close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Патент BY17123

код для вставкиСкачать
ОПИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ПАТЕНТУ
РЕСПУБЛИКА БЕЛАРУСЬ
(46) 2013.06.30
(12)
(51) МПК
НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР
ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ
СОБСТВЕННОСТИ
(54)
C 12Q 1/68
C 12Q 1/70
(2006.01)
(2006.01)
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРЕИМУЩЕСТВЕННЫХ
НАПРАВЛЕНИЙ МУТАГЕНЕЗА В ГЕНЕ ДНК- ИЛИ РНК-ВИРУСА,
ПОРАЖАЮЩЕГО ЧЕЛОВЕКА
(21) Номер заявки: a 20090672
(22) 2009.05.08
(43) 2010.12.30
(71) Заявитель: Учреждение образования
"Белорусский государственный медицинский университет" (BY)
(72) Авторы: Хрусталев Владислав Викторович; Самойлович Елена Олеговна; Ермолович Марина Анатольевна;
Семейко Галина Валерьевна (BY)
(73) Патентообладатель: Учреждение образования "Белорусский государственный
медицинский
университет" (BY)
BY 17123 C1 2013.06.30
BY (11) 17123
(13) C1
(19)
(56) KOZAL M.J. et al. Nature Medicine,
1996. - V. 2. – No. 7. - P. 753-759.
RU 2172015 C1, 2001.
БАРКОВСКИЙ Е.В. и др. Актуальные
вопросы молекулярной эволюции и
биохимии. Материалы Республиканской научной конференции, посвященной 75-летию со дня основания кафедры
общей химии БГМУ. - Минск, 2006. С. 27-30.
ХРУСТАЛЕВ В.В. и др. Медицинский
журнал. - 2006. - № 2. - С. 101-105.
ХРУСТАЛЕВ В.В. и др. Медицинский
журнал. - 2006. - № 4. - С. 99-103.
ХРУСТАЛЕВ В.В. и др. Медицинский
журнал. - 2007. - № 1. - С. 92-96.
БУТВИЛОВСКИЙ А.В. и др. Здравоохранение. - 2005. - № 6. - С. 37-39;
БУТВИЛОВСКИЙ А.В. и др. Здравоохранение. - 2005. - № 6. - С. 40-43.
(57)
Способ определения преимущественных направлений мутагенеза в гене ДНК- или
РНК-вируса, поражающего человека, заключающийся в том, что выделяют исследуемый
вирусный ген из образцов клинического материала от разных больных, проводят амплификацию нуклеотидных последовательностей, кодирующих исследуемый вирусный ген,
секвенируют полученные нуклеотидные последовательности, выравнивают их, рассчитывают процентное содержание нуклеотидов G, C, A и T для ДНК-вируса или G, C, A и U
для РНК-вируса в первом, втором и третьем положениях кодонов полученных нуклеотидных последовательностей, а также частоту встречаемости в сайтах Ps выровненных нуклеотидных последовательностей каждого из указанных нуклеотидов по формуле:
n ⋅ 100 %
Ps = s
N
где ns - количество выровненных нуклеотидных последовательностей, содержащих в сайте
данный нуклеотид;
N - количество выровненных нуклеотидных последовательностей,
на основании полученных значений Ps создают консенсусную нуклеотидную последовательность исследуемого вирусного гена, по отношению к консенсусной последовательности
рассчитывают количество сайтов, содержащих нуклеотидную замену, во всех выровненных
BY 17123 C1 2013.06.30
последовательностях в случае ДНК-вируса или количество выровненных последовательностей, содержащих нуклеотидную замену, в случае РНК-вируса и определяют, что мутагенез
исследуемого вирусного гена предпочтительно направлен на частую нуклеотидную замену
U на C или T на C, если установлено, что количество замен C на U и U на C или C на T
и T на C превышает количество замен G на A и A на G, а содержание C в третьих положениях кодонов выровненных нуклеотидных последовательностей более 25 %;
или C на U или C на T, если установлено, что количество замен C на U и U на C или C
на T и T на C превышает количество замен G на A и A на G, а содержание U или T в третьих положениях кодонов выровненных нуклеотидных последовательностей более 25 %;
или A на G, если установлено, что количество замен G на A и A на G превышает количество замен C на U и U на C или C на T и T на C, а содержание G в третьих положениях
кодонов выровненных нуклеотидных последовательностей более 25 %;
или G на A, если установлено, что количество замен G на A и A на G превышает количество замен C на U и U на C или C на T и T на C, а содержание A в третьих положениях
кодонов выровненных нуклеотидных последовательностей более 25 %;
или C на A, если количество этих замен или замен A на C превышает количество замен G на U и U на G или G на T и T на G;
или G на U или G на T, если количество этих замен G на U и U на G или замен G на T
и T на G превышает количество замен C на A и A на C.
Изобретение относится к медицине, а именно к медицинской вирусологии и молекулярной биологии, может быть использовано для определения механизма мутагенеза в генах вирусов, поражающих человека, с целью последующего использования полученных
данных для выделения наименее мутабельных иммуногенных фрагментов белков или
предотвращения гипермутабельности вирусов.
Известен способ определения точечных нуклеотидных замен в ДНК микобактерий [1].
С помощью данного способа можно определить наличие определенного числа нуклеотидных мутаций во фрагменте гена rpoB (ДНК-зависимой РНК-полимеразы) микобактерии
туберкулеза, предположить их направление и механизм. Способ основан на амплификации фрагмента гена rpoB изучаемого штамма микобактерии туберкулеза с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующей гибридизацией амплифицированной
ДНК на биочипе, содержащем определенный набор олигонуклеотидов, с которыми может
происходить комплементарное связывание образца. Факт комплементарного связывания
амплифицированного фрагмента изучаемого гена с каким-либо олигонуклеотидом распознается по изменению флуоресценции.
Основным недостатком данного способа является то, что набор нуклеотидных мутаций, которые он позволяет выявить, ограничен. Кроме того, он может быть применен исключительно к фрагменту гена rpoB микобактерии туберкулеза. Судить о направлении и
механизме мутации можно путем сопоставления собственных данных с последовательностью гена, принятой за "исходную", что не всегда соответствует действительности.
Наиболее близким способом, принятым за прототип, является способ выявления мутаций при помощи гибридизации на олигонуклеотидных микроматрицах [2]. Сущность
способа заключается в том, что производят выделение нуклеотидных последовательностей исследуемого вирусного гена из образцов клинического материала, который подвергается амплификации при помощи ПЦР, а затем происходит фрагментация (случайным
образом ДНК нарезается на участки одинаковой длины). После этого полученный набор
участков ДНК связывается с меченными флуоресцентными зондами олигонуклеотидными
последовательностями, закрепленными на специальной микроматрице. На матрице должны присутствовать все возможные комбинации из восьми нуклеотидов (всего 65 536 олигонуклеотидов). Комплементарное связывание одного из участков изучаемого гена с
каким-либо олигонуклеотидом распознается по изменению флюоресценции. Получение
2
BY 17123 C1 2013.06.30
данных о мутагенезе исследуемого вируса производят путем сравнения с последовательностью гена, принятой за "исходную".
Известный способ имеет ряд недостатков. В результате анализа участка гена env, кодирующего протеазу (297 нуклеотидов длиной), 114 штаммов ВИЧ1 с помощью гибридизации на олигонуклеотидной микроматрице было выявлено 98,26 % мутаций, по
сравнению с результатами прямого секвенирования. Чем длиннее анализируемый участок
гена, тем ниже процент выявления мутаций в нем данным методом (для последовательности длиной 5 400 нуклеотидов - только 74 %). На качестве анализа также отрицательно
сказывается наличие прямых и инвертированных повторяющихся последовательностей в
изучаемом фрагменте ДНК или РНК (образуются вторичные структуры, препятствующие
связыванию с олигонуклеотидами). Всех этих недостатков можно избежать при использовании прямого секвенирования для последующего анализа механизмов и направлений мутаций в вирусных генах. Кроме того, для анализа путем гибридизации на олигонуклеотидной микроматрице какой-либо вариант вирусного гена необходимо принимать
за "исходный", чтобы по отношению к нему определять направление мутации. В предложенном нами способе этот недостаток устраняется путем создания консенсусной последовательности по результатам секвенирования определенного количества (более двух)
последовательностей.
Задачей заявляемого способа является увеличение точности выявления мутации в вирусных генах, повышение эффективности анализа их количества и направления, а следовательно, определение наиболее вероятного биохимического механизма, вызывающего их.
Поставленная задача достигается с помощью предлагаемого способа определения
преимущественных направлений мутагенеза в гене ДНК- или РНК-вируса, поражающего
человека, заключающегося в том, что выделяют исследуемый вирусный ген из образцов
клинического материала от разных больных, проводят амплификацию нуклеотидных последовательностей, кодирующих исследуемый вирусный ген, секвенируют полученные
нуклеотидные последовательности, выравнивают их, рассчитывают процентное содержание нуклеогидов G, C, A и T для ДНК-вируса или G, C, A и U для РНК-вируса в первом,
втором и третьем положениях кодонов полученных нуклеотидных последовательностей, а
также частоту встречаемости в сайтах Ps выровненных нуклеотидных последовательностей каждого из указанных нуклеотидов по формуле:
n ⋅ 100 %
Ps = s
,
N
где ns - количество выровненных нуклеотидных последовательностей, содержащих в сайте
данный нуклеотид;
N - количество выровненных нуклеотидных последовательностей,
на основании полученных значений Ps создают консенсусную нуклеотидную последовательность исследуемого вирусного гена, по отношению к консенсусной последовательности
рассчитывают количество сайтов, содержащих нуклеотидную замену, во всех выровненных
последовательностях в случае ДНК-вируса или количество выровненных последовательностей, содержащих нуклеотидную замену, в случае РНК-вируса и определяют, что мутагенез
исследуемого вирусного гена предпочтительно направлен на частую нуклеотидную замену
U на C или T на C, если установлено, что количество замен C на U и U на C или C на T
и T на C превышает количество замен G на A и A на G, а содержание C в третьих положениях кодонов выровненных нуклеотидных последовательностей более 25 %;
или C на U или C на T, если установлено, что количество замен C на U и U на C или C
на T и T на C превышает количество замен G на A и A на G, а содержание U или T в третьих положениях кодонов выровненных нуклеотидных последовательностей более 25 %;
или A на G, если установлено, что количество замен G на A и A на G превышает количество замен C на U и U на C или C на T и T на C, а содержание G в третьих положениях
кодонов выровненных нуклеотидных последовательностей более 25 %;
3
BY 17123 C1 2013.06.30
или G на A, если установлено, что количество замен G на A и A на G превышает количество замен C на U и U на C или C на T и T на C, а содержание A в третьих положениях
кодонов выровненных нуклеотидных последовательностей более 25 %;
или C на A, если количество этих замен или замен A на C превышает количество замен G на U и U на G или G на T и T на G;
или G на U или G на T, если количество этих замен G на U и U на G или замен G на T
и T на G превышает количество замен C на A и A на C.
Пример 1.
Определение основных механизмов мутагенеза вируса краснухи.
Для выделения вируса краснухи использовали носоглоточные мазки и пробы мочи от
больных краснухой, чей диагноз подтвержден лабораторно путем выявления в сыворотке
крови специфических IgM-антител к вирусу краснухи в иммуноферментной тест-системе
производства Dade-Behring (Германия). Носоглоточные мазки и пробы мочи были собраны в течение 2004-2006 гг. у больных, проживающих в Минске, Минской области, Витебске и Могилеве. Изоляцию вируса проводили в перевиваемой культуре клеток Vero.
Вирусную РНК экстрагировали из 140 мкл вируссодержащей культуральной жидкости
с использованием набора QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen, Нидерланды) согласно инструкции производителя. Обратную транскрипцию проводили в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл обратной транскриптазы SuperScript™ III (200 ед.), 0,5 мкл
ингибитора рибонуклеаз RNaseOUT™ (20 ед.), 2 мкл 0,1 M DTT, 4 мкл 5x буфера, 1 мкл
10 мМ смеси дНТФ (Inivitrogen, Бельгия), 5 мкл 0,03 мкг/мкл универсальных гексамеров
(Invitrogen, Бельгия), 1,5 мкл воды и 5 мкл выделенной РНК. Начальную денатурацию выполняли при 65 °С в течение 5 мин при отсутствии ферментов, реакцию обратной транскрипции - 80 мин при 55 °С и 15 мин при 70 °С. С целью амплификации E-гена использовали праймеры производства "Eurogentec" (Бельгия). Концентрация всех праймеров
составляла 40 мкМ. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 0,1 мкл
ДНК полимеразы Platinum® Taq (5 ед.), 0,5 мкл 10 мМ смеси дНТФ, 2,5 мкл 10x буфера,
1 мкл 50 мМ MgCl2 (Invitrogen, Бельгия), по 0,25 мкл каждого из праймеров, 15,4 мкл воды
и 5 мкл ДНК, комплементарной вирусной РНК (кДНК). Реакцию проводили в следующих
условиях: начальная денатурация кДНК - 94 °С (3 мин), 40 циклов амплификации, включающих денатурацию - 94 °С (30 с), отжиг праймеров - 61 °С (30 с), элонгацию - 72 °С
(45 с). В последнем цикле амплификации элонгацию проводили в течение 5 мин. Для повышения чувствительности реакции 1 мкл смеси, после первого раунда ПЦР, использовали для постановки гнездовой ПЦР. Амплификацию проводили аналогичным образом.
Синтез ПЦР-продуктов анализировали методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле в
трис-ацетатном буфере с добавлением бромистого этидия (Invitrogen, Бельгия).
Перед проведением секвенирования полученные фрагменты ДНК очищали из смеси с
использованием набора Jet quick PCR Purification Spin Kit (Genomed, Германия) или из геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Нидерланды). Секвенирование
нуклеотидных последовательностей проводили с использованием набора Big Dye Terminator v.3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Нидерланды) на капиллярном секвенаторе Avant 3100 (Applied Biosystems, Нидерланды).
Были просеквенированы 28 нуклеотидных последовательностей. Для 13 штаммов вируса краснухи определены нуклеотидные последовательности полноразмерного E1-гена
(длиной 1443 нуклеотида), кодирующего поверхностный гликопротеин, еще для 15 штаммов просеквенирован фрагмент E1-гена (длиной 739 нуклеотидов).
Нуклеотидные последовательности вируса краснухи обогащены цитозином в третьих
положениях кодонов (содержание цитозина в третьих положениях кодонов варьируется от
48,6 до 51,6 %).
Полученные нуклеотидные последовательности обеднены аденином и урацилом в третьих положениях кодонов (частоты использования данных нуклеотидов варьировались от
4
BY 17123 C1 2013.06.30
6,5 до 7,3 и от 12,6 до 16,4 % соответственно). Уровень гуанина в третьих положениях кодонов был ниже уровня цитозина (от 28,5 до 32,0 %). Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что в геноме вируса краснухи, представленном одноцепочечной "+" РНК,
существует C-давление: преобладают замены, повышающие содержание цитозина [1, 2].
Пример расчета процентного содержания цитозина в сайте № 513 (фигура) выровненных последовательностей по формуле 2:
n ⋅100% 18 ⋅100%
PC = C
= 64,29%
=
N
28
В каждом сайте выровненных последовательностей [5, 6] проверялось следующее
условие: нуклеотид, находящийся в данном сайте консенсусной последовательности должен быть C. Далее производился подсчет последовательностей, в данном сайте которых
находится U. В конечном итоге было вычислено количество замен C на U для всех сайтов,
в консенсусной последовательности которых находится C. Например, в сайте № 513 консенсусной последовательности (фигура) находится C, количество последовательностей,
содержащих в данном сайте U, составляет 10. В сайте № 531 консенсусной последовательности (фигура) находится C, количество последовательностей, содержащих в данном
сайте U, составляет 5. Количество замен C на U для этих двух сайтов равно 15. Количество замен C на U для всех сайтов равно 224. Количество замен U на C равно 167. Поскольку уровень 3C составляет примерно 50 %, логично предположить, что в
действительности большая часть таких замен имела направление U на C, но частоты какой-то части из них в общей популяции достигли уровня выше 50 %, из-за чего при определении направления замены от консенсусной последовательности им было приписано
противоположное направление. На втором месте по частоте - замены G на A (64 замены) и
A на G (47 замен). Поскольку уровень использования гуанина в третьих положениях кодонов превышает 25 %, следует признать, что вторым наиболее вероятным механизмом
мутаций в генах вируса краснухи являются транзиций A на G. Наиболее вероятным активным механизмом и тех и других транзиции является дезаминирование аденина с образованием инозина, который комплементарен цитозину, а не урацилу. Замены U на C
происходят за счет дезаминирования аденина на РНК "–" цепи вируса.
Количество трансверсий было значительно ниже, чем количество транзиций. Тем не
менее, судя по соотношению количества трансверсий разных типов (A↔C/U↔G = 0,741),
гуанин несколько чаще окисляется на РНК "+" цепи вируса.
Мутагенез вируса краснухи можно охарактеризовать следующим образом. Наиболее
частым механизмом мутаций является дезаминирование аденина, которое вызывается
клеточными РНК-редактирующими ферментами из семейства ADAR. Дезаминирование
аденина происходит чаще на РНК "–" цепи вируса, в отличие от окисления гуанина, которое чаще происходит на РНК "+" цепи. Этими двумя обстоятельствами можно объяснить
тот факт, что частота использования цитозина в геномной РНК "+" цепи выше частоты
использования гуанина.
Пример 2.
Определение основных механизмов мутагенеза парвовируса B19.
Геном парвовируса B19 представлен одноцепочечной ДНК. Материалом для получения
ДНК парвовируса B19 служили сыворотки крови больных с парвовирусной инфекцией,
проживающих в г. Минске, Минской, Брестской, Витебской, Могилевской, Гродненской и
Гомельской областях, собранные в течение 2006-2007 гг. Вирусную ДНК выделяли из
200 мкл сыворотки крови с помощью набора QIAamp DNA Blood Mini Kit (Нидерланды)
согласно инструкции производителя. Амплификацию фрагмента ДНК, кодирующего
NS1/VP1u область генома (длиной 994 нуклеотида), проводили методом гнездовой ПЦР.
Для первого раунда использовали праймеры e1855f и B19-R1, для второго - e1863f и B19R2 концентрацией 20 мкМ. Объем реакционной смеси составлял 25 мкл, содержащей
0,1 мкл ДНК полимеразы Platinum® Taq (5 ед.), 0,5 мкл 10 мМ смеси дНТФ, 2,5 мкл 10x
5
BY 17123 C1 2013.06.30
буфера, 1 мкл 50 мМ MgCl2 (Invitrogen, Бельгия), по 1 мкл каждого из праймеров, 13,9 мкл
воды и 5 мкл выделенной ДНК. Реакцию проводили в следующих условиях: начальная
денатурация - 5 мин при 94 °С, затем 40 циклов амплификации: 30 с при 94 °С, 30 с при
55 °С и 1 мин 30 с при 72 °С, завершающая элонгация - 5 мин при 72 °С. Для второго раунда ПЦР использовали 0,5 мкл продукта, полученного в первом раунде реакции. Амплификацию проводили аналогично, повысив температуру отжига праймеров до 58 °С.
Синтез ПЦР-продуктов анализировали методом электрофореза в 1,5 % агарозном геле в
1xTAE буфере.
Перед проведением секвенирования полученные фрагменты ДНК очищали из смеси с
использованием набора Jet quick PCR Purification Spin Kit (Genomed, Германия) или из геля с помощью набора QIAquick Gel Extraction kit (Qiagen, Нидерланды). Секвенирование
нуклеотидных последовательностей проводили с использованием набора Big Dye Terminator v.3.1 cycle sequencing kit (Applied Biosystems, Нидерланды) на капиллярном секвенаторе Avant 3100 (Applied Biosystems, Нидерланды).
Были определены нуклеотидные последовательности NS1/VP1 области генома
92 штаммов парвовируса B19, однако для данного исследования использован фрагмент
гена (длиной 486 нуклеотидов), кодирующего структурный белок VP1.
Ниже приведены результаты расчета частот использования нуклеотидов в третьих положениях кодонов:
C - от 15,4 до 16,6 %;
G - от 11,8 до 13,0 %;
T - от 42,0 до 40,7 %;
A - от 30,5 до 30,2 %.
Общее количество нуклеотидных замен от консенсусной последовательности, установленной на основании расчетов по формуле, составило 31.
Определение количества сайтов, содержащих замену G на A, проходило при соблюдении следующих условий: в данном сайте консенсусной последовательности должен находиться G, хотя бы в одной последовательности в данном сайте должен находиться A. В
изученной выборке A присутствовал в девяти сайтах, в консенсусной последовательности
которых находился G: в сайтах № 10, 17, 28, 34, 72, 82, 87, 181, 337. Это говорит о том, что
в выборке нуклеотидных последовательностей, кодирующих фрагмент VP1 парвовируса
B19, было 9 замен G на A. Замен C на T было 6. Количество замен противоположных
направлений было ниже: 7 замен A на G и 4 замены T на C. Поскольку частоты использования как тимина, так и аденина в третьих положениях кодонов превышают 25 %, во
фрагменте гена VP1 парвовируса B19 преобладают транзиции G на A и C на T. Общее количество трансверсий (5 замен) было чрезвычайно низким.
Мутагенез парвовируса B19, геном которого представлен одноцепочечной ДНК, можно охарактеризовать следующим образом. Наиболее частый механизм возникновения мутаций - дезаминирование цитозина, происходящее на обеих цепях ДНК, приводящее к
транзициям G на A и C на T. Дезаминирование цитозина, как правило, вызывается ферментами из суперсемейства APOBEC.
Предложенный способ позволяет повысить точность выявления мутаций в вирусных
генах и эффективно производить анализ их количества и направления с целью установления наиболее вероятной биохимической причины мутаций в генах определенного вида
вирусов; сведения, полученные данным способом, могут быть использованы для борьбы с
вирусными заболеваниями с учетом данных о механизмах гипермутабельности вирусов.
Источники информации:
1. RU 217201501, C1 2001.
2. KOZAL M.J. et at Nature Medicine. - 1996. - V.2. - No. 7. - P. 753-759.
6
BY 17123 C1 2013.06.30
Фрагмент массива выровненных последовательностей и консенсусной последовательности, в каждом сайте которой находится нуклеотид, частота использования которого в
данном сайте массива выровненных последовательностей является наибольшей.
Национальный центр интеллектуальной собственности.
220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.
7
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
379 Кб
Теги
by17123, патент
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа