close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16937

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
G 01N 21/27
G 01N 33/49
(2006.01)
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРБОНИЛПРОИЗВОДНЫХ
АМИНОКИСЛОТ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ
(21) Номер заявки: a 20100296
(22) 2010.03.01
(43) 2011.10.30
(71) Заявитель: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр гигиены" (BY)
(72) Авторы: Ткачев Сергей Викторович;
Соболь Юрий Александрович; Филонов Валерий Петрович (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное учреждение "Республиканский
научно-практический центр гигиены" (BY)
BY 16937 C1 2013.04.30
BY (11) 16937
(13) C1
(19)
(56) ДУБИНИНА Е.Е. и др. Вопросы медицинской химии. - 1995. - Т. 41. - № 1. С. 24-26.
REZNICK A.Z. et al. Methods in Enzymology. - 1994. - V. 233. - P. 357-363.
CAO G. et al. Archives of Biochemistry
and Biophysics. - 1995. - V. 320. - No. 1. P. 106-114.
LEVINE L.R. et al. Methods in Enzymology. - 1990. - V. 186. - P. 464-478.
OLIVER C.N. et al. The Journal of Biological Chemistry. - 1987. - V. 262. No. 12. - P. 5488-5491.
RU 2334986 C1, 2008.
RU 2249212 C1, 2005.
JP 09-126996 A, 1997.
(57)
Способ определения карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови, заключающийся в том, что белки сыворотки крови окисляют в течение 1 ч в среде, приготовленной на 0,01 M TrisHCl/0,15 M NaCl буфере с pH 7,4, содержащей FeSO4,
аскорбиновую кислоту и H2O2 в конечных концентрациях 10 мкМ, 2 мМ и 100 мМ соответственно, к пробе окисленной сыворотки добавляют равный объем 0,1 % раствора
2,4-динитрофенилгидразина в 2 M HCl и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч при постоянном встряхивании, осаждают белки сыворотки крови 20 % раствором
трихлоруксусной кислоты, пробу центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин, полученный осадок промывают 1 раз дистиллированной водой и 3 раза смесью этанола и этилацетата, взятых в соотношении 1 : 1, высушивают и растворяют в 6 M растворе
гуанидингидрохлорида, измеряют оптическую плотность раствора образовавшихся динитрофенилгидразонов на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 370 нм, используя в
качестве контроля сыворотку крови, не подвергнутую окислению, и определяют содержание карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови с использованием молярного коэффициента светопоглощения, равного 21×103 M-1 ⋅ см-1.
Изобретение относится к биохимии, в данном случае к разделам биохимии белка, а
также к разделу клинической лабораторной диагностики.
Известен способ определения карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки
крови, заключающийся в реакции взаимодействия карбонильных групп окисленных ами-
BY 16937 C1 2013.04.30
нокислотных остатков белков сыворотки крови с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием окрашенных динитрофенилгидразонов аминокислот [1]. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого
способа и прототипа является использование в определении карбонилпроизводных аминокислот 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ). Недостатком данного способа является
то, что в нем используются неоправданно высокие концентрации 2,4-ДНФГ (2 % раствор
2,4-ДНФГ в 2M HCl), также прототип обладает более низкой специфичностью и воспроизводимостью по отношению к заявляемому способу.
Задачей заявляемого изобретения является повышение специфичности и воспроизводимости за счет проведения дополнительных процедур очистки окрашенного продукта, а
также изменения последовательности операций (реакцию с 2,4-ДНФГ проводят до процедуры осаждения белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ)) и экономичности - за счет использования более низких концентраций 2,4-ДНФГ.
Поставленная задача достигается следующим образом: предложен способ определения
карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови, заключающийся в том, что
белки сыворотки крови окисляют в течение 1 ч в среде, приготовленной на 0,01 M
TrisHCl/0,15 M NaCl буфере с pH 7,4, содержащей FeSO4, аскорбиновую кислоту и H2O2 в
конечных концентрациях 10 мкМ, 2 мМ и 100 мМ соответственно, к пробе окисленной
сыворотки добавляют равный объем 0,1 % раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 M
HCl и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч при постоянном встряхивании, осаждают белки сыворотки крови 20 % раствором трихлоруксусной кислоты, пробу
центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин, полученный осадок промывают 1 раз дистиллированной водой и 3 раза смесью этанола и этилацетата, взятых в соотношении 1 : 1,
высушивают и растворяют в 6 M растворе гуанидингидрохлорида, измеряют оптическую
плотность раствора образовавшихся динитрофенилгидразонов на спектрофотометре СФ46 при длине волны 370 нм, используя в качестве контроля сыворотку крови, не подвергнутую окислению, и определяют содержание карбонилпроизводных аминокислот белков
сыворотки крови с использованием молярного коэффициента светопоглощения, равного
21×103 M-1 ⋅ см-1.
Пример 1.
Исследования выполняют на 10 нелинейных белых крысах с исходной массой 160180 г. Крыс декапитируют под эфирным наркозом. Собирают вытекавшую из шейных сосудов кровь. Сыворотку крови отделяют от форменных элементов путем центрифугирования (3000 об/мин). Окисление белков сыворотки крови проводят в течение 1 ч, в среде,
содержащей 10 мкМ FeSO4 В среду инкубации также входят аскорбиновая кислота (АК) и
H2O2 соответственно в конечных концентрациях 2 и 100 мМ. Растворы реагентов готовят
на 0,01 М TrisHCl/0,15 M NaCl буфере (pH - 7,4). После процедуры окисления к 1,0 мл сыворотки приливают 1,0 мл 0,1 % раствора 2,4-ДНФГ в 2 M HCl. Инкубацию осуществляют
при комнатной температуре в течение 1 ч при постоянном встряхивании образца, затем
пробы центрифугируют при 3000 g в течение 20 мин. Осадок промывают 1 раз дистиллированной водой для удаления водорастворимых карбонилсодержащих соединений, прореагировавших с 2,4-ДНФГ, и 3 раза смесью этанол : этилацетат (1 : 1) для экстракции
липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных
аминокислот. Полученный осадок высушивается для удаления растворителей и затем растворяется в 6 М гуанидингидрохлориде. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрируют на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 370 нм.
Содержание карбонилпроизводных аминокислот определяют с использованием молярного
коэффициента светопоглощения, равного 21 мМ-1·см-1. В качестве контроля используют
сыворотку крови, которую не подвергали окислению.
В таблице приведены результаты оценки содержания динитрофенилгидразонов в нативной и окисленной сыворотке крови крыс способом-прототипом и заявляемым способом.
2
BY 16937 C1 2013.04.30
Содержание карбонилпроизводных аминокислот в нативной (1) и окисленной (2)
сыворотки крови крыс, мкмоль ДНФГ/мл сыворотки
Способ-прототип
Заявляемый способ
№
1
2
1
2
1
21,34
42,44
20,31
36,86
2
23,14
53,18
19,54
41,45
3
22,16
42,65
18,3
39,23
4
28,63
38,62
21,36
42,43
5
23,15
44,21
18,64
36,6
6
25,25
44,34
19,88
39,78
7
24,38
45,22
20,32
38,21
8
26,77
38,18
21,21
43,1
9
23,24
38,43
22,03
42,03
10
24,65
34,56
18,7
39,74
Среднее арифм. (X)
24,271
42,18
20,029
39,94
Среднеквадр. откл. (S)
2,07
4,9
1,20
2,2
Коэфф. вариации, %
8,54
11,62
5,97
5,43
Уровень значимости, р
< 0,001
< 0,001
(критерий Стьюдента)
Как видно из данных таблицы, снижение концентрации 2,4-ДНФГ и дополнительная
процедура отмывки осадка дистиллированной водой приводят к некоторому снижению
уровня значений динитрофенилгидразонов белков в нативной и окисленной сыворотке
крови, вероятно, за счет удаления низкомолекулярных водорастворимых соединений
небелкового происхождения, прореагировавших с 2,4-ДНФГ. Также обнаружено, что заявляемый способ обладает более низкой вариабельностью по сравнению с прототипом.
Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа, по сравнению с прототипом, заключается в повышении специфичности и воспроизводимости метода, а также его удешевлении.
Способ может использоваться в научных и клинических диагностических лабораториях для оценки окислительной модификаций белка, в том числе и при патологических состояниях. Способ прост, не требует значительных финансовых затрат на его
осуществление и позволяет повысить точность и качество исследований, что, в свою очередь, позволяет решать вопросы точной диагностики процессов, сопровождаемых окислительными процессами.
Источники информации:
1. Дубинина Е.Е., Бумистров С.О., Ходов Д.А., Поротов Г.Е. Вопросы медицинской
химии. - 1995. - № 1. - С. 24-26.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
85 Кб
Теги
by16937, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа