close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16576

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.12.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 16576
(13) C1
(19)
A 61K 39/12
C 12N 5/074
(2006.01)
(2010.01)
СПОСОБ ИММУНОТЕРАПИИ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА В
(21) Номер заявки: a 20091796
(22) 2009.12.16
(43) 2011.08.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и
микробиологии" (BY)
(72) Авторы: Титов Леонид Петрович;
Гончаров Андрей Евгеньевич; Жмуровская Людмила Степановна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и
микробиологии" (BY)
(56) CHEN M. et al. World Journal of Gastroenterology. - 2005. - V. 11. - No. 12. P. 1806-1808.
AKBAR S.M.F. et al. World Journal of
Gastroenterology. - 2006. - V. 12. - No.
18. - P. 2876-2883.
BY 12361 C1, 2009.
BY 16576 C1 2012.12.30
(57)
Способ иммунотерапии хронического гепатита B, заключающийся в том, что выделяют в стерильных условиях из периферической крови больного моноциты, культивируют
их до получения незрелых моноцитарных дендритных клеток, праймируют полученные
клетки HBs-антигеном, после чего индуцируют созревание клеток до экспрессии CD11с
не менее 90 %, CD86 не менее 80 %, а CD83 не менее 80 % и после контроля стерильности
полученную культуру зрелых моноцитарных дендритных клеток вводят больному внутрикожно или подкожно трехкратно с интервалом в 2-3 недели.
Изобретение относится к области медицины, в частности к методам клеточной биотехнологии, и может быть использовано с целью специфической иммунотерапии дендритными клетками (ДК) больных хроническим гепатитом В (ХГВ).
Для терапии больных хроническими инфекционными и онкологическими заболеваниями используют ДК, полученные из моноцитов [1, 2]. Праймирование "зрелых" ДК соответствующими антигенами позволяет получить антигенспецифические ДК.
Известен способ иммунотерапии больных ХГВ с использованием ДК, который включает получение моноцитарных ДК из периферической крови больных ХГВ, праймирование HBs-антигеном полученных клеток и двукратное их внутримышечное введение
больным [3].
Недостатками такого способа иммунотерапии являлись:
1) культуры ДК культивировали на стандартных питательных средах с добавлением
пулированной донорской AB-сыворотки, что нежелательно с точки зрения биобезопасности;
2) использование "незрелых" ДК со сниженной экспрессией молекул костимуляции и
активации, что не позволяет получить достаточный терапевтический эффект;
BY 16576 C1 2012.12.30
3) контроль микробной контаминации культур ДК не осуществляли, что является совершенно неприемлемым;
4) не проводили контроль иммунофенотипа;
5) использованный способ введения - внутримышечный - не является оптимальным с
учетом путей миграции ДК в организме;
6) кратность введения - 2 раза - является недостаточной, что было продемонстрировано в экспериментах по лечению онкологических заболеваний с использованием ДК.
Задачей изобретения является разработка способа иммунотерапии ХГВ, который обладал бы преимуществами перед ранее использованными методами.
Задача достигается тем, что способ иммунотерапии ХГВ реализуется следующим образом: выделяют в стерильных условиях из периферической крови больного моноциты,
культивируют их до получения незрелых моноцитарных дендритных клеток, праймируют
полученные клетки HBs-антигеном, после чего индуцируют созревание клеток до экспрессии CD11c не менее 90 %, CD86 не менее 80 %, а CD83 не менее 80 % и после контроля стерильности полученную культуру зрелых моноцитарных дендритных клеток
вводят больному внутрикожно или подкожно трехкратно с интервалом не менее 2-3 недель.
Способ осуществляют следующим образом:
1) из периферической крови выделяют моноциты, которые культивируют на бессывороточной среде AIM-V, содержащей рекомбинантные человеческие цитокины - гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ) и интерлейкин-4
(ИЛ-4) для индукции дифференцировки моноцитов в ДК;
2) ДК праймируют 10 мкг/мл HBs-антигена на протяжении 6 часов;
3) в качестве индуктора созревания моноцитарных ДК используют комбинацию рекомбинантного человеческого фактора некроза опухолей-α (ФНО-α) и N6,2'-O-дибутириладенозин 3',5'-цАМФ (дибутирил-цАМФ) [4];
4) проводят контроль зрелости ДК путем определения их иммунофенотипа (относительное число ДК в культуре, экспрессирующих молекулу CD11с, не должно быть менее
90 %, CD86 - менее 80 %, a CD83 - менее 50 %);
5) проводят контроль на наличие контаминации бактериями и дрожжеподобными грибами путем посева на тиогликолевую среду и среду Сабуро;
6) введение ДК осуществляют трехкратно с интервалом в 2-3 недели;
7) в процессе лечения контролируют общее состояние пациента, показатели вирусной
нагрузки, уровни трансаминаз, щелочной фосфатазы, определяют иммунный статус пациента.
Сущность изобретения иллюстрируется следующим примером.
Пример.
В 2008-2009 гг. в соответствии с программой клинических испытаний, утвержденной
решением Комиссии по способам профилактики, диагностики, лечения, организационным
формам работы Министерства здравоохранения РБ (протокол заседания от 23.05.2008) и
письмом Министерства здравоохранения РБ (№ 09-15/836-326 от 5.08.2008) на базе УЗ
"Городская инфекционная больница" проведены клинические испытания "Способа лечения хронического гепатита В с использованием аутологичных моноцитарных дендритных
клеток".
Получение культур "незрелых" ДК. Эксперименты проводили на "незрелых" моноцитарных ДК, полученных из моноцитов, выделенных адгезией на пластиковых культуральных планшетах. Из крови больных ХГВ центрифугированием на градиенте плотности
фиколл-пака выделяли фракцию мононуклеаров периферической крови (МПК), затем из
полученной суспензии клеток выделяли моноциты методом адгезии на пластике. Для получения "незрелых" ДК моноциты культивировали 7 суток в питательной среде AIM-V,
содержащей рекомбинантыые человеческие цитокины (50 нг/мл ГМ-КСФ и 25 нг/мл ИЛ-4).
2
BY 16576 C1 2012.12.30
Праймирование и индукция созревания ДК. ДК культивировали на протяжении 6 часов в питательной среде с 10 мкг/мл HBs-антигена. Затем ДК отмывали от HBs-антигена и
культивировали в питательной среде, содержащей 25 нг/мл ГМ-КСФ и 12,5 нг/мл ИЛ-4, а
также ФНО-α (50 нг/мл) и дибутирил-цАМФ (500 мкг/мл) в качестве индуктора созревания. Клетки культивировали при 37 °С в увлажненной атмосфере с 5 % CO2 в течение
18 часов. Проводили контроль на наличие контаминации бактериями и дрожжеподобными
грибами.
Введение ДК осуществляли трехкратно с интервалом в 2-3 недели. Количество введенных ДК составило в среднем 19,6 ± 4,9 × 106. В процессе лечения контролировали общее состояние пациента, показатели вирусной нагрузки, уровни трансаминаз, щелочной
фосфатазы, определяли иммунный статус.
Результаты. 1. Показана безопасность и эффективность проведенной иммунотерапии.
Побочных эффектов в ходе исследования выявлено не было. 2. В результате проведенных
клинических испытаний эффективность способа иммунотерапии оценивается как положительная у 100 % больных. Согласно данным показателя вирусной нагрузки, после проведения клинических испытаний происходило снижение количества копий вируса в крови у
всех пациентов. 3. У всех пациентов отмечалось снижение уровня аланин-аминотрансферраза и повышение общего белка, что свидетельствует о снижении некрозовоспалительного синдрома и улучшении белковосинтетической функции печени. У 50 %
пациентов наблюдалось снижение активности щелочной фосфатазы, что может свидетельствовать об уменьшении синдрома холестаза. 4. У 75 % пациентов отмечается увеличение показателя соотношения CD4/CD8, увеличение содержания CD16 + и CD56 + клеток,
что может указывать на активацию противовирусного иммунитета.
Источники информации:
1. Nencioni A., Grünebach F., Schmidt S.M., Müller M.R., Boy D., Patrone F., Ballestrero A.,
Brossart P. The use of dendritic cells in cancer immunotherapy // Grit. Rev. Oncol. Hematol. 2008. - Vol. 65. - No. 3. - P. 191-199.
2. Berzofsky J.A., Ahlers J.D., Janik J., Morris J., Oh S., Terabe M., Belyakov I.M. Progress
on new vaccine strategies against chronic viral infections // J. Clin. Invest. - 2004. - T. 114. No. 4. - С. 450-462.
3. Chen M., Li Y., Zhang D., Wang Z., Zeng W., Shi X., Guo Y., Guo S., Ren H. Therapeutic effect of autologous dendritic cell vaccine on patients with chronic hepatitis B: a clinical
study // World J. Gastroenterol. - 2005. - T. 11. - No. 12. - С. 1806-1808.
4. Патент BY 12361, МПК C 12 N 5/00, 2009.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
75 Кб
Теги
by16576, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа