close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17052

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.04.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12N 7/00
C 12Q 1/68
(2006.01)
(2006.01)
СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ШТАММОВ БАКТЕРИОФАГОВ
ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА PSEUDOMONAS
НА ГРУППЫ ПО СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ
ГИПЕРХРОМНОГО ЭФФЕКТА
(21) Номер заявки: a 20101289
(22) 2010.09.01
(43) 2012.04.30
(71) Заявитель: Государственное научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии
наук Беларуси" (BY)
(72) Авторы: Рахуба Денис Викторович;
Новик Галина Ивановна (BY)
(73) Патентообладатель: Государственное
научное учреждение "Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси" (BY)
BY 17052 C1 2013.04.30
BY (11) 17052
(13) C1
(19)
(56) PREVOTS F. et al. Appl Environ
Microbiol. - 1990. - V. 56. - No. 7. P. 2180-2185.
РАХУБА Д.В. и др. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы VI Международной научной
конференции. Т. 1. - Минск, 2008. С. 98-100.
MANILOFF J. et al. Arch Virol. - 1998. V. 143. - No.10. - P. 2051-2063.
FEKETE A. et al. Biophys Struct Mech. 1982. - V. 9. - P. 1-9.
MERGNY J-L. et al. Nucleic Acids Res. 2005 - V. 33. - No.16. - P. e138.
(57)
Способ разделения штаммов бактериофагов фитопатогенных бактерий рода Pseudomonas на группы по степени выраженности гиперхромного эффекта, заключающийся в
том, что регистрируют спектры поглощения суспензий исследуемых штаммов бактериофагов с титром 109-1010 БОЕ/мл, разведенных в 20 раз, до и после их прогревания при
температуре 77 °С в течение одного часа, рассчитывают степень выраженности гиперхромного эффекта для каждого штамма как увеличение оптической плотности суспензии
бактериофагов при 260 нм после прогревания и разделяют штаммы бактериофагов фитопатогенных бактерий рода Pseudomonas на группы с достоверно сходными степенями выраженности гиперхромного эффекта.
Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и сельского хозяйства, в частности к идентификации штаммов бактериофагов, потенциальных объектов новых биотехнологий, и может найти применение в области защиты сельскохозяйственных
растений от фитопатогенных микроорганизмов, а также в работе сервисных микробиологических коллекций.
Бактерии рода Pseudomonas являются возбудителями заболеваний многих культурных
и дикорастущих растений. С почти одинаковыми симптомами они поражают все надземные органы плодовых, зерновых, бахчевых и многих других хозяйственно ценных культур. Достаточно часто бактерии данного рода обладают мощным защитным аппаратом,
BY 17052 C1 2013.04.30
делающим их резистентными к действию многих химических соединений. В связи с этим
бактериофаги являются перспективными агентами в качестве средств борьбы с возбудителями бактериозов культурных растений. Среди основных направлений использования
бактериофагов в практических целях можно выделить:
использование вирусов бактерий для быстрой диагностики заболевания без выделения
возбудителя в чистой культуре;
идентификация возбудителя методом фаготипирования;
использование бактериофагов в качестве профилактического и терапевтического
средства борьбы с бактериозами.
Использование бактериофагов в подобных целях всегда связано с выделением новых
штаммов из природных источников и созданием коллекции вирусов бактерий. В связи с
этим неизменно встает вопрос идентификации новых выделенных фагов, а также разделения фагов на группы внутри коллекций.
Исторически известны две системы классификации вирусов бактерий, основанные на
их морфологии и типе нуклеиновой кислоты. Первая была предложена Bradley, и согласно
ей фаги подразделялись на 6 морфотипов [1]:
A - фаги, состоящие из капсида и длинного отростка, чехол которого способен сокращаться;
B - фаги, состоящие из капсида и длинного отростка, чехол которого не способен сокращаться;
C - фаги, состоящие из капсида и короткого отростка, длина которого не превышает
размер самого капсида;
D - фаги, состоящие из одного нуклеокапсида большого размера, на поверхности которого имеются отросткоподобные, или шиловидные, структуры;
E - фаги, состоящие только из нуклеокапсида;
F - палочковидные, или нитевидные, фаги.
Согласно второй системе, предложенной Тихоненко, бактериофаги разделялись на 5
групп [2]:
фаги нитевидной формы;
фаги с аналогами отростка;
фаги с коротким отростком;
фаги с длинным несокращающимся отростком.
Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен сокращаться [2].
Недостатком данных систем классификации фагов являлась невозможность более глубокой дифференцировки фагов внутри указанных групп, поскольку многие виды и штаммы бактериофагов, обладая одним типом нуклеиновой кислоты и одинаковой
морфологией, были способны инфицировать разных хозяев, а также проявляли различные
свойства (морфология негативных колоний, константа адсорбции, инкубационный период, количество фагов, выходящих из лизированной клетки).
В данный момент общепринятой системой классификации бактериофагов является система ICTV. Данная классификация объединяет бактериофаги в 1 порядок, 13 семейств и
31 род. Семейства различают на основании типа нуклеиновой кислоты и общей морфологии вириона. Для классификации фагов на уровне родов и видов на данный момент используется более 40 критериев [3]. Среди наиболее важных находятся: наличие ДНК или
РНК полимеразы в составе бактериофага, необычные нуклеотиды, последовательность
нуклеотидов, присутствие cos и pac сайтов, образование конкатемеров [4]. Недостатком
данного метода является ограниченная возможность применения его для идентификации
группы фагов, обладающих одинаковой морфологией вириона, типом нуклеиновой кислоты, а также рядом других схожих свойств.
Наиболее близким по достигаемому результату является способ молекулярногенетической идентификации бактериофагов, который основан на анализе структуры ДНК
2
BY 17052 C1 2013.04.30
[5]. Суть данного способа заключается в комплексном использовании методик, направленных на анализ первичной структуры ДНК с последующим сравнением полученных
данных с известными структурами аналогичных бактериофагов, выявлением гомологичных участков и определением степени родства. Однако данный способ имеет ряд недостатков:
неуниверсальность применяемых методик - для разных видов и штаммов бактериофагов могут понадобиться разные методы выделения и исследования нуклеиновой
кислоты;
трудоемкость способа, требование дорогостоящих реактивов и оборудования, специально обученного персонала, а также большого количества времени для анализа структуры ДНК;
отсутствие универсального критерия родства бактериофагов - бактериофаги не имеют
своей рРНК, которая используется в качестве генетического маркера при идентификации
бактерий. Более того, при исследовании геномов бактериофагов, помещенных в библиотеку GenBank, не было найдено ни одного гена, общего для всех бактериофагов, который
мог бы служить в качестве подобного маркера [6];
применение сиквенса бактериофаговых геномов для дифференцировки фагов требует
отказаться от морфологических критериев, заложенных в системе ICTV, что, в свою очередь, представляется нерациональным, поскольку игнорирует тот факт, что все фенотипические проявления бактериофагов являются следствием экспрессии генома.
Задача данного изобретения заключается в разработке нового способа дифференцировки бактериофагов на группы. К описываемому способу предъявлялись следующие требования:
быстрота выполнения - способ не должен занимать большое количество времени;
общедоступность - способ не должен требовать специальной квалификации персонала, все работы должны выполняться в рамках рутинных лабораторных методик;
дешевизна - способ не должен требовать дорогостоящих реактивов и оборудования.
Поставленная задача решается за счет использования фазовых переходов, происходящих внутри капсида бактериофага при повышенной температуре в качестве критерия, по
которому можно судить о надмолекулярной организации вируса.
Нуклеопротеины бактериофагов могут рассматриваться как жидкий кристалл [7]. Поэтому их фазовые переходы при повышенной температуре, которые регистрируются фотометрически, могут содержать в себе информацию о надмолекулярной организации
вириона и взаимодействиях белок - нуклеиновая кислота [8]. Так, кривая плавления нуклеопротеида бактериофага, регистрируемая при 260 нм, имеет два участка изменения оптической плотности. Один из них находится в области температур выше 70 °С, в котором
наблюдается т.н. гиперхромный эффект, связанный с плавлением ДНК. Второй участок
находится в интервале температур 40-65 °С. В данном диапазоне наблюдается гипохромный эффект, который по данным разных авторов может быть связан со структурными изменениями нуклеиновой кислоты в связи с ее высвобождением из капсида, а также с
уменьшением диаметра и рефрактивного индекса вирусных частиц в результате разрушения протеиновой оболочки [8-10].
Известно, что ДНК и РНК могут принимать ряд различных конформаций. Может как
меняться ориентация цепей нуклеиновой кислоты в спирали, так и нарушаться сама спиральность [11-12]. Помимо этого спиралевидная структура ДНК может состоять из трех
или четырех цепочек [13-18]. Нагревание нуклеиновой кислоты ведет к изменению спектральных характеристик в ультрафиолетовой области, которые коррелируют с конфирмационными изменениями ДНК [19]. Поэтому регистрация и анализ спектров бактериофагов
до и после прогревания позволяет выявить закономерности в изменении поглощения под
действием температуры и на их основании провести дифференцировку фагов на подгруппы.
Описываемый метод представляет собой экспериментально найденную строгую последовательность операций, объединенных в три этапа.
3
BY 17052 C1 2013.04.30
1. Очистка и концентрирование бактериофагов. На данном этапе фаголизата готовят
концентрированную суспензию вирусов с максимально достижимым титром фагов.
Обычно титр фагов в подобных случаях достигает 109-1010 БОЕ/мл. Очищенную суспензию фагов разводят в 20 раз в 1SSC буфере (0,15 М NaCl, 0,015 М цитрат натрия). Подбор
нужного разведения бактериофагов чрезвычайно важен, поскольку при слишком маленькой концентрации вирусов невозможно будет оценить степень гиперхромного эффекта.
Слишком высокая концентрация фаговых частиц приведет к слишком интенсивному сигналу, который будет невозможно зарегистрировать из-за технических ограничений аппаратуры.
2. Термообработка и регистрация спектров. Термообработку фагов проводят на водяной бане при 77 °С в течение 1 ч. После термообработки исследуют спектральные характеристики бактериофагов в ультрафиолетовом диапазоне, регистрируя оптическую
плотность при 260 нм. Полученные спектры поглощения сравнивают со спектром поглощения нативного фага, отмечая разность оптической плотности при 260 нм. Таким образом исследуется группа из 24 штаммов бактериофагов фитопатогенных псевдомонад. Для
каждого из штаммов бактериофагов определяется разность оптической плотности, регистрируемой при 260 нм, выражаемая в относительных единицах.
3. Объединение бактериофагов в группы и статистический анализ данных. Полученный массив данных разбивается на группы близких по значению изменений поглощения,
проводится статистическая обработка данных методом однофакторного дисперсионного
анализа, направленная на определение достоверности различий между группами.
Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами.
Пример 1.
Общий вид спектра поглощения суспензии бактериофагов.
Поскольку температура плавления ДНК для всех исследуемых фагов находится в интервале 76-79 °С, термообработка проводилась при температуре 77 °С. При исследовании
спектральных характеристик было обнаружено два пика поглощения: при 230 и 260 нм.
Данные пики соответствовали поглощению нуклеиновых кислот и белков капсида фагов.
Прогревание в течение часа приводило к выраженному гиперхромному эффекту (фиг. 1),
что свидетельствовало о конформационных изменениях молекулы ДНК, вызванных действием температуры. Подобные изменения поглощения ультрафиолетового света регистрировались для всех 24 изучаемых штаммов бактериофагов.
Пример 2.
Регистрация изменения поглощения при 260 нм для коллекции бактериофагов фитопатогенных псевдомонад.
При анализе изменений спектральных характеристик 24 штаммов бактериофагов фитопатогенных псевдомонад после прогревания было обнаружено, что разные штаммы вирусов демонстрировали различную степень выраженности гиперхромного эффекта.
Данные об изменении поглощения для каждого штамма бактериофагов представлены в
табл. 1.
Таблица 1
Вариант опыта
Поглощение
Номер фага
Время экспозиции
ОП при 260 нм
Увеличение ОП, %
0 мин (контроль)
0,08
1
3,7
60 мин
0,083
0 мин (контроль)
0,32
2
14,1
60 мин
0,365
0 мин (контроль)
0,308
3
16,9
60 мин
0,36
0 мин (контроль)
0,267
4
14,2
60 мин
0,305
4
BY 17052 C1 2013.04.30
Продолжение таблицы 1
Поглощение
ОП при 260 нм
Увеличение ОП, %
0,435
11,3
0,484
0,1
6
0,106
0,134
28,6
0,172
0,183
14,7
0,21
0,137
29,2
0,177
0,114
28,97
0,147
0,143
27,9
0,183
0,066
27,3
0,084
0,128
29,7
0,166
0,073
6,8
0,078
0,137
22,6
0,168
0,092
13,04
0,104
0,094
9,6
0,103
0,161
37,9
0,222
0,158
41,1
0,223
0,153
14,4
0,175
0,111
28,8
0,143
0,101
32,7
0,134
0,124
26,6
0,157
0,204
30,4
0,266
Вариант опыта
Номер фага
Время экспозиции
0 мин (контроль)
5
60 мин
0 мин (контроль)
6
60 мин
0 мин (контроль)
7
60 мин
0 мин (контроль)
8
60 мин
0 мин (контроль)
9
60 мин
0 мин (контроль)
10
60 мин
0 мин (контроль)
11
60 мин
0 мин (контроль)
12
60 мин
0 мин (контроль)
13
60 мин
0 мин (контроль)
14
60 мин
0 мин (контроль)
15
60 мин
0 мин (контроль)
16
60 мин
0 мин (контроль)
17
60 мин
0 мин (контроль)
18
60 мин
0 мин (контроль)
19
60 мин
0 мин (контроль)
20
60 мин
0 мин (контроль)
21
60 мин
0 мин (контроль)
22
60 мин
0 мин (контроль)
23
60 мин
0 мин (контроль)
24
60 мин
Пример 3.
Объединение фагов в группы со сходными значениями увеличения поглощения.
На основании выявленных различий в изменении поглощения вирусы были объединены в пять групп, в которые вошли фаги со сходными уровнями увеличения поглощения. В
табл. 2 и на фиг. 2 представлены данные о составе выделенных групп и их основные статистические показатели (стандартное отклонение, дисперсия).
5
BY 17052 C1 2013.04.30
Группа
Фаги, входящие в состав группы
Таблица 2
Показатель увеличения абсорбции света,
среднее для группы, %
5,43
13,52
28,99
39,51
-
1
1, 6, 14
2
2, 3, 4, 5, 8, 16, 17, 20
3
7, 9, 10, 11, 12, 13, 21, 22, 23, 24
4
18, 19
5
15
Пример 4.
Однофакторный дисперсионный анализ.
Статистический анализ достоверности различий между выделенными группами бактериофагов проводился с использованием метода однофакторного дисперсионного анализа. На первом этапе была выполнена оценка достоверности различия между средними
значениями приращения поглощения для выделенных групп бактериофагов на основании
сравнения вычисляемых значений величины F (критерий Фишера) с F-критическим (квантиль распределения Фишера). Поскольку различие между средними значениями групп
оказалось статистически значимым, то на следующем этапе требовалось выяснить, для
каких именно групп различия между средними значениями статистически значимы. Для
этого был выполнен анализ на основе наименьшей существенной разности (НСР). Для
каждой пары групп были вычислены разность средних значений приращения, статистическая ошибка разности средних (Sd) и значение НСР. Анализ результатов посредством
сравнения значений Sd и НСР показал значимые различия между всеми выделенными
группами бактериофагов. Результаты однофакторного статистического анализа представлены в табл. 3.
Таблица 3
Группы
Счет
Сумма
Среднее
Дисперсия
1
3
316,3
105,4333333
3,130833333
2
8
908,17
113,52125
5,039755357
3
10
1289,91
128,991
2,902876667
4
2
279,03
139,515
5,28125
5
1
122,63
Дисперсионный анализ
Источник вариаSS
df
MS
F
F критическое
ции
Между группами 2495,205039
4
623,8012598
162,4769852
2,895107308
Внутри групп
72,94709417
19
3,839320746
Итого
2568,152133
23
Определение достоверности различий между группами
Квантиль стьюдента t0,05;19
2,093024
Группы
Разность средних
Sd
HCP
1-2
-8,088
1,33
2,78
1-3
-23,558
1,29
2,70
1-4
-34,082
1,79
3,74
2-3
-15,47
0,93
1,94
2-4
-25,994
1,55
3,24
3-4
-10,524
1,52
3,18
Согласно полученным результатам, предложенный метод разделения фагов псевдомонад на группы превосходит предложенный ранее.
Преимущества предлагаемого метода заключаются в следующем:
простота и доступность;
6
BY 17052 C1 2013.04.30
не требует дорогостоящих реактивов и оборудования;
все манипуляции являются рутинными методиками и не требуют специальной квалификации персонала;
низкие временные затраты - анализ может быть выполнен в течение суток.
Источники информации:
1. Bradley D.E. Ultrastructure of bacteriophages and bacteriocins//Bacteriol. Rev. - 1967. Vol. 31. - P. 230-314.
2. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. - M.: Наука, 1969. 258 с.
3. Ackerman H.W. Bacteriophage classification//Bacteriophages. Biology and application/E.Kutter, A.Sulakvelidze. - CRC Press, 2004. - P. 81-122.
4. Maniloff J., Ackermann H.-W. Taxonomy of bacterial viruses: Establishment of tailed virus genera and the order Caudovirales//Arch. Virol. - 1998. - Vol.143. - P. 2051-2063.
5. Prevots F., Mata M., Ritzenthaler P. Taxonomic differentiation of 101 lactococcal bacteriophages and characterization of bacteriophages with unusually large genomes//Appl. Environ.Microbiol. - 1990. - No. 56. - P. 2180-2185 (прототип).
6. Rohwer F., Edwards R. The phage proteomic tree: a genome-based taxonomy for phages
//J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, P. - 4529-4535.
7. Sipski M.L., Wagner L.T. Probing DNA quaternary ordering with circular dichroism
spectroscopy: studies of equine sperm chromosomal fibers//Biopolymers. - 1977. - Vol.16. - P.
573-582.
8. Fekete A. et al. Temperature dependent structural changes of intraphage T7
DNA//Biophys. struct. mech. - 1982. - Vol.9. - P. 1-9.
9. Permogorov V.J. et al. Scattering contribution to the optical density during melting of T7
and Sd phages//Molekul. Biol. - 1977. - Vol. 11. - P. 134-138.
10. Toth K., Fekete A. Effect of microenvironment on the structure of bacteriophage solution
(light scattering studies)//Acta Biochim. Acad. Sci. Hung. - 1980. - Vol.15. - P. 130.
11. Rich A., Zhang S.G. Z-DNA: the long road to biological function//Nature Rev. Genet. 2003. - Vol. 4. - P. 566-572.
12. Sarma R.H., Sarma M.H. Parallel stranded DNA/T.M. Jovin//Structure & Methods,
DNA & RNA. - Vol 3. - Adenine Press, Schenectady - New York. - 1990. - P. 155-174.
13. Moser H.E., Dervan P.B. Sequence specific cleavage of double helical DNA by triple helix formation //Science. - 1987. - Vol .238. - P. 645-650.
14. Le Doan T. et al. Sequence specific recognition, photocrosslinking and cleavage of the
DNA double helix by an oligo thymidylate covalently linked to an azidoproflavine derivative//Nucleic Acids Res. - 1987. - Vol. 15. - P. 7749-7760.
15. Parkinson G.N., Lee M.P.H., Neidle S. Crystal structure of parallel quadraplexes from
human telomeric DNA //Nature. - 2002. - Vol. 417. - P. 876-880.
16. Webba da Silva M. Associationof DNA quadruplexes through G:C:G:C tetrads. Solution
structure of d(GCGGTGGAT)//Biochemistry. - 2003. - Vol. 42. - P. 14356-14365.
17. Webba da Silva M. Experimental demonstration of T(GGGG)T hexad and ТAAT tetrad
alignment within a DNA quadruplex system//Biochemistry. - 2005. - Vol. 44. - P. 3754-3764.
18. Burge S. et al. Quadruplex DNA: sequence, topology and structure//Nucleic Acids Res. 2006. - Vol. 34. - P. 5402-5415.
19. Mergny J.-L. et al. Thermal difference spectra: a specific signature for nucleic acid structures//Nucleic Acids Res. - 2005. - Vol. 33. - P. 138.
7
BY 17052 C1 2013.04.30
Фиг. 1
Фиг. 2
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
182 Кб
Теги
by17052, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа