30
(71) Заявитель: Гавриленко Дмитрий Иванович; Силивончик Наталья Николаевна; Малаева Екатерина Геннадьевна; Кобрусева Лариса Аркадьевна;
Шпаковский Юрий Петрович; Шулькина Елена Васильевна (BY)
(72) Авторы: Гавриленко Дмитрий Иванович; Силивончик Наталья Николаевна; Малаева Екатерина Геннадьевна; Кобрусева Лариса Аркадьевна;
Шпаковский Юрий Петрович; Шулькина Елена Васильевна (BY)
BY 16444 C1 2012.10.30
BY (11) 16444
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатели: Гавриленко Дмитрий Иванович; Силивончик Наталья
Николаевна; Малаева Екатерина Геннадьевна; Кобрусева Лариса Аркадьевна; Шпаковский Юрий Петрович;
Шулькина Елена Васильевна (BY)
(56) Руководство к практическим занятиям
по клинической лабораторной диагностике. - Киев: Выща школа, 1988. С. 189-192.
RU 2007128172 A, 2009.
RU 2235325 C2, 2004.
(57)
1. Способ диагностики спонтанного бактериального перитонита у больного циррозом
печени с асцитом, отличающийся тем, что осуществляют забор асцитической жидкости,
определяют в ней содержание лейкоцитов по активности лейкоцитарной эстеразы и диагностируют спонтанный бактериальный перитонит при содержании лейкоцитов выше 250
в 1 мкл.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что содержание лейкоцитов определяют с использованием тест-полоски для определения лейкоцитов в моче.
3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что перед определением лейкоцитов в асцитической жидкости определяют содержание эритроцитов, которые удаляют центрифугированием при их количестве более 10000 в 1 мкл.
Изобретение относится к области медицины, в частности к гастроэнтерологии и гепатологии, и может быть использовано для диагностики спонтанного бактериального перитонита (СБП) у больного циррозом печени с асцитом, в том числе геморрагического
характера.
Способ заключается в определении лейкоцитов по активности лейкоцитарной эстеразы в исследуемом образце асцитической жидкости (АЖ), в том числе геморрагического
характера, и позволяет диагностировать СБП у больного циррозом печени с асцитом.
Технический результат изобретения: создание быстрого, недорогого и доступного
способа диагностики СБП у больных циррозом печени с асцитом, в том числе геморрагического характера.
BY 16444 C1 2012.10.30
Ряд заболеваний протекает с инфицированием АЖ, например цирроз печени с развитием СБП, который является одним из вариантов первичного бактериального перитонита.
Основной механизм развития СБП - бактериальная транслокация микроорганизмов из
просвета кишечника в мезентериальные лимфатические узлы, а затем и в системный кровоток, АЖ [1]. При циррозе печени проявления СБП трудно диагностируются в связи с
неспецифическими клиническими признаками, а иногда и полным их отсутствием. Это
сказывается на своевременности назначения антибактериальных препаратов и прогнозе
для пациента.
Наиболее распространенным способом диагностики СБП и выбора лечения является
бактериологическое исследование асцитической жидкости с целью выявления микроорганизмов, их идентификации и определения чувствительности к антибактериальным средствам, для чего проводят посев АЖ на питательные среды. Колонии микроорганизмов,
выросшие на питательных средах, подвергают родовой и видовой идентификации для
определения их таксономической принадлежности и чувствительности к антибиотикам.
Для этого оценивают возможности роста бактерий в аэробных и анаэробных условиях, их
отношение к окраске по Грамму, характер роста на селективных питательных средах и
угнетения под действием антибактериальных препаратов и др. [2].
Недостатками этого способа является длительность получения результатов, использование дорогостоящих питательных сред, необходимость достаточного количества исследуемого материала (при применении посева 1 мл асцитической жидкости на обычные
среды высеваемость составляет всего 43 %, при использовании специальных флаконов для
посевов - 93 %), трудность анаэробного культивирования и др. [3, 4].
Известен также метод подсчета лейкоцитов в АЖ в гематологическом анализаторе [5,
6]. Метод достоверный, простой и быстрый, однако существует вероятность сбоя в работе
аппарата при наличии примесей в образцах АЖ (например, нитей фибрина). К тому же не
все лаборатории оснащены гематологическими анализаторами, что не позволяет использовать метод для рутинной диагностики СБП.
Предложен также способ выявления СБП на основании определения в АЖ количественного и качественного состава короткоцепочечных жирных кислот (уксусной, пропионовой, изомасляной и др.), которые являются метаболитами анаэробной и аэробной
микрофлоры [7]. Метод позволяет не только определить инфицированность АЖ, но и верифицировать микробный состав. Недостатками являются относительность результатов
(связаны с метаболической активностью микрофлоры), потеря до 15-20 % метаболитов в
процессе подготовки проб.
В качестве альтернативы подсчету лейкоцитов с помощью микроскопии предлагается
определение лактоферрина в АЖ. Уровень лактоферрина в биологических жидкостях увеличивается пропорционально количеству лейкоцитов. Однако имеющиеся данные об эффективности метода ограничены одним исследованием [8]. Кроме того, исследование
имеет высокую стоимость.
Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ диагностики СБП, основанный на подсчете содержания нейтрофильных лейкоцитов в АЖ в счетной камере при микроскопии. Цитоз в АЖ удобно определять аналогично счету клеток в
спинномозговой жидкости [9]. СБП диагностируется при количестве нейтрофилов 250 и
более в 1 мкл (≥250 кл/мкл) в отсутствии интраабдоминального источника инфицирования.
Однако способ-прототип является трудоемким и в некоторой степени субъективным.
Кроме того, при повышении pH и низкой осмолярности биологической жидкости ускоряется лизис лейкоцитов. Это приводит к быстрому уменьшению количества клеток и через
2-3 ч может произойти практически полное их разрушение [10].
Задачей настоящего изобретения является создание быстрого, недорогого и доступного способа диагностики СБП у больных циррозом печени с асцитом, в том числе геморрагического характера (содержание эритроцитов >10000 кл/мкл).
2
BY 16444 C1 2012.10.30
Изобретение основано на выявленном техническом результате, заключающемся в том,
что тест-полоски для исследования мочи можно использовать для диагностики СБП у пациента с циррозом печени с асцитом, в том числе при наличии в АЖ более 10000 эритроцитов в 1 мкл (геморрагический характер АЖ).
Способ основан на определении активности эстеразы нейтрофильных лейкоцитов и
позволяет относительно просто обнаруживать лейкоциты в АЖ. Нейтрофильные лейкоциты
содержат эстеразы, гидролизирующие аминокислотный эфир пиррола с освобождением
3-гидрокси-5-фенилпиррола. 3-гидрокси-5-фенилпиррол вступает в реакцию диазотирования, образуя пурпурную окраску аналитической зоны полоски. Интенсивность окраски
определяется числом нейтрофильных лейкоцитов в выпоте. Чувствительность метода подобрана таким образом, чтобы обеспечить отрицательную реакцию при нормальном числе
нейтрофильных лейкоцитов и положительную - при их увеличении [10, 11]. Другие типы
клеток, присутствующие в АЖ - эритроциты, эпителиальные клетки и бактерии не содержат эстеразу и не способны катализировать реакцию в тест-полоске. Реакция на эстеразу
может быть положительной в образцах АЖ, в которых нейтрофилы не были обнаружены
при микроскопии осадка АЖ. Это бывает при лизисе нейтрофилов в АЖ и выходе фермента из их цитоплазмы.
При сравнении окраски тест-полоски с окраской цветовой шкалы, если интенсивность
окраски аналитической зоны тест-полоски и цветовой шкалы близка или совпадает - концентрация исследуемого компонента в образце приближается или равна количественному
значению, указанному на шкале. Спонтанный бактериальный перитонит диагностируется
у больных ЦП при количестве нейтрофилов в АЖ 250 и более в 1 мкл (≥250 кл/мкл) в отсутствии интраабдоминального или хирургически леченого источника инфекции.
При количестве эритроцитов в АЖ более 10000 в 1 мкл (геморрагический характер АЖ)
оценка изменения интенсивности окраски аналитической зоны тест-полоски затруднена. В
таком случае следует осаждать эритроциты центрифугированием в течение 10 мин при
1500 об/мин, после чего погружать тест-полоску в надосадочную область образца АЖ.
Способ выполняется с помощью тест-полосок, традиционно используемых для исследования мочи. В нашей работе исследования были выполнены у 24 больных циррозом печени с асцитом (p<0,01). Использовались тест-полоски URISTIK A10 (фирмы DIRUI
Industrial Co.)
Способ осуществляют следующим образом.
Больному с подозрением на СБП проводят забор АЖ (5 мл) из брюшной полости при
парацентезе или путем пункции под контролем ультразвукового исследования (УЗИ). Затем в пробирку с образцом АЖ погружают тест-полоску на 2-3 секунды. При содержании
в АЖ эритроцитов более 10000 в 1 мкл (геморрагический характер АЖ) их осаждают в
пробирке центрифугированием в течение 10 мин при 1500 об/мин, после чего в образовавшуюся надосадочную область образца АЖ погружают тест-полоску на 2-3 секунды.
После смачивания тест-полоски в аналитических зонах происходит запуск химических
реакций. Через 2 мин сравнивают интенсивность окраски аналитической зоны тест-полоски
с окраской зон цветовой шкалы и оценивают результат, согласно которому делают вывод
о наличии или отсутствии СБП. Полученный положительный результат является основным критерием назначения антибактериального лечения.
Ниже приведены примеры наблюдения больных циррозом печени с диагностированным СБП с помощью тест-полосок для анализа мочи.
Пример 1.
Пациент 71 г. Диагноз: декомпенсированный цирроз печени неуточненной этиологии,
класс С, минимальной степени активности, печеночно-клеточная недостаточность, портальная гипертензия (коррекция портальной гипертензии - операция Сигоури в 2006 г.,
асцит, печеночная энцефалопатия 3 ст.). Острый герпетический стоматит. Респираторный
дистресс-синдром. Токсическая нефропатия. Двусторонняя гипостатическая пневмония.
Двусторонний гидроторакс. ДНΙΙ.
3
BY 16444 C1 2012.10.30
Жалобы: не детализирует. Из анамнеза известно: неоднократно госпитализировался в
стационары с диагнозом цирроз печени. В 2006 г. выполнена операция Сигоури для коррекции портальной гипертензии. При поступлении: состояние тяжелое. Кожные покровы
и склеры желтушные. Отмечается пастозность передней брюшной стенки, отеки голеней и
стоп. Периферические лимфоузлы не увеличены. В легких дыхание везикулярное, резко
ослабленное в нижних отделах. Частота дыхания 26 в мин. Тоны сердца приглушенные,
ритмичные, шумов нет. ЧСС 84 в мин. Живот увеличен в объеме за счет напряженного
асцита. Печень увеличена, выступает из-под края реберной дуги на 14 см. Селезенка не
пальпируется.
Проведенное обследование: общий анализ крови - эритроциты 2,39×1012/л, гемоглобин
97 г/л, лейкоциты 49×109/л, тромбоциты 31×109/л, палочкоядерные нейтрофилы 62 %, сегментоядерные нейтрофилы 20 %, лимфоциты 11 %, моноциты 7 %. Общий анализ мочи микроскопия осадка: эпителиальные клетки 1-2 в п/зр., лейкоциты 1-3 в п/зр., эритроциты
нет в п/зр., цилиндры гиалиновые 1-3 в п/зр. Биохимическое исследование крови: глюкоза
4,6 ммоль/л, белок общий 66,0 г/л, мочевина 19,9 ммоль/л, креатинин 184 мкмоль/л, общий билирубин 96,0 мкмоль/л, прямой билирубин 27,2 мкмоль/л, непрямой 68,8 мкмоль/л,
АЛТ 270 Е/л, ACT 630 Е/л, амилаза 42 Е/л.
Ультразвуковое исследование брюшной полости: визуализация печени затруднена
КВР = 182 мм, структура диффузно уплотнена, эхогенность повышена. Внутрипеченочные желчные протоки незначительно расширены. Воротная вена 14,5 мм. Селезенка отсутствует (удалена). Поджелудочная железа - эхогенность повышена, структура диффузно
неоднородная, визуализируется фрагментарно. В брюшной полости значительное количество свободной жидкости, в правом плевральном синусе не менее 170 мл, в левом не менее 500 мл. Заключение - эхо-картина может соответствовать циррозу, асцит, диффузные
изменения в поджелудочной железе, двусторонний гидроторакс.
Рентгенография органов грудной клетки и средостения: с двух сторон, больше справа
над диафрагмой и в синусах небольшое количество выпота. Справа над диафрагмой легочный рисунок сгущен и обогащен за счет высокого положения диафрагмы, коллабирование легкого, на фоне чего нельзя исключить присоединившиеся инфильтративные
изменения. Корни уплотнены, расширены. Сердце не увеличено. Заключение - двусторонний гидроторакс. При наличии клиники - гипостатическая пневмония справа.
Под контролем УЗИ проведен забор АЖ (40 мл) из брюшной полости.
Исследована АЖ: подсчет нейтрофильных лейкоцитов в счетной камере - 798 кл/мкл,
в автоматическом гематологическом анализаторе - 660 кл/мкл. Таким образом, диагноз
СБП при циррозе печени доказан.
При исследовании светло-желтой асцитической жидкости с помощью тест-полоски
выявлены следующие изменения: по интенсивности окраски тест-полоски уровень лейкоцитов - "большое содержание" (500 кл/мкл; 3+).
Пример 2.
Пациентка 57 лет. Диагноз: цирроз печени, неуточненной этиологии, класс тяжести С,
неактивный, гепатоцеллюлярная недостаточность, портальная гипертензия в стадии декомпенсации (асцит, правосторонний гидроторакс, гепаторенальный синдром, печеночная
энцефалопатия 2-3 ст.).
Поступила с жалобами: боль в животе, увеличение живота, отеки на голенях. Из
анамнеза известно: считает себя больной около 3 лет, когда появилась и стала нарастать
слабость, увеличился в размерах живот. Настоящее ухудшение около месяца, когда к вышеуказанным жалобам присоединились боли в животе. При поступлении: кожные покровы и склеры желтушной окраски. Отмечается пастозность передней брюшной стенки,
голеней. В легких дыхание жесткое, несколько ослабленное над правым легким. Частота
дыхания 17 в 1 мин. Тоны сердца приглушенные, ритмичные, шумов нет. ЧСС 84 в 1 мин.
Живот увеличен в объеме за счет ненапряженного асцита, болезненный при пальпации в
4
BY 16444 C1 2012.10.30
правом подреберье. Печень увеличена, выступает из-под края реберной дуги на 10 см. Селезенка не пальпируется.
Проведенное обследование: общий анализ крови - эритроциты 2,38×1012/л, гемоглобин
84 г/л, лейкоциты 13,6×109/л, палочкоядерные нейтрофилы 38 %, сегментоядерные
нейтрофилы 54 %, лимфоциты 5 %, моноциты 3 %, СОЭ 35 мм/ч. Общий анализ мочи микроскопия осадка: эпителиальные клетки 12-15 в п/зр.; лейкоциты 8-10 в п/зр.; эритроциты 2-4 в п/зр.; бактерии, дрожжевые грибки. Биохимическое исследование: глюкоза 4,3
ммоль/л; холестерин 4,1 ммоль/л, белок общий 78,3 г/л, альбумин 33,6 г/л, общий билирубин
120,8 мкмоль/л, прямой билирубин 63,4 мкмоль/л, АЛТ 0,12 мккат/л, ACT 0,09 мккат/л,
щелочная фосфатаза 91 ед/л; амилаза 116 ед/л.
Ультразвуковое исследование брюшной полости: печень значительно увеличена - правая доля ККР = 170 мм, КВР = 130 мм; левая доля ККР = 100 мм. Структура неоднородная, контуры бугристые. Печеночные вены обычно диаметра, воротная вена расширена до
15 мм. Желчный пузырь не виден из-за значительного количества жидкости в брюшной
полости. Селезенка: контуры четкие, размеры нормальные (115×42 мм). Поджелудочная
железа и почки без особенностей.
Рентгенография органов грудной клетки и средостения: очаговых и инфильтративных
изменений не выявлено. Легочный рисунок деформирован. Контуры диафрагмы ровные,
синусы свободные. Сердце расширено в поперечнике. Посттравматическая деформация
ребер справа. Слева в междолевой плевре незначительный выпот. Заключение: кардиомегалия, левосторонний междолевой осумкованный гидроторакс.
Под контролем ультразвукого исследования произведена пункция брюшной полости.
Аспирировано 40 мл светло-красной АЖ. Асептическая повязка.
Исследована АЖ: подсчет нейтрофильных лейкоцитов в счетной камере - 1360 кл/мкл,
в автоматическом гематологическом анализаторе - 960 кл/мкл. Таким образом, диагноз
СБП при циррозе печени доказан.
При определении лейкоцитов в АЖ с использованием тест-полоски получены следующие результаты:
в нативном образце оценка интенсивности окраски аналитической зоны тест-полоски
не представляется возможной из-за геморрагического характера выпота;
в другом образце АЖ после осаждения эритроцитов центрифугированием в течение
10 мин при 1500 об/мин образовалась надосадочная прозрачная область, которую использовали для дальнейшего исследования: после погружения и извлечения тест-полоски выявлено изменение окраски аналитической зоны, соответствующее положительному
результату ("большое содержание" лейкоцитов; 500 кл/мкл; 3+).
Таким образом, предлагаемый способ позволяет быстро и достоверно диагностировать
СБП на основании определения в АЖ лейкоцитов по активности лейкоцитарной эстеразы
с использованием тест-полоски для определения лейкоцитов в моче.
Источники информации:
1. Almelda J., Galhenage S., Yu J. et al. Gut flora and bacterial translocation in chronic liver
disease // World J. Gastroenterol. - 2006. - Vol. 12. - P. 1493-1502.
2. Джавец Э., Мельник Дж., Эйдельберг Э. Руководство по медицинской микробиологии: Пер. с англ. под ред. д.м.н. Т.В. Перадзе / - М.: Медицина, 1982. Т. 2. - С. 273-292.
3. Аншелевич Ю. Проблема спонтанного бактериального перитонита в современной
медицине // Терапевт. арх. - 2000. - № 2. - С. 69-70.
4. Буеверов А. Асцит как осложнение цирроза печени // Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. - 2001. - № 6. - С. 24-28.
5
BY 16444 C1 2012.10.30
5. Riggio O., Angeloni S., Parente A. et al. Accuracy of the automated cell counters for
management of spontaneous bacterial peritonitis // World J. Gastroenterol. - 2008. - Vol. 14. P. 5689-5694.
6. Koulaouzidis A., Bhat S., Saeed A.A.Spontaneous bacterial peritonitis // World J. Gastroenterol. - 2009. - Vol. 15. - P. 1042-1049.
7. Патент РФ 2002122771/15.
8. Parsi M., Saadeh S., Zein N. et al. Ascitic fluid lactoferrin for diagnosis of spontaneous
bacterial peritonitis // Gastroenterology. - 2008 - Vol. 135. - P. 803-807.
9. Базарнова М.А. и др. Руководство к практическим занятиям по клинической лабораторной диагностике: учебное пособие / Под общ. ред. М.А.Базарновой, В.Т.Морозовой. Киев: Выща школа, 1988. - 318с. (прототип)
10. Швецова Д.Г., Козлов А.В. Применение тест-полосок для определения состава
мочи // TERRA MEDICA nova - [Электронный ресурс]. - 2006. - Режим доступа:
http://www.terramedica.spb.ru/ld2_2006/shvecova/htm. - Дата доступа: 13.12.2010.
11. Kusumi R., Grover P., Kunin C. Rapid detection of pyuria by leukocyte esterase activity //
JAMA. - 1981. - Vol. 245. - P. 1653-1655.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
105 Кб
Теги
by16444, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа