close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY16958

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/02 (2006.01)
G 01N 33/50 (2006.01)
СПОСОБ ОЦЕНКИ ФИБРИНОГЕНЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ
(21) Номер заявки: a 20100850
(22) 2010.05.31
(43) 2012.02.28
(71) Заявитель: Учреждение образования
"Полесский государственный университет" Национального банка Республики Беларусь (BY)
(72) Авторы: Никандров Виталий Николаевич; Пыжова Нелли Семеновна
(BY)
(73) Патентообладатель: Учреждение образования "Полесский государственный университет" Национального
банка Республики Беларусь (BY)
BY 16958 C1 2013.04.30
BY (11) 16958
(13) C1
(19)
(56) НИКАНДРОВ В.Н. и др. Роль антропогенных и природных патогенов в
формировании инфекционных и неинфекционных болезней человека.
Медико-биологические аспекты проблемы. Материалы Международной
конференции. - Минск: НЕССИ, 2002. С. 326-342.
SU 1472508 A1, 1989.
SU 1390241 A1, 1988.
БИЛАЙ Т.И. Термофильные грибы и
их ферментативные свойства. - Киев:
Навукова думка, 1985. - С. 54-77.
(57)
Способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что на фибриноген-агаровую пластину, приготовленную с
использованием 0,15 M раствора NaCl с pH 7,5, в который добавлен агар до концентрации
1 %, пирофосфат натрия до концентрации 10-6-10-2 M и бычий фибриноген в количестве
20 г на 1 л раствора NaCl, наносят 15 мкл суспензии клеток условно-патогенных микроорганизмов, инкубируют при 37 °С в течение 24 ч и оценивают фибриногенлитическую активность условно-патогенных микроорганизмов по площади зоны лизиса фибриногена.
Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к оценке протеолитической активности клеток условно-патогенных микроорганизмов.
В настоящее время определение протеолитической активности условно-патогенных
микроорганизмов затруднено, поскольку используемые для такого анализа белковые субстраты - казеин, гемоглобин, желатин, альбумин, фибрин [1,2] - в обычных условиях часто
не расщепляются протеиназами микроорганизмов. Между тем оценка расщепления этих
субстратов чрезвычайно важна для общебиологических исследований: биохимическая
дифференциация видов и штаммов, например, рода Erwinia [3], рода Corynebacteria [4] и
др., а также для прикладных целей: создания или изыскания прежде всего специфических
ингибиторов протеиназ, учитывая важную роль этих энзимов в жизнедеятельности патогенных микроорганизмов и патогенезе ряда заболеваний бактериальной этиологии.
BY 16958 C1 2013.04.30
Известен способ определения протеолитической активности условно-патогенных
микроорганизмов, заключающийся в том, что аликвоты суспензии клеток в 0,15 M растворе NaCl наносят на белок-агаровые пластины, содержащие в качестве субстрата гемоглобин или казеин в концентрации 10 г/л, агар "Дифко", а также 0,15 М раствор NaCl, pH
7,4, инкубируют пластины при 37 °С в течение 24 ч, обрабатывают их 2 н трихлоруксусной кислотой и учитывают протеолитическую активность по степени расщепления белка
субстрата, измеряя площадь зон лизиса белка, обусловленного действием на субстрат активных протеолитических энзимов [5].
Указанный способ является прототипом в отношении заявляемому.
Общими признаками для заявляемого способа и прототипа являются добавление исследуемых образцов к белок-агаровой пластине, инкубация при температуре 37 °С и определение меры расщепления белкового субстрата. Однако недостатком прототипа является
низкая чувствительность способа, что часто не позволяет вообще выявить наличие протеолитической активности в исследуемом образце.
Задачей заявляемого способа является повышение чувствительности способа выявления "нейтральной" протеолитической активности клеток условно-патогенных микроорганизмов.
Поставленная задача достигается тем, что предложен способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что на
фибриноген-агаровую пластину, приготовленную с использованием 0,15 М раствора NaCl,
pH 7,5, в который добавлен агар до концентрации 1 %, пирофосфат натрия до концентрации
10-6-10-2 M и бычий фибриноген в количестве 20 г на 1 л раствора NaCl, наносят 15 мкл
суспензии клеток условно-патогенных микроорганизмов, инкубируют при 37 °С в течение
24 ч и оценивают фибриногенлитическую активность условно-патогенных микроорганизмов по площади зоны лизиса фибриногена.
Использование при приготовлении белок-агаровой пластины фибриногена быка и
пирофосфата натрия позволяет значительно повысить чувствительность способа определения "нейтральной" протеолитической активности клеток условно-патогенных микроорганизмов.
Пример.
Готовят 8 пластин 1 %-ного агара "Difco" на 0,15 M растворе NaCl, pH 7,5, содержащих фибриноген быка в концентрации 2 %.
Пластину № 1 готовят с использованием в качестве растворителя 0,15 M раствора
NaCl, pH 7,5, без добавок (контроль). Остальные пластины готовят с использованием в
качестве растворителя 0,15 M раствора NaCl, pH 7,5, с добавлением пирофосфата натрия в
концентрации (M): пластину № 2 - 10-2; пластину № 3 - 10-3; пластину № 4 - 10; пластину
№ 5 - 10-5; пластину № 6 - 10-6; пластину № 7 - 10-7; пластину № 8 - 10-8. На все пластины
наносят микродозатором по 15 мкл суспензий клеток, выделенных при центрифугировании из суточных бульонных культур 10 различных штаммов условно-патогенных микроорганизмов. Затем инкубируют все фибриноген-агаровые пластины с нанесенными на
поверхность образцами при 37 °С в течение 24 ч.
Затем обрабатывают пластину 2 н раствором трихлоруксусной кислоты и измеряют
площадь зон расщепления фибриногена в мм2. Результаты определения площади зон расщепления фибриногена представлены в таблице.
Из данных таблицы видно, что определение активности "нейтральных" протеиназ клеток условно-патогенных микроорганизмов возможно только в присутствии в реакционной
системе пирофосфата натрия в концентрации 10-6-10-2 M.
2
BY 16958 C1 2013.04.30
Влияние пирофосфата натрия на расщепление фибриногена быка
(мм площади зон лизиса) "нейтральными" фибриногенолитическими протеиназами
клеток различных условно-патогенных микроорганизмов.
Растворитель при приготовлении геля - 0,15 M раствор NaCl, pH 7,5,
(представлены средние значения, n = 4)
2
Исследуемый микроорганизм
контроль
E. coli 25922
28
E. coli К-12
0
Salmonella enteritidis
15
Shigella flexneri
0
Serratia marcescens
66
Proteus vulgaris
42
Proteus mirabilis
0
Staphyl. aureus 25923
0
Staphyl. aureus госпи0
тальный штамм
Концентрация пирофосфата натрия, M
10-2
10-3
10-4
10-5
10-6
10-7
64
72
40
49
42
0
95
72
60
56
49
0
68
72
42
56
64
49
68
64
60
56
36
0
56
110
90
121
138
49
64
49
64
0
0
0
64
49
42
0
0
0
81
60
0
0
25
49
81
46
49
0
0
0
10-8
0
0
56
0
56
0
0
0
0
Источники информации:
1. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж.Хоулта и др. 9-е изд. - М.: Мир. 1997. - Т. 1. - С. 237.
2. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж.Хоулта и др. 9-е изд. - М.: Мир. 1997. - Т. 2. - С. 603.
3. Методы определения протеолитической активности и выделения протеолитических
ферментов. В кн.: "Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов (методы исследования). - Л.: Наука., 1979. - С. 24-33.
4. Билай Т.И. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. - Киев: Науковая
думка, 1985. - С. 55-76.
5. Никандров В.Н., Пыжова Н.С., Шатило Н.Л. Протеолитическая и эндонуклеазная
активность штаммов Corynebacterium diphtheriae при росте на питательных средах сложного состава. I. "Нейтральные" деполимеразы // Роль антропогенных и природных патогенов в формировании инфекционных и неинфекционных болезней человека. Медикоэкологич. аспекты проблемы. Матер. междунар. конфер. - Минск, 2002. - С. 326-342.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
3
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
86 Кб
Теги
by16958, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа