close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16851

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.02.28
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
BY (11) 16851
(13) C1
(19)
G 01N 33/53 (2006.01)
СПОСОБ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
ИНФЕКЦИОННОГО МОНОНУКЛЕОЗА
(21) Номер заявки: a 20100682
(22) 2010.05.07
(43) 2011.12.30
(71) Заявитель: Учреждение образования
"Витебский государственный ордена Дружбы народов медицинский
университет" (BY)
(72) Авторы: Генералов Игорь Иванович;
Дмитраченко Татьяна Ивановна;
Железняк Наталья Васильевна (BY)
(73) Патентообладатель: Учреждение образования "Витебский государственный ордена Дружбы народов
медицинский университет" (BY)
(56) КИШКУН А.А. Иммунологические и
серологические исследования в клинической практике. - М.: Медицинское
информационное агентство, 2006. С. 339-346.
BY а 20060184, 2007.
RU 2360254 С1, 2009.
RU 2299439 С1, 2007.
UA 8019 U, 2005.
МОИСЕЕВА А.М. Вестник Витебского
государственного медицинского университета, 2009. - Т. 8. - № 2. - С. 48-57.
ГЕНЕРАЛОВ И.И. и др. Иммунология. - 2009. - Т. 30. - № 2. - С. 123-128.
BY 16851 C1 2013.02.28
(57)
Способ иммунологической диагностики инфекционного мононуклеоза, отличающийся тем, что из сыворотки крови больного выделяют аффинной хроматографией на протеине A или G поликлональные иммуноглобулины G и диагностируют инфекционный
мононуклеоз при выявлении у поликлональных иммуноглобулинов G оптическим методом с использованием L-лизин-р-нитроанилида в качестве субстрата лизин-амидазной активности.
Изобретение относится к медицине и может быть использовано в медицинской практике для диагностики инфекционного мононуклеоза, вызванного вирусом герпеса 4 типа
или вирусом Эпштейна-Барр (EBV). Способ основан на определении собственной каталитической (абзимной) активности поликлональных иммуноглобулинов класса G (IgG), появляющихся при данной болезни.
В настоящее время в диагностике инфекционного мононуклеоза используется несколько
методов [1]. Помимо клинического обследования больного, в качестве метода скрининга
на первом этапе применяется определение гетерофильных антител (AT), продукция которых значительно увеличивается при данном заболевании. В качестве подтверждающих
лабораторных методов используются различные варианты иммуноферментного анализа
для определения AT к нескольким антигенам (АГ) EBV.
Однако данные способы обеспечивают лабораторное подтверждение диагноза инфекционного мононуклеоза не во всех случаях. В наставлениях по иммуноферментному анализу для диагностики данного заболевания указывается, что "результаты анализа
необходимо оценивать в комплексе с клиническими данными и результатами других лабораторных исследований" [2].
BY 16851 C1 2013.02.28
До настоящего времени каталитическая активность антител и иммуноглобулинов не
использовалась в качестве специального диагностического критерия для установления диагноза инфекционного мононуклеоза.
Прототипом заявляемого способа является реакция агглютинации Пауля-Буннеля по
выявлению гетерофильных AT в сыворотке крови больных инфекционным мононуклеозом [1].
Метод включает несколько стадий:
получение сыворотки от больного;
определение гетерофильных AT в реакции агглютинации, при установлении титра AT
выше 1:224 устанавливают диагноз заболевания.
Недостатком метода является то, что реакция положительна не только при инфекции
вирусом Эпштейна-Барр, у детей чувствительность метода составляет менее 70 % при
специфичности 20 %.
Задачей изобретения является разработка нового метода лабораторной диагностики
инфекционного мононуклеоза посредством определения лизин-амидазной активности поликлональных IgG, выделенных из сыворотки крови больных данным заболеванием. Метод
обеспечивает более высокую эффективность диагностики инфекционного мононуклеоза.
Сущность изобретения заключается в том, что после получения препарата поликлональных иммуноглобулинов из сыворотки крови аффинной хроматографией на протеине
A или G проводят определение их каталитической лизин-амидазной активности; в случае
положительной реакции устанавливают диагноз инфекционного мононуклеоза.
Способ осуществляют следующим образом:
материалом для исходного получения препаратов поликлональных каталитических
иммуноглобулинов служат сыворотки больных инфекционным мононуклеозом.
Для получения гомогенного препарата поликлональных IgG, пригодного для оценки
абзимной активности, проводят его выделение из сывороток больных.
1. Кровь в количестве 1-3 мл без добавления антикоагулянта инкубируют в течение
2 часов при температуре 4 °С до образования сгустка. Затем центрифугируют 10-15 минут
в центрифужных пробирках в центрифуге с бакетным ротором (1500 об/мин). Аккуратно
забирают чистую сыворотку.
2. К сыворотке прибавляют охлажденный до 4 °С 0,75 % раствор риванола в соотношении 1 объем риванола к 2 объемам сыворотки. Смесь инкубируют при температуре 4 °С
не менее 2 часов.
3. Осадок отбрасывают. Риванол из надосадочной жидкости удаляют гель-фильтрацией на мелкопористой декстрановой матрице "Молселект Г10" или "Сефадекс G25"
(элюент - 0,15М раствор хлорида натрия на 0,01М ФБР, pH 7,2-7,4).
Для этого декстрановую матрицу размещают в полипропиленовой колонке объемом
12-14 мл диаметром 10 мм, объем сорбента составляет 8-10 мл. Элюцию проводят со скоростью 10-15 капель в минуту. Окончание разделения контролируют визуально по окрашенному переднему фронту прохождения риванола через выход колонки.
Далее проводят аффинную хроматографию, пропуская препарат через колонку с агарозой, конъюгированной с протеином А золотистого стафилококка, уравновешенную
0,1М фосфатным буфером со скоростью 6-7 капель в минуту. Колонку последовательно
промывают 0,1М фосфатным буфером, pH 7,4, с 1 % раствором тритона Х-305, а затем без
детергента в количестве 5-6 объемов колонки до исчезновения белка в элюенте.
4. Элюцию связавшихся иммуноглобулинов класса G (G1, G2, G4) проводят 0,02-0,05М
глицин-HCl буфером, pH 2,8, на 0,15М растворе NaCl до исчезновения белка в элюенте
(отбирают отдельно фракции по 1,5-2 мл). Фракции, содержащие наиболее высокие концентрации белка, объединяют.
Их нейтрализуют 1М раствором Трис или 1М глицин-NaOH буфером, pH 9,0 до pH
7,0-7,5. Концентрацию белка в полученных образцах определяют спектрофотометрически
на длине волны 280 нм.
2
BY 16851 C1 2013.02.28
Для подтверждения диагноза инфекционного мононуклеоза с возможностью его дифференциальной диагностики от других герпетических инфекций проводят определение
лизин-амидазной абзимной активности выделенных препаратов IgG.
Готовят раствор субстрата L-лизин-p-нитроанилида (ЛНА) в концентрации 0,5 мг/мл,
при этом растворяют его точную навеску в минимальном объеме диметилсульфоксида и
разбавляют реакционным трис-HCl буфером, pH 8,3, в соотношении 1/20.
К 0,2 мл раствора субстрата на трис-HCl буфере pH 8,3 прибавляют 0,05 мл препарата
IgG (концентрация - 0,5 мг/мл). Конечная реакционная смесь содержит 0,02 % азид Na. В
качестве контроля используют реакционный буфер. Инкубируют в течение 20 часов при
температуре 37 °С. Реакцию ставят в планшетах для ИФА. Опытные и контрольные пробы
дублируют. Учет проводят на многоканальном фотометре (двухволновое измерение на
405 и 570 нм).
Результаты выражают в единицах оптической плотности (ЕОП).
Определяют положительные образцы. Для этого к среднему значению оптической
плотности контроля прибавляют его утроенное стандартное отклонение; средние значения
опытных проб, превышающие данную величину, считают положительными.
Установлено, что положительная лизин-амидазная активность является высокоспецифичной для инфекционного мононуклеоза. При других вирусных заболеваниях частота
обнаружения этого вида активности была минимальной. При инфекционном мононуклеозе она обнаруживалась у 11 больных из 19, тогда как при другой герпетической инфекции
она была обнаружена в единичных случаях (1 из 8 больных инфекцией herpes labialis (вирус герпеса 1 типа); 1 из 11 больных ветряной оспой (вирус герпеса 3 типа); не обнаружена при инфекции herpes zoster). Данный вид активности не был обнаружен при вирусных
гепатитах B и C (30 обследованных пациентов), а также у здоровых лиц (24 здоровых донора).
Проведен расчет операционных характеристик данного теста для диагностики инфекционного мононуклеоза. В качестве групп сравнения использована контрольная группа
доноров (24 человека), а также объединенная группа больных другой герпетической инфекцией (25 человек).
Рассчитана диагностическая чувствительность, специфичность, диагностическая эффективность теста, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов, отношение правдоподобия положительного и отрицательного результата [3].
При сравнении с контрольной группой доноров эти показатели являются следующими:
диагностическая чувствительность установления диагноза инфекционного мононуклеоза по ЛНА-тесту - 58 %;
специфичность - 100 %;
диагностическая эффективность теста - 81,4 %;
прогностическая ценность положительного результата - 100 %;
прогностическая ценность отрицательного результата - 75 %;
отношение правдоподобия положительного результата - деление на "0";
отношение правдоподобия отрицательного результата - 0,42.
Эти показатели соответствуют критериям "полезного теста" для установления диагноза инфекционного мононуклеоза при дифференциации его от здоровых лиц.
При дифференциации инфекционного мононуклеоза от другой герпетической патологии получены следующие значения данных параметров:
диагностическая чувствительность установления диагноза инфекционного мононуклеоза по ЛНА-тесту - 58 %;
специфичность - 92 %;
диагностическая эффективность теста - 77 %;
прогностическая ценность положительного результата - 84,6 %;
прогностическая ценность отрицательного результата - 74 %;
3
BY 16851 C1 2013.02.28
отношение правдоподобия положительного результата - 7,25;
отношение правдоподобия отрицательного результата - 0,45.
Эти параметры также соответствуют критериям "полезного теста" для установления
диагноза инфекционного мононуклеоза при дифференциации его от другой герпетической
инфекции [3].
Определение лизин-амидазной активности предлагается использовать в качестве дополнительного лабораторного критерия с высокой специфичностью при установлении диагноза инфекционного мононуклеоза.
Источники информации:
1. Кишкун А.А. Иммунологические и серологические исследования в клинической
практике. - М.: Медицинское информационное агентство, 2006. - С. 339-346.
2. "Тест-система иммуноферментная для выявления иммуноглобулинов класса G к
ранним белкам вируса Эпштейна-Барр": Инструкция по применению. - Новосибирск: ЗАО
"Вектор-Бест", 2009. - С. 18.
3. Guidelines for immunologic laboratory testing in the rheumatic diseases: an introduction.
Am. Coll. of Rheumatology ad hoc Committee on immunologic testing guidelines//Arthritis
Rheum. - 2002. - Vol. 47. - P. 429-433.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
83 Кб
Теги
by16851, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа