close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16698

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2012.12.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 16698
(13) C1
(19)
C 12N 7/00
(2006.01)
СПОСОБ КРИОКОНСЕРВИРОВАНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ
МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
(21) Номер заявки: a 20101124
(22) 2010.07.22
(43) 2012.02.28
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Рахуба Денис Викторович;
Новик Галина Ивановна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(56) KEOGH B.P. et al. Applied Microbiology. - 1966. - V. 14. - No. 3. - P. 421-424.
РАХУБА Д.В. и др. Молодежь в
науке. - 2007. - Весцi Нацыянальнай
акадэмii навук Беларусi: Приложение.
- В 4-х ч. Ч. 1. - Серия биологических
наук. - Серия медицинских наук. Минск: Беларусская наука, 2008. - С.
225-230.
КАДЕТОВ В.В. и др. Вопросы вирусологии. - 1999. - Т. 44. - № 3. - С. 136139.
BY 16698 C1 2012.12.30
(57)
Способ криоконсервирования бактериофагов молочнокислых бактерий, отличающийся тем, что готовят фаголизат, содержащий бактериофаги с титром 109-1010 БОЕ/мл,
добавляют в него сахарозу до концентрации 10 %, замораживают до –20 °С, снижая температуру со скоростью 4 °С/мин, и помещают на хранение в жидкий азот.
Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и пищевой промышленности, в частности к методам долгосрочного хранения промышленно-ценных
культур микроорганизмов, и может найти применение в области производства продуктов
питания.
В настоящее время бактериофаги молочнокислых бактерий активно применяются на
производствах кисломолочных продуктов для селекции штаммов бактерий, устойчивых к
вирусной инфекции. Необходимость селекции молочнокислых бактерий связана с тем, что
бактериальные закваски, применяемые на предприятиях молочной промышленности, являются благоприятной средой для развития популяций бактериофагов, что часто приводит
к лизису бактериальных культур и снижению активности заквасок и выражается в серьезном экономическом ущербе. Для проведения эффективной селекционной работы на предприятиях создаются производственные коллекции бактериофагов. При создании
подобных депозитариев неизменно ставится вопрос о длительном хранении вирусов бактерий с поддержанием их жизнеспособности и сохранением физиологических свойств.
BY 16698 C1 2012.12.30
Известен метод длительного хранения бактериофагов молочнокислых бактерий, заключающийся в насыщении стерильных кругов фильтровальной бумаги фаголизатом с
последующим высушиванием [1]. Однако данный метод не обеспечивает удовлетворительного уровня выживаемости бактериофагов, а также их генетической стабильности.
Для бактериофага Т4 описан метод лиофилизации, обеспечивающий длительное сохранение жизнеспособности вируса [2]. Основным недостатком данного метода является
высокий риск возникновения генетических нарушений на этапе высушивания под вакуумом [3, 4].
Наиболее близким по достигаемому результату является способ низкотемпературного
замораживания лизата бактериофагов с последующим хранением в морозильной камере
[5]. Фаголизат раскапывают по стерильным ампулам емкостью 1 мл, после чего замораживают при температуре –70 °С. Данный температурный режим обеспечивает высокую
скорость охлаждения. Замороженные образцы хранятся в морозильной камере при температуре –18 °С. Однако данный способ имеет существенные недостатки:
температурный режим замораживания и хранения бактериофагов обеспечивает выживаемость фагов не более 25 %;
отсутствуют данные о сохранении литической активности бактериофагов в отношении
хозяев.
Задача данного изобретения заключается в разработке нового метода хранения бактериофагов молочнокислых бактерий, обеспечивающего длительное сохранение их жизнеспособности, генетической стабильности и вирулентной активности в отношении клетокхозяев.
Поставленная задача решается за счет использования медленного замораживания концентрированной суспензии бактериофагов (4 °С/мин) с высоким титром вирусных частиц
(109-1010 БОЕ/мл), а также с использованием 10 % сахарозы в качестве криопротектора.
Данный метод является современной альтернативой классическим методам криобиологии,
использующим высокие скорости замораживания в жидком азоте для консервирования
микроорганизмов. Одновременное применение концентрированной суспензии бактериофагов для замораживания и 10 % сахарозы в качестве криопротектора является новым
решением и впервые применено для длительного консервирования бактериофагов молочнокислых бактерий.
Из фаголизата готовят концентрированную суспензию вирусов максимально достижимым титром жизнеспособных вирусов. Обычно титр фагов в подобных случаях достигает 109-1010 БОЕ/мл. Далее разливают ее в стерильные криопробирки и добавляют
стерильный раствор сахарозы так, чтобы конечная ее концентрация в суспензии была
10 %. Образцы охлаждают на ледяной бане до 0 °С, после чего помещают в морозильную
камеру при –20 °С. Данная температура обеспечивает медленное замораживание со скоростью 4 °С/мин. Дальнейшее хранение также осуществляют при температуре –20 °С. Отогрев образцов проводят на водяной бане при 37 °С. Культура бактериофагов готова к
использованию сразу же после отогрева.
Заявленное изобретение иллюстрируется следующими фигурами:
фиг. 1 - влияние различных режимов криоконсервации на сохранение лизирующей
способности бактериофагов Lactococcus lactis;
фиг. 2 - влияние 10 % сахарозы на сохранение лизирующей способности бактериофагов Lactococcus lactis;
фиг. 3 - морфология вирионов бактериофагов молочнокислых бактерий до и после
криоконсервации; а) бактериофаг, не подвергавшийся замораживанию; б) бактериофаг после 4 месяцев хранения в замороженном состоянии.
Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами.
Пример 1. Влияние скоростей охлаждения и отогрева на выживаемость бактериофагов Lactococcus lactis.
2
BY 16698 C1 2012.12.30
Образцы суспензии бактериофагов в стерильных криопробирках охлаждаются в холодильнике до 0 °С, после чего помещаются в морозильную камеру (–20 °С) и жидкий азот
(–196 °С). Данные условия замораживания обеспечивают соответственно скорости охлаждения 4 и 100-400 °С/мин. Через 24 часа образцы оттаивают на водяной бане при 37 °С и
в морозильной камере при 4 °С, что соответствует быстрому и медленному отогреву. Титр
фага определяют стандартным методом агаровых слоев [6]. В качестве контроля служит
суспензия бактериофагов, не подвергавшаяся криоконсервации.
Таблица 1
Выживаемость бактериофагов после замораживания и отогрева
с различными скоростями охлаждения
Режим замора- Режим отогреСуспензия фага (БОЕ/мл)
живания
ва
Контроль
(2,62 ± 0,19) × 1010
Титр фага (БОЕ/мл)
Выживаемость (%)
9
+37 °С
9,66
(2,53 ± 0,22) × 10
400 °С/мин
9
+4 °С
18,40
(4,82 ± 0,18) × 10
+37 °С
82,61
(2,09 ± 0,21) × 1010
4 °С/мин
9
+4 °С
20,27
(5,31 ± 0,17) × 10
Из приведенных данных видно, что сочетание медленного замораживания со скоростью 4 °С/мин и быстрого отогрева при 37 °С является оптимальным режимом криоконсервации фагов молочнокислых бактерий и обеспечивает наилучшую их сохранность
(табл. 1).
Пример 2. Влияние скоростей охлаждения и отогрева на сохранение лизирующей
способности бактриофагов Lactococcus lactis.
Образцы суспензии бактериофагов в стерильных криопробирках охлаждаются в холодильнике до 0 °С, после чего помещаются в морозильную камеру (–20 °С) и жидкий азот
(–196 °С). Данные условия замораживания обеспечивают соответственно скорости охлаждения 4 и 100-400 °С/мин. Через 24 часа образцы оттаивают на водяной бане при 37 °С и
в морозильной камере при 4 °С, что соответствует быстрому и медленному отогреву. Сразу же после оттаивания суспензию фагов переносят в подрощенную культуру молочнокислых бактерий и инкубируют при 30 °С. Каждые 30 мин отбирают равные аликвоты
культуральной жидкости и измеряют оптическую плотность, по изменению которой судят
о скорости лизиса фагами клеток бактерий.
При замораживании суспензии фагов с медленной скоростью охлаждения (4 °С/мин)
скорость лизиса не отличается от контрольных значений вне зависимости от режима отогрева. В остальных случаях скорость лизиса снижается (фиг. 1).
Пример 3. Влияние 10 % сахарозы на выживаемость бактериофагов Lactocoсcus lactis.
Наиболее часто используемыми криопротекторами при криоконсервации микроорганизмов, а также других биологических объектов являются ДМСО и глицерол в концентрациях 5-10 % [7]. Однако данные протекторы, помимо протекторного действия при
замораживании, оказывают выраженное токсическое действие, что делает невозможным
их применение при криоконсервации микроорганизмов, используемых в пищевой промышленности. Исходя из этого, в качестве защитного вещества была выбрана сахароза,
которая в концентрации 10 % оказывает выраженный защитный эффект при замораживании многих групп микроорганизмов.
В концентрированную суспензию фага, разлитую по стерильным криопробиркам, добавляют стерильный раствор сахарозы до конечной концентрации 10 %. Образцы замораживают и отогревают в соответствии с режимами, описанными в примере 1. Титр
3
BY 16698 C1 2012.12.30
жизнеспособных фагов определяют стандартным методом агаровых слоев. В качестве
контроля служит суспензия бактериофагов, не подвергавшаяся криоконсервации.
Таблица 2
Влияние 10 % сахарозы на выживаемость бактериофагов после замораживания
и отогрева с различными скоростями охлаждения
Режим замоРежим
Концентрированная суспензия фага (БОЕ/мл)
раживания
отогрева
Контроль
(2,62 ± 0,19) × 1010
Титр фага (БОЕ/мл)
Выживаемость (%)
9
+37 °С
17,40
(4,56 ± 0,33) × 10
400 °С/мин
10
+4 °С
45,04
(1,18 ± 0,32) × 10
+37 °С
94,66
(2,48 ± 0,14) × 1010
4 °С/мин
10
+4 °С
46,18
(1,21 ± 0,15) × 10
Из представленных данных видно, что добавление 10 % сахарозы к суспензии бактериофагов приводит к значительному повышению выживаемости при всех режимах криоконсервации. При замораживании и отогреве с оптимальными скоростями выживаемость
фагов составила 94,66 % (табл. 2).
Пример 4. Влияние 10 % сахарозы на сохранение лизирующей способности бактриофагов Lactococcus lactis.
В концентрированную суспензию фага, разлитую по стерильным криопробиркам, добавляют стерильный раствор сахарозы до конечной концентрации 10 %. Образцы замораживают и отогревают в соответствии с режимами, описанными в примере 1. Исследование
сохранения лизирующей способности фагов проводят, как описано в примере 2.
Результаты изучения сохранения лизирующей способности бактериофагов молочнокислых бактерий при криоконсервации с добавлением 10 % сахарозы при разных режимах
замораживания/отогрева свидетельствуют о том, что при добавлении раствора сахарозы в
суспензию фагов лизирующая способность сохраняется при криоконсервации на уровне
контроля вне зависимости от режима заморозки (фиг. 2).
Пример 5. Влияние концентрации вирусных частиц в среде криоконсервирования на
выживаемость фагов Lactococcus lactis.
Для замораживания используют свежий лизат фага, а также сконцентрированную суспензию с концентрацией вирусных частиц 106 и 1010 БОЕ/мл соответственно. Криоконсервирование фагов проводят с оптимальным режимом замораживания/отогрева - медленное
охлаждение в морозильной камере (4 °С/мин) и быстрый отогрев на водяной бане
(+37 °С). Помимо чистых лизата и суспензии бактериофагов, используют лизат и суспензию с добавлением стерильной сахарозы до конечной концентрации 10 %. Титр выживших бактериофагов исследуют стандартным методом агаровых слоев.
Таблица 3
Выживаемость бактериофагов молочнокислых бактерий в зависимости
от концентрации вирусных частиц в среде консервирования
Вариант опыта
Лизат фага
Концентрированая суспензия
6
Контроль
(3,90 ± 0,13) × 10
(2,62 ± 0,19) × 1010
Титр фага
Выживаемость
Титр фага
Выживаемость
(БОЕ/мл)
(%)
(БОЕ/мл)
(%)
Без добавления
6
61,54
82,61
(2,09 ± 0,21) × 1010
криопротектора (2,40 ± 0,29) × 10
10 % сахароза (3,48 ± 0,24) × 106
89,23
94,66
(2,48 ± 0,14) × 1010
4
BY 16698 C1 2012.12.30
Из полученных данных видно, что при замораживании суспензии с высоким титром
вирусных частиц достигается более высокий уровень выживаемости в сравнении с лизатом. Также стоит отметить, что данная тенденция сохраняется при внесении криопротектора в среду консервирования (табл. 3).
Пример 6. Длительное хранение бактериофагов в замороженном состоянии при разных температурах.
Замороженные образцы хранят в жидком азоте при температуре –196 °С, а также в
морозильной камере при температуре –20 °С. Часть замороженных образцов оттаивают
сразу же после заморозки и измеряют титр бактериофагов. Полученные показатели используются в дальнейшем в качестве контроля. Через 4 месяца хранения образцы оттаивают и исследуют титр жизнеспособных бактериофагов.
При использовании заявленного способа низкотемпературного консервирования в
жидком азоте обеспечивается выживаемость бактериофагов, близкая к 100 % (табл. 4).
Таблица 4
Выживаемость бактериофагов молочнокислых бактерий при длительном хранении
Концентрированная суспензия фага +10 % сахароза (БОЕ/мл)
Режим хранения
Титр фага (БОЕ/мл)
Выживаемость (%)
контроль после
(2,53 ± 0,22) × 109
–196 °С замораживания
опыт
95,25
(2,41 ± 0,29) × 109
контроль после
(2,48 ± 0,14) × 1010
–20 °С замораживания
опыт
60,08
(1,49 ± 0,13) × 1010
Пример 7. Исследование морфологии вирионов бактериофагов после криоконсервации.
Суспензию бактериофагов консервируют с использованием оптимальных параметров
криоконсервирования и хранят в течение 4 месяцев. После оттаивания суспензию наносят
на опорные сетки, покрытые коллодиевой пленки-подложки, и контрастируют уранилацетатом. Исследование морфологии проводят на трансмиссионном электронном микроскопе
JEM-100CX-II при увеличении 1 × 100000. В качестве контроля служила суспензия бактериофагов, не подвергавшаяся криоконсервированию.
В результате исследований не было выявлено каких-либо повреждений вирусных частиц бактериофагов, а также изменения морфологии. На микрофотографиях вирионов фага до и после криоконсервации вирусная частица состоит из продолговатой головки
длиной около 150 нм и шириной около 90 нм, а также отростка длиной около 250 нм
(фиг. 3).
Согласно полученным данным предлагаемый способ длительного консервирования бактериофагов молочнокислых бактерий превосходит ранее предложенный метод (прототип).
Преимущества предлагаемого метода заключаются в следующем:
1. Оптимизация температурных режимов криоконсервирования, использование криопротекторов, а также концентрированной суспензии бактериофагов позволяют добиться
более высокого уровня выживаемости бактериофагов в сравнении с ранее предложенным
способом. Так, при консервировании вирусов с помощью описанного метода наблюдается
потеря жизнеспособности фагов около 5 % непосредственно после замораживания, а также 5 % в течение 4 месяцев хранения. Суммарная потеря жизнеспособности не превышает
10 %.
2. Предложенный метод, помимо высокой выживаемости бактериофагов, также обеспечивает сохранение их вирулентности.
5
BY 16698 C1 2012.12.30
Источники информации:
1. Prouty, C.C. Storage of the bacteriophage of lactic acid streptococci in the desiccated state
with observations on longevity // Applied Microbiology. - 1953. -Vol. 1. - No. 5. - Р. 250-251.
2. Shapira A., Kohn A. The effects of freeze-drying on bacteriophage T4 // Cryobiology. 1974. - Vol. 11. - No. 5. - Р. 452-464.
3. Ohnishi T., Tanaka Y., Yoh M., Takeda Y., Miwatani T. Deoxyribonucleic acid strand
breaks during freeze-drying and their repair in Escherichia coli // J. Bacterial. - 1977. - Vol. 130. P. 1393-1396.
4. Tanaka Y., Yoh M., Takeda Y., Miwatani T. Induction of mutation in Escherichia coli by
freeze-drying // Appl. Environ. Microbiol. - 1979. - Vol. 37. - P. 369-372.
5. Keogh B.P., Pettingill G. Long-term storage of bacteriophages of lactic streptococci //
Applied microbiology. - 1966. - Vol. 14. - No. 3. - Р. 421-424 (прототип).
6. Адаме А. Бактериофаги. - M.: Иностранный язык, 1961. - 506 с.
7. Hubalek Z. Protectants used in the cryopreservation of microorganisms // Cryobiology. 2003. - Vol. 46. - Nо. 3. - P. 205-229.
Фиг. 1
Фиг. 2
Фиг. 3
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
6
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
315 Кб
Теги
by16698, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа