close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16957

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/02 (2006.01)
G 01N 33/50 (2006.01)
СПОСОБ ОЦЕНКИ ФИБРИНОГЕНЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
(21) Номер заявки: a 20100849
(22) 2010.05.31
(43) 2012.02.28
(71) Заявитель: Учреждение образования
"Полесский государственный университет" Национального банка Республики Беларусь (BY)
(72) Авторы: Никандров Виталий Николаевич; Пыжова Нелли Семеновна (BY)
(73) Патентообладатель: Учреждение образования "Полесский государственный университет" Национального
банка Республики Беларусь (BY)
BY 16957 C1 2013.04.30
BY (11) 16957
(13) C1
(19)
(56) НИКАНДРОВ В.Н. и др. Роль антропогенных и природных патогенов в
формировании инфекционных и неинфекционных болезней человека. Медико-биологические аспекты проблемы:
Материалы Международной конференции. - Минск: НЕССИ, 2002. - С. 326-342.
SU 1472508 A1, 1989.
SU 1390241 A1, 1988.
Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов. Методы исследования. Ленинград: Наука, 1979. - С. 24-28.
(57)
Способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что на фибриноген-агаровую пластину, приготовленную с
использованием 0,05 M боратного буфера pH 11,0, в который добавлен агар до концентрации 1 %, однозамещенный фосфат натрия или калия до концентрации (0,15-10,0) × 10-2 M
и фибриноген человека в количестве 20 г на 1 л буфера, наносят 15 мкл суспензии клеток
условно-патогенных микроорганизмов, инкубируют при 37 °С в течение 24 часов и оценивают фибриногенлитическую активность условно-патогенных микроорганизмов по
площади зоны лизиса фибриногена.
Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к оценке "щелочной" протеолитической активности, т.е. активности протеиназ с оптимумом pH 9,0 и выше, клеток
условно-патогенных микроорганизмов.
В настоящее время определение протеолитической активности условно-патогенных
микроорганизмов затруднено, поскольку используемые для такого анализа белковые субстраты - казеин, гемоглобин, желатин, альбумин, фибрин [1, 2] - в обычных условиях часто не расщепляются протеиназами микроорганизмов. Между тем оценка расщепления
этих субстратов чрезвычайно важна для общебиологических исследований: биохимической дифференциации видов и штаммов, например рода Erwinia [3], рода Corynebacteria
[4] и др., а также для прикладных целей создания или изыскания прежде всего специфических ингибиторов протеиназ, учитывая важную роль этих энзимов в жизнедеятельности
патогенных микроорганизмов и патогенезе ряда заболеваний бактериальной этиологии.
Известен способ определения протеолитической активности условно-патогенных
микроорганизмов, заключающийся в том, что образцы суспензии клеток в 0,15 M растворе
BY 16957 C1 2013.04.30
NaCl наносят на белок-агаровые пластины, содержащие в качестве субстрата гемоглобин
или казеин в концентрации 10 г/л, агар "Дифко", а также 0,15 M раствор NaCl pH 7,4, инкубируют пластины при 37 °С в течение 24 часов, обрабатывают их 2 н трихлоруксусной
кислоты и учитывают протеолитическую активность по степени расщепления белка субстрата, измеряя площадь зон лизиса белка, обусловленного действием на субстрат активных протеолитических энзимов [5].
Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому.
Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является добавление исследуемых образцов к белковому субстрату (белок-агаровой пластине), инкубация при температуре 37 °С и определение меры расщепления белкового субстрата. Однако недостатком
прототипа является низкая чувствительность способа, что часто не позволяет вообще выявить наличие "щелочной" протеолитической активности в исследуемом образце.
Задачей заявляемого способа является повышение чувствительности способа выявления "щелочной" протеолитической активности условно-патогенных микроорганизмов.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что на
фибриноген-агаровую пластину, приготовленную с использованием 0,05 M боратного буфера pH 11,0, в который добавлен агар до концентрации 1 %, однозамещенный фосфат
натрия или калия до концентрации (0,15-10,0) × 10-2 М и фибриноген человека в концентрации 20 г на 1 л буфера, наносят 15 мкл суспензии клеток условно-патогенных микроорганизмов, инкубируют при 37 °С в течение 24 часов и оценивают фибриногенлитическую
активность условно-патогенных микроорганизмов по площади зоны лизиса фибриногена.
Использование при приготовлении белок-агаровой пластины в качестве белка-субстрата фибриногена и 0,05 M боратного буфера pH 11,0, в который добавляют однозамещенный фосфат натрия (или калия) в концентрации (0,15-10,0) × 10-2 М, позволяет значительно
повысить чувствительность способа определения "щелочной" протеолитической активности клеток условно-патогенных микроорганизмов.
Пример 1
Готовят 8 пластин 1 %-ного агара "Difco" на 0,05 М боратном буфере pH 11,0, содержащих фибриноген человека в концентрации 2 %.
Пластину № 1 готовят с использованием в качестве растворителя 0,05 M боратного
буфера pH 11,0 без добавок (контроль). Остальные пластины готовят с использованием в
качестве растворителя 0,05 M боратного буфера pH 11,0 с добавлением однозамещенного
фосфата натрия в концентрации (×10-2 M): пластину № 2 - 10,0; пластину № 3 - 5,0; пластину № 4 - 2,5; пластину № 5 - 1,25; пластину № 6 - 0,63; пластину № 7 - 0,31; пластину
№ 8 - 0,15. На все пластины наносят по 15 мкл микродозатором суспензий клеток, выделенных при центрифугировании из суточных бульонных культур 10 различных штаммов
условно-патогенных микроорагнизмов. Затем инкубируют все фибриноген-агаровые пластины с нанесенными на поверхность образцами при 37 °С в течение 24 часов.
Затем обрабатывают пластину 2 н раствором трихлоруксусной кислоты и измеряют
площадь зон расщепления фибриногена в мм2. Результаты определения площади зон расщепления фибриногена представлены в табл. 1.
Из данных табл. 1 видно, что определение активности "щелочных" протеиназ клеток
условно патогенных микроорганизмов достигается только в присутствии в реакционной
системе однозамещенного фосфата натрия в концентрации (0,63-10,0) × 10-2 M.
Пример 2.
Готовят 8 пластин 1 %-ного агара "Difco" на 0,05 M боратном буфере pH 11,0, содержащих фибриноген человека в концентрации 2 %.
Пластину № 1 готовят с использованием в качестве растворителя 0,05 M боратного
буфера pH 11,0 без добавок (контроль). Остальные пластины готовят с использованием в
качестве растворителя 0,05 M боратного буфера pH 11,0 с добавлением однозамещенного
2
BY 16957 C1 2013.04.30
фосфата калия в концентрации (×10-2 M): пластину № 2 - 10,0; пластину № 3 - 5,0; пластину
№ 4 - 2,5; пластину № 5 - 1,25; пластину № 6 - 0,63; пластину № 7 - 0,31; пластину № 8 0,15. На все пластины наносят по 15 мкл микродозатором суспензий клеток, выделенных
при центрифугировании из суточных бульонных культур 10 различных штаммов условнопатогенных микроорганизмов. Затем инкубируют все фибриноген-агаровые пластины с
нанесенными на поверхность образцами при 37 °С в течение 24 часов.
Затем обрабатывают пластину 2 н раствором трихлоруксусной кислоты и измеряют
площадь зон расщепления фибриногена в мм2. Результаты определения площади зон расщепления фибриногена представлены в табл. 2.
Таблица 1
Влияние однозамещенного фосфата натрия на "щелочную" фибриногенлитическую
активность (мм2 площади зон лизиса) клеток различных условно-патогенных
микроорганизмов. Растворитель при приготовлении геля - 0,05 M боратный буфер
pH 11,0 (представлены средние значения, n = 4)
Микроорганизм
E. coli 25922
E. coli K-12
Salmonella enteritidis
Salmonella typhi
Shigella flexneri
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Staphyl. aureus 25923
Staphyl. aureus
госпитальный штамм
контроль
0
0
Концентрация соли (NaH2PO4) × 10-2 M
10,0
5,0
2,5
1,25
0,63
0,31
77
127
130
138
138
0
57
128
139
156
0
0
0,15
0
0
0
0
0
0
0
105
109
110
102
95
138
105
119
115
116
122
0
112
111
110
132
0
127
112
132
91
0
138
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
86
86
100
100
121
98
156
0
0
0
0
0
0
0
Таблица 2
Влияние однозамещенного фосфата калия на "щелочную" фибриногенлитическую
активность (мм2 площади зон лизиса) клеток различных условно-патогенных
микроорганизмов. Растворитель при приготовлении геля - 0,05 M боратный буфер
pH 11,0 (представлены средние значения, n = 4)
Микроорганизм
E. coli 25922
E. coli К- 12
Salmonella enteritidis
Salmonella typhi
Shigella flexneri
Proteus vulgaris
Proteus mirabilis
Staphyl aureus 25923
Staphyl aureus
госпитальный штамм
контроль
0
0
0
0
0
0
0
Концентрация соли (KH2PO4) × 10-2 M
10,0
5,0
2,5
1,25
0,63
0,31
100
90
164
150
126
138
90
116
103
160
150
153
0,15
196
176
128
110
93
127
98
196
0
203
168
0
121
121
81
145
100
121
113
61
147
95
138
0
113
199
110
123
0
97
136
0
169
0
100
169
0
0
92
110
127
90
0
0
0
0
68
106
88
107
0
0
0
Из данных таблицы видно, что определение активности "щелочных" протеиназ клеток
условно - патогенных микроорганизмов достигается только в присутствии в реакционной
системе однозамещенного фосфата калия в концентрации (0,15-10,0) × 10-2 М.
3
BY 16957 C1 2013.04.30
Источники информации:
1. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта и др. 9-е изд. - М.: Мир, 1997. Т. 1. - С. 237.
2. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта и др. 9-е изд. - М.: Мир, 1997. Т. 2. - С. 603.
3. Методы определения протеолитической активности и выделения протеолитических
ферментов. В кн.: "Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов (методы исследования). - Л.: Наука, 1979. - С. 24-33.
4. Билай Т.П. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. - Киев: Науковая
думка, 1985. - С. 55-76.
5. Никандров В.П., Пыжова Н.С., Шатило НЛ. Протеолитическая и эндонуклеазная активность штаммов Corynebacterium diphtheriae при росте на питательных средах сложного
состава. I. "Нейтральные" деполимеразы // Роль антропогенных и природных патогенов в
формировании инфекционных и неинфекционных болезней человека. Медико-экологич.
аспекты проблемы: Матер. междунар. конфер. - Минск, 2002. - С. 326-342.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
4
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
98 Кб
Теги
by16957, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа