close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16681

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.12.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 33/577
(2006.01)
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХСЦЕПЛЕННОЙ И АУТОСОМНО-РЕЦЕССИВНОЙ ФОРМЫ
АГАММАГЛОБУЛИНЕМИИ
(21) Номер заявки: a 20101432
(22) 2010.10.06
(43) 2012.06.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии" (BY)
(72) Авторы: Шарапова Светлана Олеговна; Белевцев Михаил Владимирович; Алешкевич Светлана Николаевна; Мигас Александр Александрович (BY)
BY 16681 C1 2012.12.30
BY (11) 16681
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: Государственное
учреждение "Республиканский научнопрактический центр детской онкологии,
гематологии и иммунологии" (BY)
(56) MEFFRE E. et al. J. Clin. Invest. - 1996. V. 98. - No. 7. - P. 1519-1526.
JEROEN G. et al. Pediatric Research. 2002. - V. 51. - No. 2. - P. 159-168.
MAURICE R.G. et al. Clinical and Applied Immunology Reviews. - 2002. No. 2. - P. 321-335.
JP 8205898 A, 1996.
US 5106728 A, 1992.
НОВИКОВ П.Д. и др. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2005. - №2. - С. 8-22.
(57)
Способ дифференциальной диагностики Х-сцепленной и аутосомно-рецессивной
формы агаммаглобулинемии, заключающийся в том, что, используя моноклональные антитела CD19, CD10, CD34, проводят иммунофенотипический анализ от 200000 до 500000
клеток костного мозга пациента, выявляют CD19+ клетки, идентифицируют про-Влимфобласты по экспрессии CD19+CD10+CD34+, пре-В-лимфобласты - по экспрессии
CD19+CD10+CD34–, и диагностируют Х-сцепленную агаммаглобулинемию при выявлении блока дифференцировки В-лимфоцитов на стадии пре-В-лимфобластов или аутосомно-рецессивную агаммаглобулинемию при выявлении блока дифференцировки В-лимфоцитов на стадии про-В-лимфобластов.
Изобретение относится к медицине, к иммунологии и гематологии, а именно к диагностике врожденной агаммаглобулинемии (первичному иммунодефициту).
Врожденная агаммаглобулинемия - это наследственное заболевание иммунной системы, дефицит гуморального звена, вызванный блоком дифференцировки В-лимфоцитов в
костном мозге, которое характеризуется низким уровнем/отсутствием иммуноглобулинов
в сыворотке крови и отсутствием циркулирующих B-лимфоцитов (CD 19+B лф < 2 %).
Данный иммунодефицит существует в двух формах: X-сцепленной и аутосомнорецессивной.
BY 16681 C1 2012.12.30
Около 80-85 % пациентов с врожденной агаммаглобулинемией - мальчики, в большинстве случаев при тщательном анализе семейной истории можно выявить наследование
по материнской линии, подтверждающее агаммаглобулинемию, сцепленную с Xхромосомой (X-linked agammaglobulinemia, XLA) [1]. Данный диагноз вызван мутацией в
гене ВТK, локализованном на Х-хромосоме. Ген кодирует белок с протеазной активностью, известный как ВТK (Bruton tyrosine kinase, Брутон тирозин киназа), необходимый
для нормальной дифференцировки B-лимфоцитов. ВТК экспрессируется не только в Bлимфоцитах, но и в моноцитах, тромбоцитах периферической крови человека. У пациентов с низким количеством B-лимфоцитов возможна детекция внутриклеточной экспрессии
протеина в других типах клеток с помощью моноклональных антител методом проточной
цитофлуорометрии. Отсутствие ВТK точно подтверждает XLA, но для выявления генетической основы требуется мутационный анализ. Но, учитывая, что белок кодируется Ххромосомой, то в большинстве случаев мамы являются носителями патологического гена,
и при исследовании у них экспрессии ВТK в моноцитах можно выявить две популяции:
одна с нормальным уровнем белка, другая с нарушенной экспрессией [2]. Это явление вызвано рандомной инактивацией либо нормальной X-хромосомы, либо патологической. В
некоторых случаях при мутации гена ВТK возможна экспрессия белка ВТK, который
практически не функционирует.
Недостаток известных способов: невозможно провести дифференциальную диагностику агаммаглобулинемии, сцепленной с X-хромосомой и агаммаглобулинемией с аутосомно-рецессивным типом наследования, так как при некоторых мутациях в гене ВТK
белок ВТK все-таки экспрессируется в моноцитах, что может дать ложноположительный
результат определения вида агаммаглобулинемии.
Агаммаглобулинемия с аутосомно-рецессивным типом наследования встречается гораздо реже X-сцепленной [3]. Болеют как мальчики, так и девочки. В иммунограмме такие
же результаты как при агаммаглобулинемии Брутона, но за патогенез отвечают пять разных генов: ген тяжелой µ-цепи, Igα (CD79a), BLNK, λ5, LRRC8. Продукт каждого из этих
генов играет важную роль в созревании предшественников B-лимфоцитов, и, следовательно, пациенты имеют очень низкое число B-лимфоцитов в периферической крови.
Возможности проточной цитометрии позволяют определять продукты почти всех описанных генов путем внутриклеточной детекции в образцах костного мозга пациентов.
Недостатком приведенного исследования является то, что авторы исследуют только
аутосомную агаммаглобулинемию, предлагают догоростоящую методику для определения мутаций в ряде генов.
Дефекты вышеописанных генов приводят к остановке дифференцировки Bлимфоцитов на стадии от про-B к пре-B в костном мозге, что на стадию раньше, чем при
агаммаглобулинемиии Брутона [4].
Недостатком является то, что не исследуют образцы здорового костного мозга для выявления числа предшественников B-лимфоцитов.
Задача предполагаемого изобретения состоит в том, чтобы провести дифференциальную диагностику X-сцепленной и аутосомно-рецессивной форм агаммаглобулинемии для
выбора пациентов для мутационного анализа гена ВТK и дальнейшего генетического консультирования семьи.
Поставленную задачу решают тем, что осуществляют дифференциальную диагностику X-сцепленной и аутосомно-рецессивной форм агаммаглобулинемии путем проведения
поверхностного иммунофенотипического анализа предшественников B-лимфогемопоэза в
образце цельного костного мозга, основанного на использовании моноклональных антител с определенной специфичностью (контроль изотипа антител, CD10, CD34, CD19). Диагностируют аутосомно-рецессивную форму агаммаглобулинемии в костном мозге
пациента при относительном содержании про-B-клеток (CD19+CD10+CD34+) от общего
количества В-лимфоцитов (CD19+) более 75 %, проводят анализ про-В-клеток путем вы2
BY 16681 C1 2012.12.30
ставления вторых ворот на живых В-лимфоцитах CD19+ по экспрессии маркеров CD10+ и
CD34+ на CD19+ В-клетках. CD19+CD10+CD34+ анализируют как про-B-клетки,
CD19+CD10+CD34– как пре-B1-клетки, CD19+CD10–CD34– как зрелые B-клетки. Xсцепленную форму агаммаглобулинемии диагностируют при блоке дифференцировки на
стадии от про-B к пре-B-лимфобластам (про-B-клеток от CD19+ равно и менее 75 %). Для
проведения иммунофенотипического анализа необходимо записывать от 200000 до 500000
клеток костного мозга пациента.
Способ осуществляют следующим образом.
Способ включает определение субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга, основан на использовании цельного костного мозга:
костный мозг набирают в пробирки с консервантом (ЭДТА) в объеме от 2,5 до 5,0 мл в
зависимости от клеточности образца. Костный мозг разливают по 100 мкл в 5-мл полистиреновые пробирки (Beckman Coulter, USA) и добавляют по 10 мкл каждого из моноклональных Ат: контроль изотипа антител, CD 10 FITC, CD34 РЕ, CD 19 РС-5 (РС-7).
Образцы инкубируют в станции пробоподготовки Beckman Coulter TQ prep (USA) 10 минут при комнатной температуре. Затем автоматически станция раскапывает оригинальные
(Immunoprep Reagent System (Beckman Coulter)) лизирующий и фиксирующий растворы в
образцы, которые через 20 минут готовы для записи на проточном цитофлуориметре Cytomics FC500 (Beckman Coulter).
Анализ полученных данных на проточном цитофлуориметре приведен на фиг. 1 дифференцировка B-лимфоцитов здорового донора. На фиг. 1А показаны данные проточного цитофлуориметра, нормальное светорассеяние лейкоцитов и лимфоцитов костного
мозга. По этим данным выставляют первые ворота на живых лимфоцитах по FSC/SSC
костного мозга. На фигуре 1Б показаны данные проточного цитофлуориметра, по которым
выставляют вторые ворота на живых В-лимфоцитах CD 19+. На фигуре 1В показана экспрессия маркеров CD 10+ и CD34+ на В-клетках здорового костного мозга.
CD19+CD10+CD34+ про-B-клетки CD19+CD10+CD34– пре-В1-клетки, CD19+CD10–
CD34– зрелые B-клетки.
На фиг. 2 представлены данные проточной цитофлуориметрии, отражающие блок
дифференцировки В-лимфоцитов в костном мозге у пациентов с X-сцепленной агаммаглобулинемией и аутосомно-рецессивной формой агаммаглобулинемии. На фиг. 2А видно, что дифференцировка В-лимфоцитов остановлена на стадии CD19+CD10+CD34– преB1-клеток, что соответствует X-сцепленной агаммаглобулинемии. На фигуре 2Б остановка дифференцировки на стадии CD19+CD10+CD34+ про-B-клетки (88,7 % от CD 19+).
Для осуществления способа необходимо учитывать, что число B-лимфоцитов у пациентов с агаммаглобулинемией резко снижено и в костном мозге, для анализа данных популяций необходимо записывать большое количество клеток (200000-500000) для возможности анализа B-клеток.
Данный способ диагностики апробирован на 12 пациентах с агаммаглобулинемией.
У пяти пациентов проведено исследование блока дифференцировки B-лимфоцитов в
костном мозге методом проточной цитометрии. Для контроля исследованы образцы костного мозга здоровых доноров (из Германии) для трансплантации детям с онкогематологической патологией в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии.
При исследовании костного мозга у пациентов с агаммаглобулинемией выявлено, что
у 3 пациентов блок дифференцировки B-клеток в костном мозге на стадии
CD19+CD10+CD34+ про-B-клетки (процент про-B-клеток от CD 19+ более 75 %), у 2 пациентов - на стадии CD19 + CD10 + CD34– пре-B1-клеток, что соответствует X-сцепленной агаммаглобулинемии (про-B-клеток от CD 19+ равно и менее 75 %). У всех
пациентов с блоком дифференцировки на стадии пре-B1 обнаружена мутация в гене ВТK.
Данные представлены в таблице.
3
BY 16681 C1 2012.12.30
Основным преимуществом предлагаемого способа дифференциальной диагностики по
сравнению с известными и уже существующими способами является возможность разделения двух видов агаммаглобулинемии, которые клинически проявляются одинаково, но
имеют различную патогенетическую основу.
Отличительные признаки нашего изобретения:
способ дешевле, методологически проще в исполнении,
диагностический результат можно получить в течение часа после забора костного мозга.
Относительное содержание (% от B-лимфоцитов по CD 19+) субпопуляций предшественников B-лимфопоэза у пациентов с агаммаглобулинемией
CD19+CD10+CD34– CD19+CD10– CD19+CD10–
Пациент CD19+CD10+CD34+, %
%
CD34– %
CD34+ %
Пациент 1
68,4
0,6
1,7
0,6
Пациент 2
37,6
0
4
0
Пациент 3
79
1,5
5,3
3
Пациент 4
87,9
2,2
0,2
5,5
Пациент 5
88,7
3,8
0
7,5
Клинические примеры, иллюстрирующие заявляемый в качестве изобретения способ
диагностики.
Пример 1.
Больной М.А. 2006 г.р. до 2 месяцев находился на грудном вскармливании, брат болен
врожденной агаммаглобулинемией. В анамнезе: ОРВИ, острые кишечные заболевания не
инфекционной этиологии, анемия, ветряная оспа. При поступлении в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии в двухлетнем возрасте у больного обнаружено полное отсутствие иммуноглобулинов в сыворотке крови (IgG = 0,0 г/л, IgM=0,05 г/л,
IgA = 0,01 г/л) и B-лимфоцитов CD19+ = 0 % (норма 5-15 %). При типировании костного
мозга на предмет дифференцировки В-лимфоцитов обнаружен блок на стадии от про-B к
пре-B1-клеток CD19 + CD10 + CD34– пре-B1-клеток (68,4 % про-B-клеток, что меньше
75 %), в дальнейшем был выполнен мутационный анализ гена ВТK и обнаружена мутация
NM_000061:c. 1287A > G. Данная мутация обнаружена и у брата. Выставлен диагноз - Хсцепленная агаммаглобулинемия.
Пример 2.
Больной Ш.В. 1993 г.р. У матери от III родов IV беременности, I ребенок умер в 1 год
10 мес. (патологоанатомический диагноз - генерализованная вирусная инфекция), сестра
больна агаммаглобулинемией. Заболел в 11 месяцев, после 1 года неврит седалищного нерва с вялым парезом правой ноги, вакцин-ассоциированный полиомиелит (ВАМП) был
подтвержден. В анамнезе: частые ОРИ, подмышечный левосторонний гидроденит. В иммунограмме при поступлении в РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии:
B-лимфоциты - 0 %, IgG = 1,03 г/л, IgM = 0,04 г/л, IgA = 0,05 г/л. В костном мозге блок
дифференцировки на стадии CD19+CD10+CD34+ про-B-клетки (процент про-B-клеток от
CD 19 + > 87 %). Диагностирована агаммаглобулинемия с аутосомно-рецессивным типом
наследования.
Таким образом, предлагаемый способ дифференциальной диагностики является быстрым, информативным, надежным и может быть рекомендован для использования в медицинских учреждениях Министерства здравоохранения Республики Беларусь.
Источники информации:
1. Futatani Т. Deficient expression of Bruton's tyrosine kinase in monocytes from X-linked
agammaglobulinemia as evaluated by a flow cytometric analysis and its clinical application to
carrier detection// Blood. - 1998. - Vol. 91. - No. 2. - Р. 595-602.
4
BY 16681 C1 2012.12.30
2. Oliveira J.B., Notarangelo L.D., Fleisher T.A. // Application of flow cytometry for study
of primary immune deficiencies// Curr Opin Allergy Clin Immunol. - 2008. - No. 8. - P. 499-509.
3. Lougaris V. et all Autosomal recessive agammaglobulinemia: novel insights from mutations in Ig-beta// Curr Allergy Asthma Rep. - 2008. - No. 8(5). - P. 404-408.
4. Marodi L., Notarangelo L. D. Immunological and genetic bases of new primary immunodeficiencies// Nat Rev Immunology. - 2007. - Vol. 7. - Р. 851-861.
Фиг. 1
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
401 Кб
Теги
by16681, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа