close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16782

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.02.28
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61K 39/116
A 61K 39/05
A 61K 39/08
A 61K 39/10
A 61K 39/29
A 61K 39/102
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
(2006.01)
МНОГОКОМПОНЕНТНАЯ АНТИГЕННАЯ КОМПОЗИЦИЯ
И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ
(21) Номер заявки: a 20030928
(22) 2003.10.08
(31) 0223355.9 (32) 2002.10.08 (33) GB
(43) 2008.12.30
(71) Заявитель:
НОВАРТИС
ВЭКСИНЕС ЭНД ДАЙЭГНОСТИКС
ЛИМИТЕД (GB)
(72) Автор: КОНТОРНИ, Марио (US)
BY 16782 C1 2013.02.28
BY (11) 16782
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатель: НОВАРТИС ВЭКСИНЕС ЭНД ДАЙЭГНОСТИКС ЛИМИТЕД (GB)
(56) BY 3549 C1, 2000.
RU 2130778 C1, 1999.
WO 98/19702 A1.
WO 97/46255 A2.
(57)
1. Способ получения антигенной композиции в форме суспензии, заключающийся в
том, что:
(a) вносят поверхностный антиген гепатита B HBsAg в раствор фосфата алюминия в
кислой среде до концентрации 5-50 мкг/мл и смешивают в течение, как минимум, 10 мин;
(b) добавляют токсоид дифтерии до концентрации 5-50 Lf/мл;
(c) смешивают в течение, как минимум, 10 мин;
(d) добавляют токсоид столбняка до концентрации 1-20 Lf/мл и антиген коклюша до
концентрации 5-50 OU/мл;
(e) смешивают в течение, как минимум, 10 мин;
(f) при необходимости осуществляют коррекцию рН до значения 6,0-7,0 и
(g) добавляют конъюгат антигена Hib до концентрации 1-50 мкг/мл.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют коррекцию
рН до значения 6,0-7,0 после добавления каждого антигена.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что смешивание осуществляют в среде с
pH 6,0-7,0.
4. Способ по любому из пп. 1-3, отличающийся тем, что смешивание осуществляют
при температуре 15-30 °С.
5. Антигенная композиция, полученная способом по любому из пп. 1-4.
6. Антигенная композиция на водной основе, содержащая фосфат алюминия, HBsAg в
концентрации 5-50 мкг/мл, токсоид дифтерии в концентрации 5-50 Lf/мл, токсоид столбняка в концентрации 1-20 Lf/мл, антиген коклюша в концентрации 5-50 OU/мл и конъюгат
антигена Hib в концентрации 1-50 мкг/мл, причем HBsAg адсорбирован фосфатом алюминия, а конъюгат антигена Hib не адсорбирован фосфатом алюминия.
7. Способ вызывания иммунного ответа пациента, заключающийся во введении пациенту композиции по п. 5 или 6.
BY 16782 C1 2013.02.28
8. Применение композиции по п. 5 или 6 в качестве вакцины.
9. Применение композиции по п. 5 или 6 для получения препарата для профилактики
инфекционного заболевания, вызванного вирусом гепатита B, C. diphtheriae, C. tetani,
B. pertussis и/или H. influenzae тип b.
Изобретение относится к способу получения и составу многокомпонентной суспензии
антигенов, обладающих высокой стабильностью.
Комбинирование взвеси антигенов в одном сосуде является привлекательным методом [1, 2, 3], но может оказаться затруднительным в результате взаимодействия между
различными сочетаемыми компонентами, особенно в жидких рецептурах [4]. При этом
возникают такие проблемы, как взаимовлияние антигенов, конкуренция между ними, деградация антигенов, подавление активности эпитопов и несовместимость с адъювантами
(вспомогательными несущими компонентами состава). При этом также усложняется контроль качества смесей.
Однако комбинирование антигенов не всегда связано с отрицательными эффектами.
Например, сочетание антигенов против дифтерии, столбняка и коклюша (ДСК, или DTP)
(с использованием как цельноклеточных (Pw), так и бесклеточных (Pa) антигенов коклюша) используется в иммуногенных составах в течение многих лет, а дополнительное
включение в состав ДСК капсульного полисахаридного конъюгата H. influenzae, тип B
(Hib) фактически может привести к повышению реакции антител на компонент Hib [5].
Сочетание антигенов против кори, свинки и краснухи (КСК или MMR) также находит
широкое применение.
Однако сообщается о проблемах с экспериментальным подтверждением эффективности некоторых иммуногенных фармацевтических средств, включая ДСК, Hib, инактивированный вирус полиомиелита (ИВП, или IPV) и вирус гепатита B (ВГВ, или HBV) [6].
Сообщалось также о проблемах с выбором адъювантов для комбинаций антигенов вирусов гепатита A и В [7] и для комбинаций с участием Hib [8, 9]. Например, в качестве адъюванта для антигенов ДСК обычно используется гидрооксид алюминия, но это
соединение может обуславливать гидролиз капсульного полисахаридного антигена Hib в
жидких рецептурах [9, 10].
Известны жидкие пятикомпонентные иммуногенные составы Hib + DTPw + HBV, в
которых иммунный ответ на компонент HBV уменьшался после комбинирования с другими компонентами [11, 12], предположительно, в результате синергетического ингибирования иммунного ответа на антиген HBV, обуславливаемого компонентами Hib и DTP. В
отличие от этого сообщается об отсутствии отрицательного влияния на иммуногенность
компонентов жидкого шестикомпонентного состава с сочетанием Hib + DTPa + полио +
+ HBV [13]. Этот шестикомпонентный продукт в Европе одобрен к использованию для
человека и выпускается под названием HEXAVACTM.
Цель данного изобретения заключается в совершенствовании (например, путем повышении стабильности) жидких комбинированных вакцин и способов их производства. В
частности, цель изобретения заключается в совершенствовании комбинированных продуктов, включающих антигены вируса гепатита B (HBV).
Изобретение предусматривает процесс приготовления антигенного состава, включающий следующие этапы: (a) смешивание поверхностного антигена гепатита B (HBsAg) с
раствором фосфата алюминия в кислой среде; (b) добавление в раствор (в любой последовательности) антигена дифтерии, антигена столбняка и антигена коклюша и (c) добавление в раствор конъюгата антигена Hib.
Установлено, что иммуногенность антигена HBsAg является оптимальной при адсорбции алюмофосфатным адъювантом, однако конъюгаты Hib подвергаются гидролизу
при адсорбции гидрооксидом или фосфатом алюминия. Преимуществом процесса, пред2
BY 16782 C1 2013.02.28
лагаемого по изобретению, является создание жидкой рецептуры, в которой антиген
HBsAg адсорбируется алюмофосфатным адъювантом, тогда как конъюгат Hib не подвергается адсорбции таким алюмосодержащим адъювантом. Этот процесс обеспечивает высокую степень адсорбции HBsAg и общую стабильность.
Изобретение также предусматривает водный состав, содержащий фосфат алюминия,
поверхностный антиген гепатита B (HBsAg), антиген дифтерии, антиген столбняка, антиген коклюша и конъюгат антигена Hib, в котором антиген HBsAg адсорбируется фосфатом алюминия, а конъюгат антигена Hib не адсорбируется фосфатом алюминия.
Последовательность смешивания антигенов.
Этапы (a)-(c) процесса по изобретению предпочтительно должны выполняться в определенном порядке, т.е. антиген HBsAg должен вводиться в раствор фосфата алюминия до
введения антигенов DTP, а конъюгат Hib должен вводиться после антигенов DTP.
Применительно к этапу (b) предпочтительно, но не обязательно вводить антиген дифтерии до антигенов столбняка и коклюша. Это способствует адсорбции антигена дифтерии алюмосодержащим адъювантом.
В рамках этапа (b) антигены столбняка и коклюша могут вводиться в любом порядке.
В промежутках между операциями введения каждого антигена предпочтительно следует осуществлять перемешивание раствора (например, посредством помешивания) в течение, как минимум, 10 мин (например, в течение 30 мин).
pH и температура.
Во время этапа (a) процесса по изобретению фосфат алюминия и антиген HBsAg смешиваются в водной среде. В результате этого этапа происходит адсорбция антигена
HBsAg алюмофосфатным адъювантом. Если во время перемешивания значение pH будет
слишком низким, то произойдет денатурирование антигена HBsAg. Если pH будет чрезмерно высоким, то адсорбция HBsAg фосфатом алюминия не произойдет.
Процесс может включать операцию корректировки pH после введения каждого антигена. После введения антигена HBsAg на этапе (a) при необходимости может быть произведена корректировка pH примерно до его исходного значения. После добавления
индивидуальных антигенов группы DTP в рамках этапа (b) также может быть произведена
корректировка pH. После завершения этапа (b) и до введения конъюгата антигена Hib в
рамках этапа (c) предпочтительно произвести корректировку pH с целью его доведения
примерно до нейтрального значения.
После введения конъюгата антигена в рамках этапа (c) предпочтительно следует произвести корректировку pH с целью обеспечения приемлемости раствора для введения пациентам. Для предотвращения возвращения токсоида дифтерии в токсичное состояние
предпочтительно следует обеспечить pH на уровне менее 7,0. Поэтому предпочтительными являются значения pH в диапазоне 6,2-6,9.
Процесс по изобретению предпочтительно следует вести при температуре от 15 до
30 °С (например, в диапазоне от 19 до 27 °С, т.е. 23 ± 4 °С).
Фосфат алюминия.
Процесс по изобретению основан на смешивании антигенов с фосфатом алюминия в
водной среде. Такая смесь фосфата алюминия с водой обычно именуется раствором, хотя,
строго говоря, с точки зрения физико-химических характеристик эта соль является нерастворимой и образует суспензию.
Фосфат алюминия предпочтительно следует использовать в виде водного раствора, в
который вводятся антиген HBsAg и затем другие антигены. Перед вводом aнтигенных
компонентов предпочтительно следует разбавить фосфат алюминия до требуемой концентрации и обеспечить гомогенность раствора.
Концентрация ионов Al3+ до введения антигена HBsAg обычно составляет от 0 до 10 мг/л.
Раствор фосфата алюминия может также содержать буферное соединение, но это необязательно.
3
BY 16782 C1 2013.02.28
Раствор фосфата алюминия предпочтительно должен быть стерильным. Стерилизация
фосфата алюминия посредством фильтрации невозможна, поэтому для его стерилизации
предпочтительно следует применять обработку в автоклаве.
Фосфат алюминия предпочтительно не должен содержать пирогенных компонентов. В
растворе фосфата алюминия также может содержаться хлорид натрия.
Поверхностный антиген гепатита B.
Приготовление антигена HBsAg детально описано в имеющейся документации. Описаны различные формы этого антигена (например, полностью или частично включающие
последовательность pre-S, антиген L*, описанный в [14]; полипептид preSl-preS2-S, описанный в [15] или его аналоги, такие как описанные в [16]; "escape-мутанты", описанные в
[17 и 18], такие как HBsAg с мутацией Gly145→Arg). Любые из этих форм могут использоваться в рамках данного изобретения.
Антиген HBsAg может вырабатываться в процессе очистки плазмы или выделяться в
эвкариотических системах выделения, таких как дрожжевые клетки или клетки яичника
китайского хомяка (CHO) [19]. Выделение в дрожжевых клетках является предпочтительным.
Антиген HBsAg преимущественно применяется в виде частиц. Эти частицы предпочтительно должны сохранять форму, в которых они были выделены из дрожжей.
Антиген HBsAg может быть инактивирован, например, посредством обработки формалином.
Антиген дифтерии.
В качестве антигена дифтерии предпочтительно следует применять токсоид дифтерии.
Приготовление дифтерийного токсоида подробно описано в имеющейся документации
[глава 3 в 20; глава 9 в 21]. Можно использовать любой подходящий токсоид дифтерии.
Антиген столбняка.
В качестве антигена столбняка предпочтительно следует применять столбнячный токсоид. Приготовление столбнячного токсоида подробно описано в имеющейся документации [глава 4 в 20; глава 18 в 21]. Можно использовать любой подходящий токсоид
столбняка.
Антиген коклюша.
Антиген коклюша, используемый в соответствии с изобретением, может иметь клеточную (например, цельноклеточную) или бесклеточную форму. Приготовление антигенов обоих типов подробно описано в имеющейся документации [глава 14 в 21; 22].
В случае использования бесклеточных антигенов предпочтительно следует использовать холотоксин коклюша (РТ) и филаментозный гемагглютинин (FHA), еще более предпочтительно в сочетании с пертактином (также известным под названием PRN, или
антиген 69 кДа) и, при желании, с агглютиногенами 2 и 3 (также известными под названием fimbriae) [23]. Типичный состав смеси антигенов коклюша в одной дозе вакцины:
10 мкг PT, 5 мкг FHA, 3 мкг PRN, 5 мкг сочетания агглютиногенов.
Токсин PT является токсичным белком и поэтому при вводе в состав антигена коклюша его предпочтительно следует обезвреживать. Детоксификация может осуществляться с
применением химических или генетических методов. Предпочтительным детоксифицированным мутантом является двойной мутант 9K/129G [24], именуемый ниже rPT.
Конъюгат антигена Hib.
Приготовление полисахаридных конъюгатов и, в частности, капсульных полисахаридов гемофильной палочки Haemophilus influenzae типа В (Hib) подробно описывается в
имеющейся документации [25-33 и т.п.]. В данном изобретении можно использовать любой подходящий конъюгат Hib.
В качестве сахаридной части конъюгата можно применять полисахарид (например,
полномерную цепочку PRP), но по предпочтительному варианту следует осуществлять
гидролиз полисахаридов (например, кислотный гидролиз) с целью образования олигоса4
BY 16782 C1 2013.02.28
харидов (например, с молекулярной массой от ~1 до ~5 кДа). В случае применения гидролиза получаемый продукт может сортироваться по размерам, чтобы удалить слишком короткие олигосахариды, которые не обладают эффективным иммуногенным действием.
Предпочтительными сахаридными антигенами являются олигосахариды, отсортированные по размеру.
В качестве несущей части конъюгата, как правило, применяется белок. Предпочтительными несущими белками являются бактериальные токсины или токсоиды, такие как
токсоиды дифтерии или столбняка. Эти вещества часто используются в конъюгатных вакцинах. Особо предпочтительным является токсоид дифтерии CRM197 [34, 35, 36]. К другим приемлемым несущим белкам относятся белок внешней оболочки бактерии
N. meningitidis [37], синтетические пептиды [38, 39], белки, подвергнутые тепловому удару [40, 41], белки бактерии коклюша [42, 43], белок D гемофильной палочки H. influenzae
[44], цитокины [45], лимфокины [45], гормоны [45], факторы роста [45], токсины А или В
бактерии C. difficile [46] и т.п. Также можно использовать смеси различных несущих белков.
Для конъюгации сахаридов Hib могут использоваться любые приемлемые активирующие или связующие химические методы. Как правило, сахарид активируется или приводится в функциональное состояние перед выполнением конъюгации. Для активации могут
применяться, например, цианирующие реагенты, такие как CDAP (например, 1-циано-4диметиламино-пиридин-тетрафтороборат [47, 48]). В других приемлемых методиках используются карбодиимиды, гидразиды, активные эфиры, норборан, p-нитробензольная
кислота, N-оксисукцинимид, S-NHS (сульфо-N-оксисукцинимид), EDC (1-этил-3-(3диметиламинопропил)карбодиимид гидрохлорид), TSTU (1,1,3,3-тетраметилуроний-тетрафтороборат) [введение к 49].
Связи с помощью линкерных групп могут выполняться с использованием любых известных методов, например с использованием методик, описанных в [50 и 51]. Один из
типов связей основан на восстановительном аминировании полисахарида, связывании получаемой аминогруппы с одним концом адипиновой кислотной линкерной группы и последующим прикреплением белка к другому концу адипиновой кислотной линкерной
группы [52, 53, 54]. К числу других линкеров относятся B-пропионамидол [55], нитрофенил-этиламин [56], галиды ацил-галогенов [57], гликозидные звенья [58], 6-аминокапроновая кислота [59], ADH [60], углеводородные составляющие от C4 до C12 [61] и т.п.
В качестве альтернативы использованию линкеров можно использовать прямые связи.
Для образования прямой связи с белком может потребоваться окисление полисахарида с
последующим восстановительным аминированием вместе с белком, как описано, например, в [62 и 63].
Предпочтительный конъюгат содержит сахарид Hib, ковалентно связанный с токсоидом CRM197 с помощью диэфира янтарной и адипиновой кислоты [64, 65].
Характеристики составов по изобретению.
В результате применения процесса по изобретению получают состав, содержащий антигены, некоторые из которых адсорбируются алюмофосфатным адъювантом. Этот состав
предпочтительно должен обладать иммуногенными свойствами. Составы по изобретению
могут использоваться в профилактических целях (т.е. для предотвращения инфекции) и в
терапевтических целях (т.е. для лечения заболевания, вызванного инфекцией).
Состав предпочтительно имеет жидкую рецептуру (т.е. не является сухим составом,
получаемым посредством лиофилизации). Это обычно означает, что состав имеет водную
основу, например, является суспензией.
Состав по изобретению предпочтительно является стерильным. Поскольку фосфат
алюминия и цельноклеточные антигены коклюша не поддаются стерилизации посредством
фильтрования, предпочтительным способом является стерилизация состава по изобретению
в автоклаве и (или) использование стерильных компонентов при приготовлении состава.
5
BY 16782 C1 2013.02.28
Состав по изобретению предпочтительно не должен содержать пирогенных компонентов.
Состав по изобретению предпочтительно должен иметь pH в диапазоне от 6,0 до 7,0.
Состав предпочтительно должен снабжаться буферным раствором для поддержания
этого значения pH.
Концентрация ионов Al3+ в составе по изобретению в общем случае составляет от 0,1
до 2,0 мг/мл.
Состав может содержать хлорид натрия. Концентрация хлорида натрия в составе
предпочтительно должна быть в диапазоне от 0,1 до 100 мг/мл.
Концентрация антигена HBsAg в общем случае составляет от 5 до 50 мкг/мл. Предпочтительная концентрация составляет от 10 до 30 мкг/л.
Концентрация токсоида дифтерии в общем случае составляет от 5 до 50 флокулирующих единиц (Lf) на миллилитр. Предпочтительная концентрация составляет от 7,5 до
30 Lf/мл.
Концентрация токсоида столбняка в общем случае составляет от 1 до 20 Lf/мл. Предпочтительная концентрация составляет от 2 до 9 Lf/мл.
При использовании клеточных антигенов коклюша концентрация антигенов коклюша
в общем случае составляет от 5 до 50 оптических единиц (OU) на миллилитр. Предпочтительная концентрация составляет от 10 до 40 OU/мл.
Концентрация конъюгата антигена Hib в общем случае составляет от 1 до 50 мкг/мл.
Предпочтительная концентрация составляет от 10 до 30 мкг/мл.
Состав может содержать консервант, такой как мертиолат. Концентрация консерванта
предпочтительно должна быть низкой (например, 0,01 об. %). Консервант можно вводить
извне либо в качестве компонента антигенов, смешиваемых для образования состава
(например, консервант может присутствовать в антигенах коклюша или HBsAg). Однако
применения ртутных консервантов предпочтительно следует избегать.
Другие компоненты, приемлемые для введения в организм человека, описаны в [66].
Состав по изобретению предпочтительно не должен содержать гидрооксида алюминия
в измеряемой концентрации.
Антигены будут присутствовать в составах по изобретению в "иммунологически эффективном количестве", т.е. введение такого количества в организм как в виде одной дозы, так и в виде серии доз обеспечит эффективное лечение или предотвращение
заболевания. Это количество зависит от состояния здоровья и физического состояния индивидуума, его возраста, таксономической группы, к которой принадлежит индивидуум
(например, низшие приматы, приматы и т.п.), способности иммунной системы индивидуума к синтезу антител, желаемой степени защиты, рецептуры состава, оценки медицинской ситуации по мнению лечащего врача и других релевантных факторов.
Предполагается, что требуемое количество будет входить в достаточно широкий диапазон, который может быть определен посредством проведения обычных экспериментов.
Вакцинация может производиться посредством введения одной дозы или нескольких доз
по установленному графику (например, включая бустерные дозы). Состав может вводиться в сочетании с другими иммунорегулирующими средствами.
Как правило, составы по изобретению подготавливаются в виде препаратов для инъекций. Прямой ввод составов в общем случае будет производиться парэнтерально (например, посредством подкожной, внутрибрюшной, внутривенной или внутримышечной
инъекции или посредством введения во внутритканевое пространство). Составы также могут вводиться в пораженное место.
Составы по изобретению с установленной рецептурой могут вводиться непосредственно пациентам. Пациентами могут являться животные; в частности, можно проводить лечение людей. Вакцины являются особенно полезными для вакцинации детей и подростков.
6
BY 16782 C1 2013.02.28
Стандартные модели для экспериментов на животных и in vitro, а также корреляты
защиты, используемые для оценки действенности вакцин HBV, Hib и DTP, хорошо известны.
Адсорбция антигенов.
В составах по изобретению антиген HBsAg адсорбируется фосфатом алюминия.
Предпочтительно, чтобы адсорбция была как можно более полной, например, из общей
массы HBsAg, имеющейся в составе, должно быть адсорбировано не менее 80 % (или,
например, не менее 85, 90, 95, 98, 99 % и более).
Токсоид дифтерии, как правило, адсорбируется фосфатом алюминия. Предпочтительно, чтобы адсорбция была частичной, например, из общей массы дифтерийного токсоида,
имеющегося в составе, должно быть адсорбировано примерно 30-80 % (или, например,
примерно 40-70 %, примерно 50-60 % и т.п.). При хранении при температуре около 37 °С
степень адсорбции дифтерийного токсоида возрастает с течением времени.
Токсоид столбняка, как правило, адсорбируется фосфатом алюминия. Предпочтительно, чтобы адсорбция была частичной, например, из общей массы столбнячного токсоида,
имеющегося в составе, должно быть адсорбировано не более 40 % (или, например, не более 30 %, не более 20 %, не более 10 % и т.п.). Степень адсорбции столбнячного токсоида
может быть равна 0 %.
Конъюгат Hib не адсорбируется алюмосодержащим адъювантом.
Методы применения.
Изобретение предусматривает способ вызывания иммунного ответа пациента, заключающийся во введении в организм состава по изобретению.
Изобретение также предусматривает состав по изобретению, который может применяться в качестве медикамента (например, в качестве иммуногенного состава).
Изобретение также предусматривает использование состава по изобретению при производстве медикаментов для лечения и (или) предотвращения заболеваний.
Способы или области использования предпочтительно обеспечивают защиту от инфекции патогенами HBV, C. diphtheriae, C. tetani, B. pertussis и (или) H. influenzae b. Эти
патогены вызывают гепатит, дифтерию, столбняк, коклюш и (или) бактериальный менингит. Способы или области использования предпочтительно обеспечивают защиту от этих
болезней. К числу других болезней, вызываемых гемофильной палочкой H. influenzae, относятся воспаление среднего уха, бронхит, пневмония, целлюлит и перикардит.
Предпочтительными пациентами являются люди.
Предпочтительными пациентами являются дети.
Способ может обеспечить бустерную реакцию в организме пациента, который ранее
уже был иммунизирован.
Единичная доза состава предпочтительно составляет 0,5 мл.
Изобретение также предусматривает средство введения (например, шприц или
безыгольный инъектор), содержащее состав по изобретению. Средство введения предпочтительно содержит одну дозу вакцины.
Другие компоненты состава.
Состав по изобретению предпочтительно является пятикомпонентным: (1) HBsAg;
(2) Hib; (3) дифтерия; (4) столбняк; (5) коклюш. Однако изобретение не исключает возможность включения в состав дополнительных антигенов (например, создание шестикомпонентных, семикомпонентных, восьмикомпонентных, девятикомпонентных, десятикомпонентных составов, а также составов с более высоким числом компонентов). Например,
состав может включать один или несколько из нижеуказанных дополнительных антигенов:
белковый антиген из N. meningitidis, серогруппа В, например, описанный в [67-73];
везикулярный препарат внешней оболочки (OMV) бактерии N. meningitidis, например,
описанный в [74, 75, 76, 77] и т.п.;
7
BY 16782 C1 2013.02.28
сахаридный антиген из N.meningitidis, серогруппа А, С, W135 и (или) Y, такой как
олигосахарид, описанный в [78] из серогруппы С [79], или олигосахариды, описанные в
[80];
сахаридный антиген из Streptococcus pneumoniae [81, 82, 83];
антиген из вируса гепатита A, например инактивированный вирус [84, 85].
антиген(-ы) полиомиелита [86, 87], например, такие как оральная вакцина OPV или,
предпочтительно, инъекционная вакцина IPV.
Состав может включать один или несколько из этих дополнительных антигенов.
Определения.
Термин "содержащий" означает "включающий", а также "состоящий"; например, состав, "содержащий" X, может состоять исключительно из X или же может включать нечто
дополнительное, например X + Y.
Термин "примерно" применительно к численному значению x означает, например,
x ± 10 %.
На фиг. 1 показаны результаты анализа стабильности антигена HBsAg, входящего в
состав по изобретению, полученные по методике "вестерн-блот". На фиг. 2 показаны результаты определения иммунодиффузии дифтерийного токсоида, входящего в состав по
изобретению. На фиг. 3 показаны результаты определения иммунодиффузии столбнячного токсоида, входящего в состав по изобретению. На фиг. 4 показан график изменения во
времени значений pH составов по изобретению.
Водная рецептура.
Основной способ приготовления рецептуры заключался в выполнении следующих
операций: (1) ввести выделенный из дрожжей антиген HBsAg в раствор фосфата алюминия; (2) поочередно ввести антигены дифтерии, столбняка и коклюша; (3) откорректировать pH и (4) добавить конъюгат антигена Hib-CRM197. Дополнительные подробности
описываются ниже:
начать с приготовления алюмофосфатного адъюванта;
добавить раствор антигена HBsAg (pH 7,0 в фосфатно-солевом буферном растворе
PBS) до конечной концентрации 20 мкг/мл;
откорректировать pH;
мешать в течение 30 ± 5 мин (для обеспечения адсорбции HBsAg адъювантом);
добавить дифтерийный токсоид до конечной концентрации 15 флокулирующих единиц (Lf) на миллилитр;
мешать в течение 30 мин;
добавить столбнячный токсоид до конечной концентрации 6,5 Lf/мл;
мешать в течение 30 мин;
добавить клеточные антигены коклюша до конечной концентрации 30 оптических
единиц (OU) на миллилитр;
мешать в течение 30 мин;
при необходимости откорректировать pH;
добавить конъюгат CRM197-Hib до конечной концентрации 20 мкг/мл;
мешать в течение 15 мин.
Таким образом, окончательный состав антигенов в данной рецептуре имел следующий
вид:
Компонент
Концентрация
Дифтерийный токсоид
15 Lf/мл
Столбнячный токсоид
6,5 Lf/мл
Цельноклеточный антиген коклюша
30 OU/мл
Антиген гепатита HBsAg
20 мкг/мл
Конъюгат антигена гемофильной палочки
20 мкг/мл (как сахарид)
CRM197-Hib
8
BY 16782 C1 2013.02.28
Три отдельные партии этой рецептуры были подготовлены для экспериментов.
Тестирование стабильности.
В целях тестирования проводилось центрифугирование 10 мл этого состава с частотой
вращения 3500 об/мин в течение 20 мин, после чего надосадочная жидкость фильтровалась через фильтр Millex-GV с порами 0,22 мкм с целью отбора неадсорбированных антигенов.
Отфильтрованная надосадочная жидкость в нулевой момент времени анализировалась
на присутствие антигена HBsAg (с использованием метода "вестерн-блот"), токсоидов
дифтерии и столбняка (с помощью метода радиальной иммунодиффузии) и конъюгата Hib
(с использованием прибора Dionex, основанного на высокоэффективной анионнообменной жидкостной хроматографии (HPAE) в сочетании с импульсным амперометрическим детектором (PAD)). Также определялась концентрация свободного фосфата.
Те же анализы выполнялись после хранения проб при температуре 2-8 °С или 36-38 °С
в течение 2 недель или 4 недель.
Анализ антигенов HBsAg методом "вестерн-блот".
Степень адсорбции антигена HBsAg к алюмосодержащему адъюванту является важным фактором для его иммуногенности. Для этого анализа применялась процедура иммунного блоттинга, в сущности включавшая следующие операции: 1 мл надосадочной
жидкости вакцины подвергался осаждению с помощью DOC-TCA (дезоксихолат и трихлоруксусная кислота), денатурированию с помощью LSB (буфер с низким содержанием
соли) и затем помещался на 12-процентную полиакриламидную матрицу для выполнения
электрофореза SDS-PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия); 1 мкг из каждой партии HBsAg загружался в качестве контрольной
пробы (это представляет собой 5 % дозы HBsAg); препарат козьих антител анти-HBsAg
использовался в качестве первичного антитела (с разбавлением 1:1000), а конъюгат пероксидазы (POD) козьего антитела (с разбавлением 1:2500) использовался в качестве вторичного антитела.
Результаты показаны на фиг. 1. Дорожки 6-8 на рис. 1A демонстрируют отсутствие
поддающейся обнаружении концентрации растворимого антигена HBsAg в пятикомпонентном составе в нулевой момент времени, а дорожки 5-10 на фиг. 1B и 1C демонстрируют, что эта ситуация сохраняется после двух и четырех недель хранения при
температуре 2-8 °С или 36-38 °С. В трех различных партиях ~99 % антигена HBsAg остаются адсорбированными на адъюванте в этих разнообразных условиях.
Дополнительный анализ стабильности был проведен после хранения при температуре
2-8 °С в течение шести месяцев. Для каждой из этих трех партий степень адсорбции сохранилась на уровне ~99 %.
Для позитивного контроля, показанного на фиг. 1, использовался 1 мкг HBsAg.
Наблюдалась одиночная полоса, соответствующая S-пептиду (24 кДа) и характеристичная
полоса агрегатов (∼45 кДа). Полосы Pre-S2 не наблюдались.
Анализ на токсоиды дифтерии и столбняка по методике радиальной иммунодиффузии
(SRID).
Анализ SRID использовался для оценки единообразия характеристик различных партий токсоидов дифтерии и столбняка. Для подготовки эталонных кривых были выбраны
одна партия дифтерийного токсоида и одна партия столбнячного токсоида. Для анализа на
дифтерийный токсоид в пробу надосадочной жидкости вводилась стандартная добавка с
концентрацией 10 флокулирующих единиц (Lf) на миллилитр, а для анализа на столбнячный токсоид использовалась стандартная добавка с концентрацией 5 Lf/мл.
Градуировочная кривая для дифтерийного токсоида состояла из точек, соответствующих концентрациям дифтерийного токсоида 5, 10, 20, 30 Lf/мл. Градуировочная кривая
для столбнячного токсоида состояла из точек, соответствующих концентрациям столбнячного токсоида 5, 10, 15, 20 Lf/мл. В колонки SRID загружали либо эталонный раствор,
9
BY 16782 C1 2013.02.28
либо пробу объемом 15 мкл. Конфигурация колонок показана в следующих таблицах, где
численные величины означают концентрацию в Lf/ml, a S относится к надосадочному
объему состава.
30
5
S
30
Дифтерия
20
10
10
20
S
S
20
10
20
5
S
20
5
30
S
5
Столбняк
15
10
10
15
S
S
15
10
5
20
S
5
На фиг. 2 показаны результаты анализа SRID для одной партии дифтерийного токсоида в исходный момент времени (2A) и после хранения в течение 4 недель при температуре
2-8 °С (2B) или 36-38 °С (2C). На фиг. 3 показаны результаты анализа SRID для одной
партии столбнячного токсоида в исходный момент времени (3A) и после хранения в течение 4 недель при температуре 2-8 °С (3B) или 36-38 °С (3C).
Результаты были подвергнуты компьютерному анализу с целью определения концентраций антигенов (с корректировкой на антиген в стандартной добавке) и, соответственно,
для определения приблизительного (в пределах 10 %) значения процента адсорбции дифтерийного и столбнячного компонентов вакцины. Были получены следующие результаты.
Партия
Время 0
1
2
3
40-50
60-70
50-60
1
2
3
0-10
0-10
0-10
2-8 °С
2 недели
4 недели
Дифтерийный токсоид
50-60
50-60
50-60
50-60
40-50
40-50
Столбнячный токсоид
0-10
0-10
0-10
10-20
0-10
0-10
36-38 °С
2 недели
4 недели
90-100
80-90
70-80
90-100
90-100
90-100
20-30
10-20
10-20
10-20
0-10
10-20
Анализ на содержание свободных и общих сахаридов (DIONEX).
Критическим параметром стабильности и эффективности антигенов является процент
гидролиза конъюгата Hib. Клинический предел составляет 25 % свободных сахаридов (в
[10] сообщается, что 20 % не оказывают влияния на клиническую иммуногенность). Этот
параметр измеряется с помощью прибора DIONEX, обеспечивающего возможность прямого количественного определения содержания несвязанных углеводов на пикомолекулярном уровне при минимальных потребностях в сепарации и очистке. Основной целью
анализа является определение содержания свободных сахаридов.
Анализ сахаридов проводится для определения:
(a) общего содержания сахаридов (в мкг/мл);
(b) содержания сахаридов в надосадочной жидкости, т.е. неадсорбированных сахаридов (в мкг/мл);
(c) содержания свободных сахаридов (в результате гидролиза конъюгата CRM197-Hib)
(в мкг/мл).
Значение (c) выражалось в виде процента от (b) [величина d] или в виде процента от
теоретической общей концентрации сахаридов (20 мкг/мл) [величина е]. Получены следующие результаты.
10
BY 16782 C1 2013.02.28
Партия
1
2
3
Время выдержки
0
2 недели, 2-8 °С
2 недели, 36-38 °С
4 недели, 2-8 °С
4 недели, 36-38 °С
0
2 недели, 2-8 °С
2 недели, 36-38 °С
4 недели, 2-8 °С
4 недели, 36-38 °С
0
2 недели, 2-8 °С
2 недели, 36-38 °С
4 недели, 2-8 °С
4 недели, 36-38 °С
(a)
23,47
18,39
19,84
22,51
21,30
23,23
21,06
21,54
23,72
23,72
24,20
20,09
18,15
22,99
22,26
(b)
21,30
19,12
17,18
20,57
18,15
22,26
19,36
16,70
19,84
18,63
23,23
17,67
17,18
23,23
18,39
(c)
1,26
1,04
1,36
1,49
2,47
0,70
0,65
1,19
0,87
1,91
0,80
0,80
1,14
0,94
1,94
(d)
5,3 %
5,7 %
6,8 %
6,5 %
11,6 %
3,0 %
3,1 %
5,5 %
3,7 %
8,1 %
3,3 %
4,0 %
6,3 %
4,1 %
8,7 %
(e)
6,3 %
5,2 %
6,8 %
7,3 %
12,3 %
3,5 %
3,3 %
5,9 %
4,4 %
9,6 %
4,0 %
4,0 %
5,7 %
4,7 %
9,7 %
Для клинического использования допускается содержание свободных сахаридов не
свыше 25 %. Все значения были ниже этого предела и при хранении в течение 4 недель
при температуре 2-8 °С были ниже 6,5 %. В условиях повышенной температуры (4 недели
при температуре 36-38 °С) наблюдался более высокий уровень свободных сахаридов, однако даже максимальное значение 11,6 %, наблюдавшееся для партии 1, было намного
меньше лимита в 25 %.
В ходе предшествующей работы с многокомпонентными составами с использованием
антигенов Hib было показано, что степень гидролиза конъюгата CRM-Hib в течение одного месяца хранения при температуре 36-38 °С была выше, чем в течение двух лет хранения при температуре 2-8 °С. Поэтому можно ожидать, что при нормальных условиях
хранения степень гидролиза останется приемлемой, как минимум, в течение 2 лет.
Анализ на свободные сахариды, выполнявшийся с помощью прибора DIONEX, также
был проведен после хранения в течение 6 месяцев при температуре 2-8 °С. Получены следующие данные.
Партия
1
2
3
(c)
1,65
1,09
1,16
(d)
9,8 %
5,8 %
6,6 %
(e)
8,3 %
5,5 %
5,8 %
Таким образом, после хранения в течение 6 месяцев наблюдается лишь незначительное увеличение процентного содержания свободных сахаридов в сравнении с результатами, полученными после хранения в течение 4 недель, и полученные значения все еще
намного ниже 25-процентного предела. Следовательно, конъюгат CRM197-Hib демонстрирует весьма высокую стабильность во всех трех рецептурах.
pH и осмолярность.
На фиг. 4A показано изменение значений pH в течение 6 месяцев хранения трех партий при температуре 2-8 °С. На фиг. 4B показано изменение pH в течение 4 недель хранения трех партий при температуре 36-38 °С. При температуре 2-8 °С значения pH
оставались стабильными в течение 6 месяцев, тогда как в условиях повышенной температуры наблюдалось некоторое снижение pH на 0,1 после 2 недель и дальнейшее небольшое
снижение после 4 недель. Все значения pH оставались в диапазоне допустимых значений
от 6,0 до 7,0.
11
BY 16782 C1 2013.02.28
Осмолярность всех трех партий была в диапазоне от 312 до 315 мОсм/кг, что соответствует центральной части диапазона от 240 до 360 мОсм/кг допустимых значений осмолярности вакцин для инъекций.
Тестирование потенции и иммуногенности вакцины.
Оценка потенции и иммуногенности антигенов имеет важное значение для оценки
эффективности комбинированного продукта. Производилась оценка потенции антигенов
дифтерии, столбняка и коклюша, а также определение иммуногенности конъюгата CRMHib и антигена HBsAg. Для оценки содержания специфичных антител после иммунизации
проводился анализ ELISA (ферментно-связанный иммуносорбентный анализ). Иммуногенность антигена HBsAg определялась на модели мыши с использованием графика иммунизации, отличавшегося от графика, использовавшегося для определения потенции
антигена вируса гепатита B (HBV).
Были получены нижеуказанные значения потенции антигенов дифтерии, столбняка и
коклюша (DTP).
Партия
1
2
3
D
41
39
39
T
161
138
143
P
4
5
6
Результаты тестирования на потенцию каждого из этих антигенов намного превышают минимальные допустимые пределы, что демонстрирует высокую эффективность этих
трех антигенов.
Для оценки иммуногенности антигена HBsAg группам из 10 нормальных мышей
(CD1) вводился пятикомпонентный продукт посредством подкожной инъекции (0,5 мл, с
разбавлением солевым раствором до концентрации 1:4) в дни 0 и 14. В день 21 у мышей
была взята кровь, использованная для иммуноферментного анализа ELISA на антитела,
специфичные для антигена HBsAg, проводившегося по методике (a) "Enzygnost Anti-HBs II"
(тест Дейда-Беринга) или (b) "Ausab EIA" (тест Аббота). Эти иммуноферментные анализы
выполняются по разным методикам и имеют разную чувствительность к антигенам
HBsAg. Поэтому значения среднегеометрических титров (СГТ), полученные с помощью
этих двух тестов, нельзя сравнивать между собой. Однако в рамках каждого из этих тестов
значения среднегеометрических титров сыворотки были оптимальными. Получены следующие результаты.
Партия
1
2
3
Только адъювант
Тест "Enzygnost"
СГТ
% респондеров
1008
100
1518
1001
461
90
2
0
Тест "Ausab EIA"
СГТ
% респондеров
192
100
194
100
127
100
2
0
Все значения СГТ, полученные в ходе этого анализа иммуногенности на мышах, были
выше значений, сообщаемых в литературе. Процент респондеров (мышей, реагирующих
на оба антигена) постоянно был высоким и находился на оптимальном уровне ∼100 %.
Для оценки иммуногенности антигена Hib группам из 8 нормальных мышей (CD1)
вводился пятикомпонентный продукт посредством подкожной инъекции (0,5 мл, с разбавлением солевым раствором до концентрации 1:4) в дни 0, 10 и 20. В день 34 у мышей была
взята кровь, использованная для иммуноферментного анализа ELISA на антитела, специфичные для антигена Hib. Получены следующие результаты.
12
BY 16782 C1 2013.02.28
Партия
% респондеров
100
100
100
0
1
2
3
Только адъювант
Сравнительное исследование.
Вакцины.
Полностью жидкую вакцину DTPw-HepB-Hib (КвинваксемTM (QuinxaxemTM)), доза
0,5 мл которой содержит ≥ 30 ME дифтерийного токсина, ≥ 60 ME столбнячного токсина,
≥ 4 ME (LL 95 % CI ≥ 2 ME) инактивированного B. pertussis, 10 мкг поверхностного антигена вируса гепатита В (HbsAg) и 10 мг олигосахарида Hib, конъюгированного с CRM 197,
получали описанным ниже способом. В качестве вакцины сравнения с DTPw-HepB-Hib
использовали вакцину Quattvaxem®. Доза 0,5 мл вакцины Quattvaxem® содержит ≥ 30 ME
дифтерийного токсина, ≥ 60 ME столбнячного токсина, ≥ 4 ME (LL 95 % CI ≥ 2 ME) инактивированного B. pertussis, 10 мкг поверхностного антигена вируса гепатита В (HbsAg) и
10 мг олигосахарида Hib, конъюгированного с CRM 197. В качестве контрольной вакцины
против гепатита B использовали вакцину Hepavax-Gene®. Доза 0,5 мл вакцины HepavaxGene® содержит 10 мкг очищенного HBsAg. Антигены T, wP и Hib, содержащиеся в
опытных партиях вакцин QuinxaxemTM и Quattvaxem®, использованных в этом исследовании, получали в одних и тех же лабораториях одинаковыми способами получения. Антиген HBsAg, использованный в вакцине QuinxaxemTM, был идентичным антигену в вакцине
Hepavax-Gene.
Исследуемая популяция.
Младенцы, общим количеством 303 человека (132 девочки и 171 мальчика, средний
возраст которых составлял 2,2 месяца), находились под наблюдением в течение четырех
месяцев и были случайным образом распределены на группы, вакцинированные DTPwHepB-Hib (N=152) или DTPw-Hib + НерВ (N=151). Эти группы не имели никаких существенных демографических отличий. Вакцины вводили внутримышечно в переднелатеральный участок бедра в 2-, 3- и 4-месячном возрасте, при этом младенцы из группы с
раздельным введением получали вакцину DTPw-HepB в левое бедро, а вакцину гепатита B
- в правое бедро. Образцы крови брали у младенцев непосредственно перед первым введением и через месяц после третьей вакцинации.
Серология.
Данные, полученные от 299 младенцев (DTPw-HepB-Hib, N=151; DTPw-Hib + HepB,
N=148), включенные в популяцию "в соответствии с протоколом" (ATP), использовали
для первичного анализа иммуногенности (через месяц после третьей вакцинации). У четырех младенцев отсутствовали данные измерения титров после начала исследования, и
они были исключены из анализа иммуногенности. Антитела к HBsAg определяли, используя коммерчески доступный набор (Enzygnost® Anti-Hbs II, Dade Behring). В качестве
контроля использовали человеческую сыворотку, положительную по анти-Hbs антителам,
откалиброванную при помощи стандартного препарата ВОЗ.
Серопротекцию к вирусу гепатита B определяли, используя уровень порога отсечки
≥ 10 мМЕ/мл анти-Hbs антител. Противодифтерийные и противостолбнячные антитела
определяли, используя метод непрямой ELISA, при серопротекции, определенной в виде
уровня титра ≥ 0,1 МЕ/мл. Титры как противодифтерийных, так и противостолбнячных
антител ≥ 0,01 МЕ/мл обычно считаются положительными, однако в диапазоне титров 0,10,01 МЕ/мл корреляция ELISA с тестами нейтрализации in vivo была снижена, что свидетельствовало о необходимости использования более консервативного предела
≥ 0,1 МЕ/мл. Для обнаружения IgG антител к B. pertussis использовали ELISA, основанный на целых клетках. Также следовало установить зависимость защиты в отношении
13
BY 16782 C1 2013.02.28
B. pertussis, поэтому определяли сероконверсию в виде либо уровней титра ≥ 20 ELU(ед.
ELISA)/мл, либо в виде 4-кратного увеличения уровней титра после вакцинации. Метод
Hib ELISA, который является специфическим для обнаружения антител к капсулярным
полисахаридам H. influenzae типа b, был использован в качестве сравнительного ELISA.
Пул сывороток с высоким уровнем титра служил в качестве внутреннего стандарта и был
откалиброван относительно стандарта EDA. Уровни серопротекции против Hib определяли для обоих уровней титра: ≥ 0,15 мкг/мл и ≥ 1,0 мкг/мл.
Иммуногенность.
Было получено подтверждение, что вакцина DTPw-HepB-Hib является не менее эффективной по сравнению с раздельно вводимыми вакцинами DTPw-Hib + HepB в отношении каждого антигена через месяц после третьей вакцинации. После завершения
основного курса вакцинации уровни серопротекции против вируса гепатита B составляли
94,7 и 99,3 % для групп DTPw-HepB-Hib и DTPw-Hib + HepB соответственно. Все, кроме
одного индивидуума (DTPw-Hib + HepB группа), имели защиту от дифтерии, и у всех
младенцев были получены протективные титры антител против столбняка. Вакцина
DTPw-HepB-Hib вызвала серопротекцию к B. pertissus у 94,7 % младенцев, при этом у
95,4 % младенцев было достигнуто по меньшей мере 4-кратное увеличение тигров антител по сравнению базовой линией; сероконверсия в группе DTPw-Hib + HepB составляла
99,3 %, при этом у 98,0 % наблюдалось по меньшей мере 4-кратное увеличение титра.
Уровни серопротекции к Hib составляли 94,7 % (DTPw-HepB-Hib) и 96,6 % (DTPwHib + HepB) при титре анти-PRP ≥ 1,0 мкг/мл после трех доз.
Безопасность.
Процент младенцев, перенесших по меньшей мере одну реакцию на DTPw-HepB-Hib,
был аналогичным проценту младенцев в случае введения одиночной DTPw-Hib вакцины
(16,4 % против 17,2 % соответственно), при этом младенцев, перенесших локальные реакции при введении одиночной HepB вакцины, было меньше (11,9 %). Как правило, случаи
ожидаемых локальных реакций при введении комбинированной DTPw-HepB-Hib вакцины
были аналогичны случаям введения одиночной DTPw-Hib вакцины; все отличия были
статистически незначимыми. Зарегистрированные симптомы чаще всего проявлялись в
виде локальной реакции у 15,8 (DTPw-HepB-Hib) и 15,2 % (DTPw-Hib) младенцев. Все локальные реакции проявлялись в течение двух дней после вакцинации. Отсутствовало значимое отличие в проценте младенцев, перенесших по меньшей мере одно системное
побочное действие (18,4 % DTPw-HepB-Hib против 19,9 %DTPw-Hib + HepB). Наиболее
обычным системным побочным действием в обеих группах была повышенная температура (температура тела ≥ 38 °С), зарегистрированная у 12,5 % (DTPw-HepB-Hib) и 12,6 %
(DTPw-Hib + HepB) младенцев.
Заключение.
В заключение, полностью жидкая вакцина DTPw-HepB-Hib является хорошо переносимой и обладает такой же иммуногенностью, как и отдельно вводимые лицензированные
вакцина DTPw-Hib (Quattvaxem®) и вакцина против гепатита B (Hepavax-Gene®). Профиль иммуногенности вакцины DTPw-HepB-Hib аналогичен задокументированному профилю, соответствующему используемой в настоящее время комбинированной вакцине
DTPHepB/Hib.
Следует понимать, что данное описание изобретения приводится только в качестве
примера, и в него могут быть внесены модификации без изменения объема и сути изобретения.
Источники информации:
1. Биологические науки. - 1994. - Т. 22. - С. 353-360.
14
BY 16782 C1 2013.02.28
2. Rappuoli et al. European Commission COST/STD Initiative. Report of Expert Panel VIII
Раппуоли и др. Инициатива COST/STD Европейской комиссии, отчет экспертной комиссии VIII.
3. Пичичеро. Североамериканский журнал клинической педиатрии. - 2000. - Т. 47. - С.
407-426.
4. Корбель. Развитие биологических стандартов. - 1994. - Т. 87. - С. 113-124.
5. Парадизо. Журнал Американской медицинской ассоциации. - Т. 268. - С. 1685.
6. Сесардик и др. Биологические науки. - 1999. - Т. 27. - С. 177-181.
7. Международная патентная заявка WO 93/24148.
8. Международная патентная заявка WO 97/00697.
9. Международная патентная заявка WO 96/37222.
10. Стерджесс и др. Вакцины. - 1999. - Т. 17. - С. 1169-1178
11. Нолан и др. Вакцины. - 1998. - Т. 16. - С. 2085-2089.
12. Нолан и др. Вакцины. - 2001. - Т. 19. - С. 2127-2137.
13. Международная патентная заявка WO 99/13906.
14. Европейская патентная заявка 0 414 374.
15. Европейская патентная заявка 0 198 474.
16. Европейская патентная заявка 0 304 578.
17. Международная патентная заявка WO 91/14703.
18. Европейская патентная заявка 0 511 855.
19. Стивене. Вакцины. - 1988. - Т. 6. - С. 299-303.
20. Вакцины / Под ред. Плоткина и Мортимера, 1988.
21. Вакцины / Под ред. Плоткина и Оренстейна, 1999.
22. Густафсон и др. Медицинский журнал Новой Англии. - 1996. - Т. 334. - С. 349-355.
23. Раппуоли и др. // Тенденции биотехнологии. - 1991. - Т. 9. - С. 232-238.
24. Раппуоли. Природа и медицина. - 1997. - Т. 3. - С. 374-376.
25. Линдберг. Вакцины. - Т. 17. - № 2. - 1999. - С. S28-36.
26. Баттери и Моксон. Журнал Лондонского королевского медицинского колледжа. 2000. - № 34. - С. 163-168.
27. Ахмад и Чапник. Североамериканские клинические исследования инфекционных
болезней. - 1999. - № 13. - С. 113-33, vii.
28. Гольдблатт. Журнал медицинской микробиологии. - 1998. - Т. 47. - С. 563-567.
29. Европейский патент 0 477 508.
30. Патент США 5,306,492.
31. Патент WO 98/42721.
32. Дик и др. В сб. Конъюгатные вакцины / Под ред. Круза и др. - Базель: Каргер,
1989. - Т. 10. - С. 48-114.
33. Хермансон. Методики биоконъюгатов. - Сан-Диего: Академик Пресс, 1996.
34. Информация об исследованиях, 453077. - 2002.
35. Андерсон. Иммунитет к инфекциям. - 1983. - Т. 39. - № 1. - С. 233-238.
36. Андерсон и др. Журнал клинических исследований. - 1983. - Т. 76. - № 1. - С. 5259.
37. Европейский патент EP-A-0372501.
38. Европейский патент EP-A-0378881.
39. Европейский патент EP-A-0427347.
40. Международный патент WO 93/17712.
41. Международный патент WO 94/03208.
42. Международный патент WO 98/58668.
43. Европейский патент ЕР-А-0471177.
44. Международный патент WO 00/56360.
45. Международный патент WO 91/01146.
15
BY 16782 C1 2013.02.28
46. Международный патент WO 00/61761.
47. Лиис и др. Вакцины. - 1996. - Т. 14. - С. 190-198.
48. Международный патент WO 95/08348.
49. Международная патентная заявка WO 98/42721.
50. Патент США 4,882,317.
51. Патент США 4,695,624.
52. Европейский патент EP-B-0 477 508.
53. Молекулярная иммунология. - 1985. - № 22. - С. 907-919.
54. Европейский патент EP-A-0208375.
55. Международный патент WO 00/10599.
56. Гивер и др. Медицинская микробиология и иммунология. - 1979. - Т. 165. - С. 171288.
57. Патент США 4,057,685.
58. Патенты США 4,673,574; 4,761,283; 4,808,700.
59. Патент США 4,459,286.
60. Патент США 4,965,338.
61. Патент США 4,663,160.
62. Патент США 4,761,283.
63. Патент США 4,356,170.
64. Канра и др. Турецкий журнал педиатрии. - 1999. - Т. 42. - С. 421-427.
65. Равенскрофт и др. Развитие биологических наук. - Базель, 2000. - Т. 103. - С. 35-47.
66. Геннаро. Ремингтон: теория и практика фармакологии. 20-е издание, 2000.
67. Международная патентная заявка WO 99/24578.
68. Международная патентная заявка WO 99/36544.
69. Международная патентная заявка WO 99/57280.
70. Международная патентная заявка WO 00/22430.
71. Теттелин и др. Наука, 2000. - Т. 287. - С. 1809-1815.
72. Международная патентная заявка WO 96/29412.
73. Пиза и др. Наука, 2000. - Т. 287. - С. 1816-1820.
74. Международная патентная заявка WO 01/52885.
75. Бжун и др. Ланцет, 1991. - Т. 338. - № 8775. - С. 1093-1096.
76. Фукасава и др. Вакцины, 1999. - Т. 17. - С. 2951-2958.
77. Розенквист и др. Развитие биологических стандартов. - 1998. - № 92. - С. 323-333.
78. Костантино и др. Вакцина, 1992. - Т. 10. - С. 691-698.
79. Костантино и др. Вакцина, 1999. - Т. 17. - С. 1251-1263.
80. Международная патентная заявка PCT/IB02/03191.
81. Ватсон. Инфекционные педиатрические заболевания, 2000. - Т. 19. - С. 331-332.
82. Рубин. Североамер. журнал клинической педиатрии, 2000. - Т. 47. - С. 269-285, v.
83. Едржеяс. Обзор микробиологии и молекулярной биологии, 2001. - Т. 65. - С. 187207.
84. Белл. Инфекционные педиатрические заболевания, 2000. - Т. 19. - С. 187-1188.
85. Иварсон. Скандинавский журнал патологии, микробиологии и иммунологии, 1995. Т. 103. - С. 321-326.
86. Саттер и др. Североамер. журнал клинической педиатрии, 2000. - Т. 47. - С. 287308.
87. Зиммерман и Спан. Американский семейный врач, 1999. - Т. 59. - С. 113-118, 125126.
16
BY 16782 C1 2013.02.28
Фиг. 1А
Фиг. 1B
Фиг. 1C
Фиг. 1D
Фиг. 2A
Фиг. 2B
17
BY 16782 C1 2013.02.28
Фиг. 2C
Фиг. 3A
Фиг. 3B
Фиг. 3C
Фиг. 4A
Фиг. 4B
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
18
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
2 937 Кб
Теги
by16782, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа