close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17118

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.06.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
A 61K 39/245
C 12N 15/01
(2006.01)
(2006.01)
МАРКИРОВАННЫЙ ШТАММ ВИРУСА БОЛЕЗНИ АУЕСКИ
"SUID HERPESVIRUS" - КМИЭВ-V 106 А - ШТАММ-АНТИГЕН,
ВАКЦИНА ЭМУЛЬСИОННАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ НА ЕГО
ОСНОВЕ ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ СВИНЕЙ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ
АУЕСКИ И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ
(21) Номер заявки: a 20101049
(22) 2010.07.08
(43) 2012.02.28
(71) Заявитель: Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное
предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
(72) Авторы: Гусев Анатолий Алексеевич; Чаплыго Кристина Эдуардовна
(BY)
(73) Патентообладатель:
Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" (BY)
BY 17118 C1 2013.06.30
BY (11) 17118
(13) C1
(19)
(56) ГУСЕВА М.Н. Разработка технологии
изготовления инактивированной вакцины против болезни Ауески из штамма, делеционного по гликопротеину
Е: Автореф. дис. - Владимир, 1999. С. 1-21.
ВЕРОСОЦКАЯ М. и др. Молодежь,
наука и аграрное образование. Материалы научно-практической конференции, посвященной 70-летию образования Витебской области. - Витебск:
ВГАВМ, 2008. - С. 20-22.
ГУСЕВ А.А. и др. Материалы конференции "Современные технологии
сельскохозяйственного производства".
XI Международная научно-практическая конференция. - Гродно, 2008. С. 243-244.
ЧАПЛЫГО К.Э. и др. Ученые записки учреждения образования "Витебская ордена "Знак Почета" государственная академия ветеринарной
медицины", 2009. - Т. 45. - Вып. 2. Ч. 1. - С. 107-107.
ЕРОХОВЕЦ Н.Ф. и др. Ученые записки учреждения образования "Витебская ордена "Знак Почета" государственная академия ветеринарной
медицины", 2009. - Т. 45 - Вып. 2. Ч. 1. - С. 241-243.
(57)
1. Маркированный штамм вируса болезни Ауески "Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A штамм-антиген.
2. Вакцина эмульсионная инактивированная для иммунизации свиней против болезни
Ауески, отличающаяся тем, что содержит 40-60 мас. % вируссодержащей жидкости с
маркированным штаммом "Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A, титр инфекционной активности которого составляет 7,0-9,0 lg ТЦД50/мл, и теотропином в концентрации 0,05-0,5 %,
а также 60-40 мас. % масляного адъюванта Montanide ISA 206, при этом вируссодержащая
BY 17118 C1 2013.06.30
жидкость с указанным штаммом получена при его выращивании в культуре клеток ВНК21(с-13) в среде ФГМ-С/ДМЕМ.
3. Способ изготовления вакцины эмульсионной инактивированной для иммунизации
свиней против болезни Ауески, отличающийся тем, что выращивают культуру клеток
ВНК-21(с-13) суспензионным методом в питательной среде ФГМ-С/ДМЕМ до концентрации
0,8-2,5 млн/мл, заражают маркированным штаммом "Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A в
количестве 0,01-1,0 ТЦД50/кл, культивируют при pH 6,8-7,6 при температуре 37 °С в течение 18-36 ч, собирают вируссодержащую жидкость, замораживают при температуре от -20
до -40 °С в течение 16-18 ч, оттаивают при комнатной температуре, инактивируют в течение 18-30 ч при температуре 20-37 °С при значении pH 7,2-8,6 путем внесения тетропина
до концентрации 0,05-0,5 % и диспергируют с масляным адъювантом Montanide ISA 206,
взятым из расчета на 40-60 мас. % инактивированной теотропином вируссодержащей
жидкости 60-40 мас. % масляного адъюванта Montanide ISA 206.
Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и может быть использовано в биоехнологической промышленности при изготовлении вакцины против болезни
Ауески свиней.
При производстве биопрепаратов для специфической профилактики болезни Ауески
свиней, с целью возможности проведения серологического скрининга вакцинированных и
инфицированных животных, используют генетически измененные (маркированные)
штаммы вируса.
Известен маркированный штамм вируса болезни Ауески "Bartha K-61".
Маркированный штамм вируса болезни Ауески "Bartha K-61" является генетическим
мутантом, имеющим делецию гликопротеина E в геноме вируса. Культивирование штамма осуществляется суспензионным методом в перевиваемой культуре клеток почки новорожденного сибирского хомячка ВНК-21 на питательной среде Glasgow (GIBCO, Paisley,
Scotland) с добавлением 5 % эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота. Накопление штамма с титром инфекционной активности 7 lg ТЦД50/мл происходит в течение
144 ч при множественности заражения 0,01 ТЦД50/кл и исходной концентрации клеток
1,82 млн. кл/мл [1].
Данный штамм обладает недостатками, характеризующимися тем, что имеет большой
цикл репродукции в культуре клеток ВНК-21, составляющий 144 ч, что с учетом того, что
накопление биомассы осуществляется в биореакторе, ведет к энергоемким затратам, при
этом для культивирования данного штамма применяются дорогостоящая синтетическая
питательная среда и эмбриональная сыворотка крупного рогатого скота. Титр инфекционной активности вируса составляет 7,0 lg ТЦД50/мл, что не позволяет изготовить заявляемую высокоиммуногенную вакцину.
Известен маркированный штамм вируса болезни Ауески "ВК".
Маркированный штамм вируса болезни Ауески "ВК" является генетическим мутантом, имеющим делецию гликопротеина E в геноме вируса. Культивирование штамма
осуществляется в монослое перевиваемой культуры клеток почки новорожденного сибирского хомячка ВНК-21 на питательной среде ПСП с добавлением 2 % сыворотки крупного
рогатого скота. Накопление штамма с титром инфекционной активности 7,47-7,5 lg ТЦД50/мл
происходит в течение 3-х суток при множественности заражения 0,01 ТЦД50/кл на 100 %
монослой 2-3 суточной культуры клеток ВНК-21, выращенной в клинском матрасе [2].
Данный штамм обладает недостатками, характеризующимися тем, что накопление вируса
осуществляется стационарным способом - в монослое культуры клеток ВНК-21. Использование данного способа культивирования вируса требует больших трудозатрат и является нецелесообразным при промышленном производстве биопрепаратов. Вирус накапливается в титре
7,47-7,5 lg ТЦД50/мл, что не позволяет изготовить заявляемую высокоиммуногенную вакцину.
На известных штаммах получить заявляемую вакцину против болезни Ауески невозможно, так как известные штаммы имеют низкий титр инфекционной активности 7,0-7,5 lg
2
BY 17118 C1 2013.06.30
ТЦД50/мл. Кроме того, методы их культивирования либо являются дорогостоящими, либо
не позволяют масштабировать производство вакцины в силу их низкой эффективности и
нерентабельности.
В современной ветеринарной практике известен ряд маркированных инактивированных вакцин для специфической профилактики болезни Ауески свиней.
Известна инактивированная вакцина против болезни Ауески "Porcilis Aujeszky (inac DF)",
приготовленная на основе маркированного по гликопротеину E штамма вируса болезни
Ауески "Phylaxia", инактивированного формалином, смешаного с адъювантом - синтетическим аналогом витамина E в модификации. Вакцина изготавливается в виде водной
суспензии для инъекции [3].
Недостатками вышеуказанной вакцины является то, что в качестве инактиванта применяют формалин, который обладает высокой токсичностью, реактогенностью и иммунодепрессией. Другим недостатком данной вакцины является использование в качестве
адъюванта синтетического аналога витамина Е, формирующего водную суспензию, аналогичную по механизму действию эмульсии прямого типа, что не позволяет сформировать у животных выработку напряженного гуморального иммунитета при однократной
иммунизации и ведет к необходимости проведения повторных вакцинаций.
Известна эмульсионная инактивированная вакцина против болезни Ауески, приготовленная на основе маркированного по гликопротеину E штамма вируса болезни Ауески
"ВК", инактивированного димером этиленимина, смешаного с масляным адъювантом.
Вакцина изготавливается в виде эмульсии обратного типа [4].
Недостатками вышеуказанной вакцины является то, что в качестве инактиванта применяют димер этиленэмина, который обладает очень высокой токсичностью и канцерогенностью, вследствие чего возникает необходимость соблюдения мер безопасности при
работе с данным химическим веществом, а также введение в рецептуру вакцины дополнительных нейтрализующих компонентов.
Иммунитет, выработавшийся при однократной иммунизации свиней, способен обеспечить защиту от заражения эпизоотическим штаммом вируса у 40 % подопытных животных, и только проведение повторной иммунизации способствует 100 % защите, что в свою
очередь указывает на невысокую иммуногенную активность данной вакцины.
Известные способы изготовления вакцины не позволяют получить заявляемую вакцину ввиду того, что в известных способах используются слабоиммуногенные штаммы, которые не обеспечивают выработку антител заданного уровня. Кроме того, применяемые
методы инактивации являются не безопасными как для персонала, так и для самой конечной продукции при несоблюдении соответствующих мер безопасности.
Так, известен способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против
болезни Ауески, включающий выращивание культуры клеток ВНК-21 суспензионным методом в питательной среде на растворе Хенкса или Эрла с сывороткой крупного рогатого
скота, заражение ее маркированным по гликопротеину Е штаммом вируса болезни Ауески
"ВК" в дозе 0,001-1,0 ТЦД50/кл, культивирование в течение 24-72 ч при температуре 37 °С
при pH 6,8-7,6 до появления 70-90 % погибших клеток в суспензии, инактивацию димером
этиленимина в конечной концентрации 0,05-0,5 % при экспозиции 12-48 ч, диспергирование в
масляном адъюванте в соотношении 1:1 по массе до образования эмульсии обратного типа [5].
Этот способ обладает недостатком, заключающимся в том, что для инактивации вируса
применяют димер этиленимина, который является токсичным веществом, поэтому для нейтрализации необходимо дополнительное применение тиосульфата натрия. Вакцину готовят
с использованием адъюванта, дающую формирование эмульсии обратного типа, применение
которой, в свою очередь, способствует формированию у иммунизированных животных защитных титров вируснейтрализующих антител как минимум только к 21 дню после вакцинации.
Задачей предлагаемого изобретения является получение высокоиммуногенного штамма, на основе которого будет сконструирована высокоиммуногенная вакцина и разработан
способ ее изготовления.
3
BY 17118 C1 2013.06.30
Поставленная задача достигается тем, что вакцина эмульсионная инактивированная
для иммунизации свиней против болезни Ауески содержит 40-60 мас. % вируссодержащей
жидкости с маркированным штаммом "Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A, титр инфекционной активности которого оставляет 7,0-9,0 lg ТЦД50/мл, и теотропином в концентрации 0,05-0,5 %, а также 60-40 мас. % масляного адъюванта Montanide ISA 206, при этом
вируссодержащая жидкость с указанным штаммом получена при его выращивании в
культуре клеток ВНК-21(с-13) в среде ФГМ-С/ДМЕМ.
Кроме того, поставленная задача достигается тем, что в способе изготовления вакцины эмульсионной инактивированной для иммунизации свиней против болезни Ауески,
выращивают культуру клеток ВНК-21(с-13) суспензионным методом в питательной среде
ФГМ-С/ДМЕМ до концентрации 0,8-2,5 млн/мл, заражают маркированным штаммом
"Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A в количестве 0,01-1,0 ТЦД50/кл, культивируют при
pH 6,8-7,6 при температуре 37 °С в течение 18-36 ч, собирают вируссодержащую жидкость, замораживают при температуре от - 20 до - 40 °С в течение 16-18 ч, оттаивают при
комнатной температуре, инактивируют в течение 18-30 ч при температуре 20-37 °С при
значении pH 7,2-8,6 путем внесения теотропина до концентрации 0,05-0,5 % и диспергируют с масляным адъювантом Montanide ISA 206, взятым из расчета на 40-60 мас. % инактивированной теотропином вируссодержащей жидкости 60-40 мас. % масляного адъюванта Montanide ISA 206.
Таким образом, использование заявляемого штамма вируса болезни Ауески "Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A, обладающего высоким титром инфекционной активности,
при конструировании вакцины, а также способ ее изготовления, включающий применение
в качестве инактиванта теотропина и эмульгирование с адъювантом ISA 206, позволяющим получить эмульсию сложного типа, которая способствует выработке противовирусных антител в высоких титрах уже к 12 дню после вакцинации, позволяет изготовить
высокоиммуногенную вакцину.
Характеристика штамма "Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A:
Таксономическая принадлежность. Вирус относится к семейству Herpesviridae, подсемейству Alphaherpesvirinae, роду Poikilovirus, виду Suid herpesvirus.
Культурально-морфологические признаки. ДНК-содержащий вирус, экосаидрической
формы, диаметр - 150 нм, плавучая плотность в градиенте хлористого цезия 1,27-1,29 г/мл.
Культивируется в перививаемой культуре клеток ВНК-21. Вызывает цитопатический эффект
в виде округления отдельных клеток с последующим разрушением монослоя и его отторжением. Инфекционный титр вируса на культуре клеток ВНК-21 составляет 7,0-9,0 ТЦД50/мл.
Физико-биохимические свойства. Вирус чувствителен к эфиру, хлороформу, формальдегиду, гидроокиси натрия, воздействию УФ-лучей, температура от + 4 до - 30 °С
способствует инактивации вируса со снижением титра инфекционной активности в десятки раз в течение 2 недель. Вирус устойчив к широким колебаниям pH (5-9), нагреванию.
Онкогенность. Вирус не является онкогенным.
Данные о контаминации. Свободен от вирусных и бактериальных контаминантов.
Биотехнологическая характеристика. Штамм размножается в перевиваемой культуре
клеток ВНК-21, со средним значением титра инфекционной активности 7,0-9,0 lg ТЦД50/мл
при соблюдении следующих параметров: множественность заражения 0,01-1,0 ТЦД50/кл,
питательная среда - ФГМ-С/ДМЭМ в эффективном соотношении с добавлением сыворотки крови крупного рогатого скота, температурный режим - 37 °С, pH 6,8-7,6 время культивирования 18-36 ч.
Стабильность. Штамм сохраняет свои исходные характеристики при последовательном пассировании в культуре клеток в течение 9-10 пассажей (срок наблюдения).
Антигенные свойства. При парентеральном введении инактивированного материала
вызывает образование вируснейтрализующих, преципитирующих, комплементсвязывающих антител у животных.
4
BY 17118 C1 2013.06.30
Иммуногенность. При вакцинации свиней инактивированной вакциной на основе
штамма КМИЭВ-V 106 A титр вируснейтрализующих антител в реакции нейтрализации
составил в среднем 2,6-3,4 log2.
Маркерные признаки. Штамм имеет делецию гена, отвечающего за синтез гликопротеина E.
Патогенность. Патогенен для лабораторных животных (кроликов, морских свинок).
Вирулентность. Вирулентен для лабораторных животных (кроликов - при внутримышечном заражении в дозе 100 ЛД50/мл, морских свинок - при подкожном заражении в дозе
10 ЛД50/мл).
Сведения о криоконсервации. Штамм вируса хранят при минус 40 °С после лиофильного высушивания в сахарозо-желатиновой среде в течение 4 лет или в нативном состоянии в защитной среде (ФГМС /ДМЕМ с 5 % ДМСО) в течение 3 лет при минус 86 °С.
Жизнеспособность штамма поддерживают путем проведения пассажа на чувствительных биологических объектах.
Пример 1.
Пример селекционирования маркированного штамма вируса болезни Ауески "Suid
herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A.
Штамм КМИЭВ-V 106 A, делеционный мутант по гликопротеину Е вируса болезни
Ауески, получен пассированием и адаптацией к культуре клеток ВНК-21 вируса, выделенного из органов 2-месячного поросенка.
С целью выделения вируса из патологического материала, полученного от павшего
поросенка, была использована культура клеток ВНК-21.
Для этого из стерильно отобранных кусочков головного мозга и миндалин была приготовлена 10 %-ная суспензия на забуференном физиологическом растворе. Суспензию отцентрифугировали на центригуге в течение 30 мин при 2000 тыс. об/мин, с помощью пипетки
отобрали надосадочную жидкость во флакон, добавили антибиотики и выдержали в термостате в течение 1 ч при температуре 31 °С, затем использовали для заражения культуры клеток.
Заражение перевиваемой культуры клеток ВНК-21 проводили на сформировавшийся
монослой 1-2-дневной культуры. Ростовую среду сливали, монослой 2-кратно отмывали
раствором Хенкса.
Вируссодержащую жидкость инакулировали на монослой и инкубировали при температуре 37 °С в течение 60 мин. Инокулят сливали, монослой клеток промывали раствором
Хенкса и вносили поддерживающую среду, состоящую из смеси ФГМ/ДМЭМ в эффективном соотношении с добавлением 2-5 % инактивированной сыворотки крови крупного
рогатого скота, гентамицина из расчета 50 мг/мл. Инкубирование проводили при 37 °С в
течение 1-5 дней, ежедневно осуществляли микроскопию монослоя клеток с целью обнаружения цитопатического действия (ЦПД) вируса на клетки. Выраженное ЦПД проявилось на 4-м слепом пассаже в виде образования скоплений двоякопреломляющих клеток с
последующим полным отслоением монослоя.
Полученный вирус был проверен методом полимеразой цепной реакции на идентификацию и методом иммуноферментного анализа на наличие маркерных признаков. Также
были определены: инфекционная активность в культуре клеток ВНК-21, патогенность для
лабораторных животных, антигенная и иммуногенная активность.
Штамм вируса депонирован в коллекцию микроорганизмов РУП "Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского" под регистрационным названием КМИЭВ-V 106 A, штамм-антиген.
Пример 2.
Определение титра инфекционной активности маркированного штамма вируса болезни Ауески "Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A.
Для титрования вируса использовали культуру клеток ВНК-21, выращенную в пробирках, с хорошо сформировавшимся монослоем. Перед титрованием производили просмотр культур под микроскопом и их отбор.
5
BY 17118 C1 2013.06.30
Для титрования вируса готовили 10-кратные разведения вируссодержащей суспензии
на питательной среде ФГМ-С/ДМЕМ без добавления сыворотки крупного рогатого скота.
Для получения разведения 1:10 брали 0,5 мл исходного вируса и 4,5 мл питательной среды
или 0,1 мл вируса и 0,9 мл питательной среды. Затем из разведения 1:10 таким же образом
готовили разведение 1:100 и т.д. Приготовление каждого разведения вируса производили
отдельной пипеткой.
На каждое разведение вируса использовали по 4 пробирки с культурой клеток. Предварительно из отобранных пробирок сливали старую ростовую среду. В 4 пробирки вносится по
1 мл соответствующего разведения. Пробирки складывали в специальные кюветы и помещали
в термостат. Одновременно ставили контроль на культуре клеток с поддерживающей средой.
На вторые сутки проводили первый учет результатов титрования. Каждую пробирку
просматривали под малым увеличением (7 × 10) микроскопа и определяют цитопатическое действие вируса (условно в крестах). Пробирки с явным поражением клеточного монослоя складывали отдельно, остальные пробирки вновь помещали в термостат при 37 °С.
Окончательный учет результатов производили через 120 ч после заражения культуры.
Одновременно просматривали и контрольные пробирки. Результаты титрования считали
достоверными при сохранении интактного монослоя в контроле.
Титр инфекционной активности вируса вычисляется по статистической формуле Рида
и Меньча в модификации Ашмарина, выражается в ТЦД50/мл.
Пример 3.
Определение патогенности маркированного штамма вируса болезни Ауески "Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A для лабораторных животных.
Проверку патогенных свойств штамма проводили на 36 морских свинках живой массой 300 г. В опыте использовали вируссодержащую жидкость с титром инфекционной активности 7,5 lg ЛД50/см3. Для заражения морских свинок готовили последовательные
разведения вируса от 10-1 до 10-9 на растворе Хенкса. Каждое разведение вируса вводили
морским свинкам подкожно в области холки в дозе 1 см3.
За зараженными животными вели наблюдение в течение 14 дней. Все морские свинки,
которым вводили вирус в разведении 10-1-10-4, и две морские свинки, которым ввели вирус в разведении в 10-5, пали на 3-5 сутки. Остальные животные остались клинически здоровыми в течение срока наблюдения.
Таким образом, инфекционная активность вируса болезни Ауески штамма "Suid herpesvirus" для морских свинок составила 5,0 lg ЛКД50/мл.
Пример 4.
Определение контаминации бактериями и грибами вируссодержащего материала.
Сущность метода. Выделение микроорганизмов путем инкубирования питательной
среды, в которую внесена вирусная суспензия.
Питательные среды должны обеспечивать рост и развитие определенных микроорганизмов. Готовить питательные среды следует, строго придерживаясь приведенной рецептуры. Компоненты питательных сред должны соответствовать ГФХ1, вып. 2.
Состав и приготовление питательных сред.
Среда № 1 - для выращивания бактерий:
пептона ферментативного сухого ГОСТ 13805;
10 г
натрия хлорида ГОСТ 4233;
5г
глюкозы ГОСТ 975;
1г
агара микробиологического ГОСТ 17206;
13 г
мясной воды (1:2) ГФ 11, вып. 2.
1000 мл
pH после стерилизации
7,3 ± 0,2.
К мясной воде прибавляют пептон и натрия хлорид, растворяют при нагревании, вносят глюкозу, устанавливают pH, кипятят в течение 1 мин, прибавляют замоченный заранее
агар, нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр.
Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре 121 °С в течение 15 мин.
6
BY 17118 C1 2013.06.30
Среда № 2 - для выращивания грибов (Сабуро):
пептона ферментативного сухого
10 г
глюкозы
40 г
агара микробиологического
13 г
мясной воды (1:2)
1000 мл
pH после стерилизации
5,6 ± 0,2.
Все ингредиенты растворяют в мясной воде, прибавляют замоченный заранее агар,
нагревают до полного его расплавления, фильтруют через ватно-марлевый фильтр. Стерилизуют в паровом стерилизаторе насыщенным паром под давлением при температуре
121 °С в течение 15 мин. Для подавления роста бактерий после стерилизации насыщенным паром под давлением прибавляют 100 мг бензилпенициллина и 100 мг тетрациклина
(либо перед стерилизацией насыщенным паром под давлением - 50 мг левомицетина) на
1000 мл среды.
Проведение испытания. Для проверки вируссодержащего материала на контаминацию
бактериями и грибами проводят высевы на питательные среды ГФ XI, вып. 2, с. 196-197.
Испытание проводят двухслойным агаровым методом в чашках Петри диаметром
90-100 мм. Посевы просматривают ежедневно.
Определение общего числа бактерий. Вирусную суспензию вносят в объеме 1 мл в
каждую из двух пробирок с 4 мл расплавленной и охлажденной до температуры от 45 до
50 °С среды № 1. Быстро перемешивают содержимое пробирки и переносят в чашку Петри, содержащую 15-20 мл застывшей питательной среды № 1. Быстрым покачиванием
чашки Петри равномерно распределяют верхний слой агара. После застывания среды
чашки переворачивают и инкубируют в течение 5 сут. при температуре от 30 до 35 °С. Через 48 ч и окончательно через 5 сут. подсчитывают число бактериальных колоний на двух
чашках, находят среднее значение числа бактерий в 1,0 мл вируссодержащего материала.
Определение общего числа грибов. Испытание проводят двуслойным агаровым методом, описанным выше, используя среду № 2. Посевы инкубируют в течение 5 сут. при
температуре от 20 до 25 °С. Через 72 ч и окончательно через 5 сут. подсчитывают общее
число колоний дрожжевых и плесневых грибов на двух чашках, находят среднее значение
числа грибов в 1,0 мл вируссодержащего материала.
Пример 5.
Способ изготовления эмульсионной инактивированной вакцины против болезни Ауески свиней на основе маркированного штамма "Suid herpesvirus" – КМИЭВ-V 106 A.
Получение вируса для изготовления вакцины. При изготовлении производственных
серий вакцины исходят из расчета, что каждая серия составляет 25-50 тысяч иммунизирующих доз. Для этого необходимо получить 10-20 роллеров с культурой клеток ВНК21(с-13) объемом 2,0 литра, для накопления исходной расплодки клеток ВНК-21(с-13) для
последующего суспензионного культивирования в биореакторе.
Примерный расчет потребности компонентов для изготовления 25 тыс. доз или 50 л.
вакцины:
раствор трипсина
2,0 л
питательная среда ФГМ-С/ДМЕМ на растворе Хенкса или Эрла
20-25 л
сыворотка крови крупного рогатого скота
1,25 л
7,5 %-ный раствор соды
1,0 л
расплодка клеток ВНК-21(с-13) с исходной концентрацией 4502-5 л
750 тыс. кл./мл
"посевной" вирус с титром инфекционной активности 7,0-9,0 lg
0,5-1,0 л
ТЦД50/мл
теотропин
25 г
адъювант Montanide ISA 206
25-30 л
Предварительно выращивают культуру клеток ВНК-21(с-13) и для снятия клеток отбирают роллеры с хорошо сформированным монослоем клеток без зернистости или спонтанной дегенерации (не более 48 ч роста). После удаления ростовой среды в каждый
7
BY 17118 C1 2013.06.30
роллер с культурой клеток вместимостью 2,0 л вносят рабочий раствор трипсин/версена,
снимают монослой клеток, ресуспензируют в свежеприготовленной ростовой среде ФГМС/ДМЕМ на растворе Хенкса или Эрла и переносят в биореактор для суспензионного выращивания. Методом продленного периодического культивирования с подпиткой культуры
клеток ВНК-21(с-13) свежей питательной средой в соответствующем объеме накапливают
биомассу клеток ВНК-21(с-13) до требуемого объема. Заражение "посевным вирусом" в
количестве 0,01-1,0 ТЦД50/кл проводят при концентрации клеток 0,8-2,5 млн. кл./мл, и
культивируют при температуре 36,9 ± 0,1 °С при вращении мешалки в пределах 60-120
об./мин в течение 18-36 ч, поддерживая pH на уровне 6,8-7,6. Через 18-36 ч культивирования производят слив вируссодержащей жидкости в роллерные сосуды.
Из каждого 20-го роллера делают высевы на проверку бактериальной и грибковой обсемененности, после этого их помещают при температуре минус 20-40 °С и сохраняют до
проведения титрования вируса.
Не ранее чем через 16-18 ч после замораживания 2-3 роллера с вируссодержащей
жидкостью оттаивают при комнатной температуре и содержимое их смешивают для приготовления объединенной пробы. Из полученной смеси берут пробу в количестве 5-10 мл
для титрования вируса путем заражения перевиваемой культуры клеток ВНК-21.
По результатам титрации, если значение титра инфекционной активности вируса составляет не менее 7 lg ТДЦ50/мл, проводят его инактивацию теотропином в концентрации
0,05-0,5 % при значении pH 7,2-8,6 при температуре 20-37 °С, времени экспозиции 18-30 ч.
Проинактивированвый вирусный материал проверяют на полноту инактивации методом 3-кратных последовательных пассажей в культуре клеток ВНК-21. При отсутствии
проявления цитопатического действия вируса на клетки, производят диспергирование
инактивированной теотропином вируссодержащей жидкости взятой из расчета 4060 мас. % с 60-40 мас. % масляного адъюванта Montanide ISA 206.
Таким образом, использование заявляемого маркированного штамма вируса болезни
Ауески "Suid herpesvirus" - КМИЭВ-V 106 A, обладающего высоким титром инфекционной активности - 7,0-9,0 lg ТЦД50/мл, при конструировании эмульсионной инактивированной вакцины и способ ее изготовления, включающий накопление вирусной биомассы
суспензионным методом в культуре клеток ВНК-21 с последующей инактивацией теотропином и смешиванием с масляным адъювантом ISA 206, позволяет изготовить высокоиммуногенную вакцину.
Источники информации:
1. Slivac I. et al. Aujeszkys disease virus production in disposable bioreactor / I.Slivac et al. //
J. Biociences - 2006. - V. 31. - No. 3. - P. 363-368.
2. Константинов А.В. Разработка способа получения вирусвакцины против болезни
Ауески свиней и овец из маркированного штамма "ВК", изучение ее иммунобиологических свойств: Автореф. дис. … канд. вет. наук ВНИИЗЖ. - Владимир, 2003. - 25 с. (прототип).
3. Summary of Product Characteristics // Intervet International B.V. [Электронный ресурс]. 2010. - Режим доступа: http://vmri.medagencies.org/spc.asp?Product_Identifier = BE/V/0013/001. Дата доступа: 21.06.2010.
4. Гусева М.Н. Иммунобиологические свойства инактивированной вакцины против
болезни ауески из штамма, делеционного по гликопротеину gE. Современные аспекты ветеринарной патологии животных. Материалы конф., посвященной 40-летию ВНИИЗЖ,
23-25 ноября 1998. - Владимир, 1998. - С.245-249 (прототип).
5. Гусева М.Н. Разработка технологии изготовления инактивированной вакцины против болезни ауески из штамма, делеционного по гликопротеину E: Автореф. дис. … канд.
биол. наук ВНИИЗЖ. - Владимир, 1999. - 23 с. (прототип).
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
8
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
139 Кб
Теги
патент, by17118
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа