close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16945

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 5/077
(2010.01)
СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ
СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА
(21) Номер заявки: a 20101260
(22) 2010.08.23
(43) 2012.04.30
(71) Заявители: Государственное учреждение "Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии
и микробиологии"; Государственное научное учреждение "Институт
биофизики и клеточной инженерии
Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Квачева Зинаида Болеславовна; Лобанок Елена Станиславовна; Пыко Илья Васильевич; Корень Сергей Викторович; Амвросьева Тамара Васильевна; Василевич Ирина Борисовна (BY)
BY 16945 C1 2013.04.30
BY (11) 16945
(13) C1
(19)
(73) Патентообладатели: Государственное
учреждение "Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии"; Государственное научное учреждение "Институт
биофизики и клеточной инженерии
Национальной академии наук Беларуси" (BY)
(56) ПЫКО И.В. и др. Состояние и перспективы трансплантологии. Материалы Международной научно-практической конференции. - Минск: Белорусская наука, 2008. - С. 182-188.
NARDI S. et al. Int.J.Dev.Biol. - 2007. V. 51. - Р. 723-729.
CHEN Xi et al. Stem Cells. - 2006. - V.
24. - Р. 2052-2059.
BY 11560 C1, 2009.
US 5908782 A, 1999.
(57)
Способ культивирования мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, включающий использование культурального флакона с ростовой средой, содержащей среду
ДМЕМ, 2 мМ L-глутамина, антибиотик, 15-20 % эмбриональной телячьей сыворотки, отличающийся тем, что в среду дополнительно добавляют ростовой фактор Stem Cell Factor до концентрации 10 нг/мл, а в качестве культурального флакона используют
герметично закрываемый флакон цилиндрической формы радиусом 12,5-25,0 мм, изготовленный из нейтрального стекла, при этом культивирование мезенхимальных стволовых
клеток осуществляют при горизонтальном расположении культурального флакона.
Изобретение относится к медицине, а именно к клеточной биологии, и может применяться в качестве способа культивирования мезенхимальных стволовых клеток (МСК),
избирательно повышая в суспензии клеток костного мозга адгезионную способность и
пролиферативную активность МСК.
Известны способы культивирования МСК [1, 2, 3], заключающиеся в том, что клетки
инкубируют в пластиковых культуральных плоских флаконах площадью 25, 75 и 175 см2 с
плоской поверхностью для прикрепления клеток в ростовых средах, в состав которых
входит среда ДМЕМ, 2 мМ L-глутамина, 10 % сыворотки плодов коров, с использованием
bFGF или без него, или готовые наборы для роста клеток различных фирм. В течение
BY 16945 C1 2013.04.30
10-14 суток культивирования в атмосфере 5 % CO2 при 37 °С наблюдают рост клеток в
виде колоний с последующим формированием монослоя клеток. Уровни клеточной пролиферации оценивают по срокам достижения сатурации монослоя клеток и их плотности.
Наиболее близким к изобретению является способ культивирования МСК мыши, описанный в статье S. Nadri и др. [4]. Клетки по этому способу выращивались в среде ДМЕМ
с добавлением 15 % эмбриональной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глютамина, 100 ед/мл
пенициллина и 100 ед/мл стрептомицина при 37 °С и 5 % CO2. Первичные культуры
(0 пассаж) выращивались в пластиковых 6-луночных планшетах, при субкультивировании
клетки первого пассажа помещали в пластиковые культуральные флаконы площадью 25 см2.
Недостатком известного способа является его длительность (клетки 0 пассажа получали через 2 недели, клетки первого пассажа - через 1 неделю) и сложность наработки
больших количеств МСК, необходимость использования CO2 инкубатора, возможность
только одноразового использования культуральных флаконов.
Задачей изобретения является создание условий для избирательного наращивания
значительного количества биомассы МСК костного мозга, сокращение времени культивирования клеток до формирования плотного клеточного монослоя, повышение адгезии и
пролиферативной активности МСК.
Результат достигается в способе культивирования МСК, включающем использование
культурального флакона с ростовой средой, содержащей среду ДМЕМ, 2 мМ L-глутамина,
антибиотик, 15-20 % эмбриональной телячьей сыворотки. В среду дополнительно добавляют ростовой фактор SCF (Stem Cell Factor) до концентрации 10 нг/мл, а в качестве культурального флакона используют герметично закрываемый флакон цилиндрической формы
радиусом 12,5-25,0 мм (для максимально быстрого прикрепления и накопления относительно небольших количеств клеток, и для накопления максимально возможного количества клеток в течение ограниченного временного промежутка). Культивирование МСК
осуществляют при горизонтальном расположении культурального флакона.
Применение указанных флаконов в большей мере соответствует условиям жизнедеятельности МСК в организме (условия in vivo), пространственной организации, присущей
структуре кости и ориентации клеток в процессе их роста, размножения и развития в
костном мозге [5].
Известно использование культуральных флаконов цилиндрической формы, находящихся в горизонтальном положении, при культивировании перевиваемых клеточных линий. Однако в качестве культуральных флаконов при культивировании МСК их
применение не известно.
В настоящее время для культивирования МСК используют Т-образные флаконы,
впервые предложенные Эрлом [6]. Недостатками при применении этого типа флаконов
является трудоемкость и сложность наработки больших количеств МСК, необходимость
использования CO2 инкубаторов, способность обеспечивать пролиферативную активность
клеток лишь при специальной обработке внутренней поверхности культуральных флаконов (белками внеклеточного матрикса - фибронектин, ламинин), отсутствие производства
в Республики Беларусь плоских культуральных флаконов с обработанной внутренней поверхностью и высокая стоимость таких флаконов у зарубежных фирм.
Способ иллюстрируется следующими примерами.
Пример 1.
Клетки выделяют из костного мозга экспериментальных животных (мыши, крысы),
полученного из бедренных, большеберцовых и плечевых костей животных. Костный мозг
подвергают механической дезагрегации до образования клеточной суспензии. Выделение
клеточной фракции МСК проводят используя способность этих клеток к адгезии к субстрату. Приготовленную клеточную суспензию объемом 2,5 мл, содержащую
1,0x106 клеток/мл ростовой среды, в состав которой входят питательная среда ДМЕМ, Lглутамин, 20 % сыворотки плодов коров, антибиотик (гентамицин) и 10 нг/мл SCF, поме2
BY 16945 C1 2013.04.30
щают в герметично закрытые цилиндрические стеклянные культуральные флаконы с радиусом 5,0 мм с необработанной внутренней поверхностью, находящиеся в горизонтальной плоскости. Первую смену среды проводят спустя одни сутки после посева клеток. В
течение последующих 3-5 суток культивирования в термостате при 37 °С наблюдают рост
клеток в виде колоний с последующим формированием клеточного монослоя с преимущественным ростом фибробластоподобных (мезенхимальных стволовых клеток) клеток, составляющих в общей популяции не менее 70-80 %. Время до достижения сатурации
монослоя клеток составляет 7-9 суток.
Пример 2.
Манипуляции, описанные в примере 1, выполняют с использованием цилиндрических,
находящихся в горизонтальном положении, культуральных стеклянных флаконов с радиусом 12,5 мм с необработанной внутренней поверхностью, в которые помещают 2,5 мл
клеточной суспензии (1,0x106 клеток/мл ростовой среды).
Время до достижения сатурации монослоя клеток составляет 5-6 суток.
Пример 3.
Манипуляции, описанные в примере 1, выполняют с использованием цилиндрических,
находящихся в горизонтальном положении, культуральных стеклянных флаконов с радиусом кривизны 17,5 мм с необработанной внутренней поверхностью флакона, в которые
помещали 5 мл клеточной суспензии (1,0x106 клеток/мл ростовой среды).
Время до достижения сатурации монослоя клеток составляет 5-6 суток.
Пример 4.
Манипуляции, описанные в примере 1, выполняли с использованием цилиндрических,
находящихся в горизонтальном положении, культуральных стеклянных флаконов с радиусом кривизны 25,0 мм с необработанной внутренней поверхностью флакона, в которые
помещали 10 мл клеточной суспензии (1,0x106 клеток/мл ростовой среды).
Время до достижения сатурации монослоя клеток составляет 5-6 суток.
Пример 5.
Манипуляции, описанные в примере 1, выполняли с использованием цилиндрических,
находящихся в горизонтальном положении, культуральных стеклянных флаконов с радиусом кривизны 35,0 мм с необработанной внутренней поверхностью флакона, в которые
помещали 15 мл клеточной суспензии (1,0x106 клеток/мл ростовой среды).
Время до достижения сатурации монослоя клеток составляет 9-10 суток.
Сравнительные уровни пролиферативной активности МСК при применении культуральных цилиндрических флаконов, находящихся в горизонтальном положении, и флаконов с плоской поверхностью для прикрепления клеток представлены в таблице.
Форма культурального флакона
Пластиковые плоские культуральные флаконы, покрытые
коллагеном 1-го типа А (прототип)
Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в горизонтальном положении, радиус
кривизны 5,0 мм
Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в 4. горизонтальном положении, радиус
кривизны 12,5 мм
Посевная доза кле- Процент адгези- Плотность
ток в 1 мл ростовой рованных кле- клеток (в тысреды
ток
сячах) на 1см2
1x106
11,2±4,1х)
56,5±3,2я)
1x106
15,4±3,3
68,2±3,1
1x106
21,1±1,2хх
85,5±3,5ЯЯ)
3
BY 16945 C1 2013.04.30
Продолжение таблицы
Форма культурального флакона
Посевная доза кле- Процент адгези- Плотность
ток в 1 мл ростовой рованных кле- клеток (в тысреды
ток
сячах) на 1см2
Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в горизон1x106
20,2±2,1
88,2±4,7
тальном положении, радиус
кривизны 17,5 мм
Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в горизон1x106
25,4±3,0ххх
97,4±2,1яяя)
тальном положении, радиус
кривизны 25,0 мм
Цилиндрические стеклянные флаконы, находящийся в горизон1x106
7,2±2,1
36,1±4,5
тальном положении, радиус
кривизны 35,0 мм
Примечание: P между хх) и х) < 0,01; ххх) и х) < 0,01
яя) и я) < 0,05, яяя) и я) < 0,05.
Как видно из данных, представленных в таблице, предлагаемая форма культурального
флакона - цилиндрическая, флакон находится в горизонтальном положении, кривизна радиуса поверхности стеклянного флакона от 12,5 до 25 мм обеспечивает больший уровень
пролиферативной активности МСК по сравнению с прототипом.
Отличие и преимущества предлагаемого способа состоят в простоте (не требуется
специальная обработка внутренней поверхности флаконов для культивирования), более
высокой адгезии клеток во флаконах с радиусом кривизны 12,5-25,0 мм в горизонтальном
положении, экономичности (не требует использования CO2 инкубатора, закупки импортных флаконов, позволяет многократно использовать флаконы), сокращении времени достижения сатурации клеточного монослоя за "счет повышения пролиферативной
активности клеток в условиях, соответствующих жизнедеятельности МСК in vivo, и пространственной организации, присущей структуре трубчатой кости, и при добавлении в
среду роста МСК ростового фактора SCF в обеспечении возможности получения большего количества клеток за более короткие сроки с целью последующего их применения.
Таким образом, предлагаемый способ повышения адгезионной способности, заключающийся в использовании культуральных флаконов, позволяет достичь большего уровня
пролиферативной активности и адгезионной способности МСК при отсутствии необходимости применения CO2 инкубатора, сокращения времени культивирования мезенхимальных стволовых клеток для получения достаточных количеств клеток для последующего
их применения.
Источники информации:
1. Bonab M. M. et al. Aging of mesenchymal stem cell in vitro // BMC Cell Biology. 2006. - Vol. 7. - No. 14.
2. Wagner W. et al. Comparative characteristics of mesenchymal stem cells from human
bone marrow, adipose tissue, and umbilical cord blood // Experimental hematology. - 2005. Vol. 33. - P. 1402-1416.
3. Deng J. et al. Mesenchymal stem cells spontaneously express neural proteins in culture
and are neurogenic after transplantation // Stem Cells. - 2006. - Vol. 24. - P. 1054-1064.
4. Nardi S. et al. An efficient method for isolation of murine bone marrow mesenshymal
stem cells // Int. J. Dev. Biol. - 2007. - Vol. 51. - P. 723-729.
4
BY 16945 C1 2013.04.30
5. Brunet-lmbault B. et al. A new anisotropy index on trabecular bone radiographic images
using the fast Fourier transform // BMC Medical Imaging. - 2005. - Vol. 5. - No. 4.
6. Пол Д. Культура клеток и ткани. - М.: Медгиз, 1963. - 348 с.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
5
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
89 Кб
Теги
патент, by16945
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа